多指標綜合評分法優(yōu)選芩蒿滴鼻劑提取工藝

毛艷　陳振東　顧政一　賀金華　蔡曉翠　劉燕

摘要：目的 探討多指標綜合評分法優(yōu)選芩蒿滴鼻劑的提取工藝。方法 采用L9（34）正交設(shè)計，以一枝蒿酮酸、綠原酸、鹽酸偽麻黃堿、總黃酮含量及出膏率的綜合評分為考察指標，優(yōu)選芩蒿滴鼻劑的提取工藝。結(jié)果 最佳提取工藝為：用60%乙醇溶液，加12倍量，提取3次。結(jié)論 本研究優(yōu)選出的提取工藝簡單、可行，適合大生產(chǎn)需要，可作為該制劑合理開發(fā)的依據(jù)。

關(guān)鍵詞：芩蒿滴鼻劑；提取工藝；正交試驗；一枝蒿酮酸；綠原酸；鹽酸偽麻黃堿；總黃酮

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.04.017

中圖分類號：R283.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）04-0082-05

Abstract： Objective To optimize extraction process of Qinhao Nasal Drops by multi-index comprehensive evaluation Method. Methods With L9（34） orthogonal design， the content of rupestonic acid， chlorogenic acid， pseudoephedrine hydrochloride， total flavonoids and extract yield were set as indexes， and extraction technology of Qinhao Nasal Drops was optimized. Results Optimum extraction technology was： 12 times amount of 60% ethanol， extracted three times. Conclusion The optimized extraction technology is simple， practical， and adapt to the production needs， which can be used as the basis for reasonable development of the preparation.

Keywords： Qinhao Nasal Drops； extraction process； orthogonal test； rupestonic acid； chlorogenic acid； pseudoephedrine hydrochloride； total flavonoids

芩蒿滴鼻劑由維吾爾藥新疆一枝蒿、蒼耳子、麻黃等7味藥組成，為新疆經(jīng)典驗方制劑，具有清熱解毒、宣肺平喘、抗炎、抗過敏、通鼻竅等功效，用于治療急、慢性鼻炎及過敏性鼻炎。方中君藥新疆一枝蒿具有抗炎、抗過敏、祛風解毒等功效[1-3]，目前研究中多將倍半萜類化合物一枝蒿酮酸作為質(zhì)量控制的一個重要指標?，F(xiàn)代藥理學研究表明，蒼耳子中的酚酸類化合物綠原酸具有抗炎和鎮(zhèn)痛等藥理作用[4-5]。麻黃中麻黃堿及偽麻黃堿的含量最高，研究表明，鹽酸偽麻黃堿可選擇性地收縮上呼吸道毛細血管，消除鼻咽部黏膜充血、腫脹、減輕鼻塞等癥狀。此外，新疆一枝蒿、蒼耳子和麻黃中均含有黃酮類化合物[6-8]，此類化合物具有抗菌、抗過敏、抗炎和抗病毒等多種生物活性及藥理作用，因其功效與本研究的方向相關(guān)，故將總黃酮作為一項檢測指標納入研究。鑒于出膏率常作為中藥復方提取效果的評價指標，本研究將上述4種成分的含量與出膏率作為檢測指標，采用L9（34）正交試驗法優(yōu)選芩蒿滴鼻劑的提取工藝，為芩蒿滴鼻劑的后續(xù)研究及開發(fā)提供參考。

1 儀器與試藥

DZTW型調(diào)溫電熱套（北京市永光明醫(yī)療儀器廠），DT500A型電子計數(shù)天平（常熟市金羊砝碼儀器有限公司，d=0.01 g），CPA-225D型電子天平（德國Sartorius，d=0.01 mg），UltiMate 3000系列高效液相色譜儀，包括二極管陣列檢測器、四元梯度泵、在線脫氣機、自動進樣器、柱溫箱和4～40 ℃恒溫箱（美國Thermo Scientific Technologies公司）。

綠原酸對照品（批號110753-201415，純度96.2%），鹽酸偽麻黃堿對照品（批號171237-201510，純度99.8%），蘆丁對照品（批號100080-201610，純度92.6%），中國食品藥品檢定研究院；一枝蒿酮酸對照品（批號115473-63-7，純度>98%），中國科學院新疆理化所；白芷、蒼耳子、麻黃，購于安徽省亳州市華云在中藥飲片有限公司，經(jīng)新疆藥物研究所何江副研究員鑒定，分別為傘形科植物白芷Angelica dahurica（Fisch.ex Hoffm.）Benth.Et Hook.f的干燥根、菊科植物蒼耳Xanthium sibicum Patr.的干燥成熟帶總苞的果實、麻黃科植物草麻黃Ephedra sinica Stapf的干燥草質(zhì)莖，均符合2015年版《中華人民共和國藥典》（一部）各藥項下有關(guān)規(guī)定[9]。新疆一枝蒿購于新疆銀朵蘭維藥股份有限公司，經(jīng)新疆藥物研究所何江副研究員鑒定為菊科植物一枝蒿Artemisia rupestris L.的干燥全草，符合《新疆維吾爾自治區(qū)中藥維吾爾藥飲片炮制規(guī)范》有關(guān)規(guī)定[10]。乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

按處方比例稱取各藥約50 g，共9份，按正交設(shè)計表中方案用60%乙醇溶液加熱回流提取，提取液過濾，用相應溶劑定容至2 L，搖勻，即得。

2.2 對照品溶液的制備

2.2.1 綠原酸對照品溶液

精密稱取綠原酸對照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.380 57 mg的溶液，即得。

2.2.2 一枝蒿酮酸對照品溶液

精密稱取一枝蒿酮酸對照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.454 mg的溶液，即得。

2.2.3 鹽酸偽麻黃堿對照品溶液

精密稱取鹽酸偽麻黃堿對照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.293 8 mg的溶液，即得。

2.2.4 蘆丁對照品溶液

精密稱取蘆丁對照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.203 6 mg的溶液，即得。

2.3 綠原酸、一枝蒿酮酸和鹽酸偽麻黃堿含量測定

2.3.1 色譜條件的建立

色譜柱：Phenmomenex synergiTM（250 mm×4.6 mm，4 μm）；流動相：A為乙腈，B為0.092%磷酸溶液（含0.04%三乙胺和0.02%二正丁胺），梯度洗脫（0～10 min，99%B；10～10.5 min，99%～91%B；10.5～28 min，91%B；28～28.5 min，91%～75%B；28.5～51 min，75%～64%B；51～53 min，64%B；53～53.5 min，64%～25%B；53.5～57.5 min，25%B；57.5～58 min，25%～99%B；58～68 min，99%B）；流速：1 mL/min；進樣量：10 μL；檢測波長：211 nm（鹽酸偽麻黃堿），243 nm（一枝蒿酮酸），329 nm（綠原酸）。色譜圖見圖1。

2.3.2 線性關(guān)系考察

分別精密量取0.1、0.2、0.4、0.6、1、2 mL一枝蒿酮酸對照品溶液于5 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取上述溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，進行線性回歸，得回歸方程Y=592.17X-0.019 1，r=0.999 9，表明一枝蒿酮酸在0.009 1～0.181 6 mg/mL范圍內(nèi)線性良好。

分別精密量取0.2、0.6、1、3、4、6 mL綠原酸對照品溶液于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取上述溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，進行線性回歸，得回歸方程Y=537.95X+0.174，r=0.999 9，表明綠原酸在0.007 6～0.228 3 mg/mL范圍內(nèi)線性良好。

分別精密量取0.1、0.2、0.6、1、1.5、3 mL鹽酸偽麻黃堿對照品溶液于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取上述溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，進行線性回歸，得回歸方程Y=316.84X+0.196 4，r=0.999 8，表明鹽酸偽麻黃堿在0.002 9～0.088 1 mg/mL范圍內(nèi)線性良好。

2.3.3 精密度試驗

取同一供試品溶液，連續(xù)進樣6次，按“2.3.1”項下色譜條件測定，記錄色譜峰面積，結(jié)果綠原酸、一枝蒿酮酸、鹽酸偽麻黃堿的峰面積RSD分別為0.56%、0.72%、1.24%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，分別于0、2、6、8、12、24 h測定，按“2.3.1”項下色譜條件測定，記錄色譜峰面積并計算含量，結(jié)果綠原酸、一枝蒿酮酸、鹽酸偽麻黃堿的峰面積RSD分別為0.56%、0.94%、1.28%，其峰形和含量變化不大，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 重復性試驗

取樣品6份，精密稱定，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件測定，記錄色譜峰面積并計算含量，結(jié)果綠原酸、一枝蒿酮酸、鹽酸偽麻黃堿的含量RSD分別為0.96%、1.02%、1.42%，表明該方法重復性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗

稱取處方藥材約25 g，共6份，分別按100%濃度比例加入各對照品溶液，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件測定，結(jié)果綠原酸、一枝蒿酮酸、鹽酸偽麻黃堿的平均回收率分別為99.92%、98.27%、97.83%，RSD分別為0.85%、1.13%、1.71%。

2.4 總黃酮含量測定

2.4.1 線性關(guān)系考察

分別精密量取1.5、2、3、4、5、6 mL蘆丁對照品溶液于25 mL量瓶中，各加水至6 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加氫氧化鈉試液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，以相應試劑為空白，用紫外-可見分光光度法[2015年版《中華人民共和國藥典》（四部）附錄ⅤA]，于512 nm波長處測定吸光度[9]，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，進行線性回歸，得回歸方程Y=0.013 6X-0.010 6，r=1，表明蘆丁在12.216～48.864 μg/mL范圍內(nèi)線性良好。

2.4.2 樣品測定方法

精密量取“2.1”項下供試品溶液2 mL，置25 mL量瓶中，按“2.4.1”項下方法，自“加水至6 mL”起依法測定吸光度，從標準曲線上讀出供試品溶液中蘆丁的質(zhì)量，計算，即得。

2.4.3 精密度試驗

取同一供試品溶液，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，結(jié)果總黃酮的峰面積RSD=1.17%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，分別于0、2、6、8、12、24 h測定，記錄峰面積并計算含量，結(jié)果總黃酮的峰面積RSD=1.12%，其峰形和含量變化不大，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 重復性試驗

取樣品6份，精密稱定，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.4.2”項下方法進行測定，記錄峰面積并計算含量，結(jié)果總黃酮含量RSD=1.35%，表明該方法重復性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗

稱取處方藥材約25 g，共6份，分別按100%濃度比例加入蘆丁對照品溶液，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.4.2”項下方法進行測定，測得總黃酮的平均回收率為98.56%，RSD=1.49%。

2.5 出膏率測定

精密吸取“2.1”項下提取液50 mL，置已恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速稱重，計算出膏率。出膏率（%）=

[（W-W1）×V÷（M×50）]×100%。式中，W1為蒸發(fā)皿質(zhì)量，W為浸膏與蒸發(fā)皿總質(zhì)量，V為提取液體積，M為稱樣量。

2.6 提取工藝條件考察

2.6.1 試驗設(shè)計

采用L9（34）正交試驗法，在單因素優(yōu)選的基礎(chǔ)上，根據(jù)影響一枝蒿酮酸、綠原酸、鹽酸偽麻黃堿和總黃酮含量及出膏率的主要因素，選取提取次數(shù)（A）、加醇量（B）、提取時間（C）作為考察因素，各因素選取3個水平，正交試驗方案見表1。

2.6.2 試驗安排與結(jié)果

按處方比例稱取各藥材，按表2安排進行提取，過濾，濾液加相應溶劑稀釋至2 L，搖勻，備用。取醇提液適量，分別測定一枝蒿酮酸、綠原酸、鹽酸偽麻黃堿和總黃酮含量及浸膏得率，采用綜合評分法對結(jié)果進行方差分析。綜合評分=一枝蒿酮酸含量÷一枝蒿酮酸最大含量×0.2+綠原酸含量÷綠原酸最大含量×0.3+鹽酸偽麻黃堿含量÷鹽酸偽麻黃堿最大含量×0.2+總黃酮含量÷總黃酮最大含量×0.2+出膏率÷最大出膏率×0.1。直觀分析見表2，方差分析見表3。

由直觀分析可知，三因素的主次順序為A>C>B。由方差分析可以看出，A因素對其提取率有顯著影響（P<0.01），B因素和C因素對提取率無顯著影響（P>0.05）。

結(jié)合生產(chǎn)實際和吸水率結(jié)果，從節(jié)能省時的角度考慮，最終確定最佳提取工藝條件為A3B1C1，即處方比例藥材加60%乙醇加熱回流提取3次，第1次12倍量，第2、3次各10倍量，每次1 h。

2.7 驗證試驗

按處方比例稱取藥材3份，按上述最佳提取工藝條件平行制備3份樣品，測定指標成分含量，結(jié)果見表4。測定結(jié)果與正交試驗結(jié)果接近，表明該工藝穩(wěn)定可靠。

3 討論

3.1 色譜條件選擇

采用HPLC測定綠原酸、一枝蒿酮酸、鹽酸偽麻黃堿含量時，嘗試了多種色譜系統(tǒng)，曾采用甲醇（A）- 0.2%磷酸水溶液（B）梯度洗脫同時測定綠原酸、一枝蒿酮酸、鹽酸偽麻黃堿，但圖譜中僅綠原酸和一枝蒿酮酸出峰，而鹽酸偽麻黃堿未出峰，因此改用乙腈-0.092%磷酸溶液（含0.04%三乙胺和0.02%二正丁胺）系統(tǒng)進行測定。由圖1可知，綠原酸、一枝蒿酮酸和鹽酸偽麻黃堿的峰形對稱，分離度佳。最終選用此流動相測定復方芩蒿滴鼻劑中綠原酸、一枝蒿酮酸和鹽酸偽麻黃堿的含量，其優(yōu)勢突出，用同一種流動相在不同波長處可同時測定綠原酸、一枝蒿酮酸、鹽酸偽麻黃堿的含量，操作簡便、重復性好、節(jié)省大量實驗時間。

3.2 乙醇濃度考察

本課題組采用單因素試驗對提取工藝中的乙醇濃度（0%、20%、40%、60%、80%、95%）進行考察，分別以綠原酸、一枝蒿酮酸、鹽酸偽麻黃堿、總黃酮含量和出膏率為指標，綜合考察其提取工藝，結(jié)果見表5。綜合各考察指標結(jié)果，最終選定60%乙醇為提取溶媒。

3.3 綜合評分加權(quán)系數(shù)的確定

由于組成復方的藥味較多且成分復雜、指標成分多，對于復方的提取工藝而言，選擇合適的指標成分尤為重要。本研究根據(jù)芩蒿滴鼻劑對治療急、慢性及過敏性鼻炎的活性成分重要程度，確定5項指標的優(yōu)先順序為：綠原酸>一枝蒿酮酸=鹽酸偽麻黃堿=總黃酮>干浸膏。采用綜合評分法對各成分進行系數(shù)加權(quán)，以加權(quán)后的綜合評分為因變量，不僅能全面反映各味藥在整體制劑中的作用，也能直觀地反映整體提取工藝。

3.4 工藝參數(shù)的確定

本試驗以綠原酸、一枝蒿酮酸、鹽酸偽麻黃堿、總黃酮含量和出膏率為考察指標，優(yōu)選出芩蒿滴鼻劑的最佳提取工藝：用60%乙醇加熱回流提取3次，第1次12倍量，第2、3次10倍量，每次1 h。驗證試驗結(jié)果表明，優(yōu)選出的工藝重現(xiàn)性好，工藝穩(wěn)定可靠，適合大生產(chǎn)需要，可作為該制劑合理開發(fā)的依據(jù)。

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（收稿日期：2017-10-05）

（修回日期：2017-10-30；編輯：陳靜）