高烏頭不同溶劑萃取部分對(duì)小鼠的急性毒性研究

張立軍　李蕓　張艷霞　楊志軍　馬駿　戴海蓉

摘要：目的 比較高烏頭不同溶劑萃取部分的急性毒性大小，篩選高烏頭的毒性部位，為闡明高烏頭的毒性成分提供依據(jù)。方法 采用系統(tǒng)溶劑法對(duì)高烏頭95%乙醇提取物進(jìn)行萃取，依次得到石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇和水提6個(gè)不同的溶劑萃取部分，通過(guò)半數(shù)致死量（LD50）和最大給藥量法對(duì)高烏頭不同溶劑萃取部分的急性毒性進(jìn)行比較研究。結(jié)果 高烏頭三氯甲烷、水提及正丁醇部分LD50分別為89.65、1805.40、24 409.41 mg/kg，95%可信區(qū)間分別為76.39～108.41、1521.60～2240.00、20 422.54～24 246.95；高烏頭石油醚、乙酸乙酯及乙醇部分最大給藥量分別為2686.01、3108.13、28 376.21 mg/kg。結(jié)論 高烏頭三氯甲烷部分毒性最大，乙醇部分毒性最小。

關(guān)鍵詞：高烏頭；不同溶劑萃取部分；急性毒性；半數(shù)致死量；最大給藥量；小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.03.012

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2018）03-0053-05

Abstract： Objective To compare the toxicity of different extraction parts of Aconitum sinomontanum Nakai； To screen out “toxic sections” of Aconitum sinomontanum Nakai； To provide references for further study on toxicity components of Aconitum sinomontanum Nakai. Methods Systematic solvent method was used to extract the 95% ethanol extracts of Aconitum sinomontanum Nakai， and six different extraction fractions （petroleum ether， chloroform， ethyl acetate， butanol， alcohol and water） were obtained. Median lethal dose （LD50） and maximum dose method were used to conduct comparative study on acute toxicity of different extraction parts of Aconitum sinomontanum Nakai. Results Chloroform， water and butanol extractions in LD50 of Aconitum sinomontanum Nakai were 89.65， 1805.40 and 24 409.41 mg/kg， and 95% confidence limits were 76.39～108.41， 1521.60～2240.00 and 20 422.54～24 246.95， respectively. The maximum dose of petroleum ether， ethyl acetate and alcohol extractions were 2686.01， 3108.13 and 28 376.21 mg/kg， respectively. Conclusion The maximum toxicity is the extracted section of chloroform， and the minimal toxicity is the extracted section of ethanol.

Keywords： Aconitum sinomontanum Nakai； different extraction parts； acute toxicity； LD50； maximum dose；mice

高烏頭為毛茛科烏頭屬植物高烏頭Aconitum sinomontanum Nakai的根，又名麻布七、辮子七、破骨七等，是我國(guó)中西部地區(qū)民間習(xí)用中藥，也是著名“七藥”之一，具有祛風(fēng)除濕、理氣止痛、活血散瘀的功效，用于治療風(fēng)濕痹痛、關(guān)節(jié)腫痛、跌打勞傷等，現(xiàn)收載于2009年版《甘肅省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》[1]。現(xiàn)代藥理研究表明，高烏頭具有鎮(zhèn)痛、抗炎、解熱、局麻等廣泛的藥理作用[2-3]，臨床上常用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及局部鎮(zhèn)痛[4-5]，高烏頭中主要活性成分為二萜生物堿，其中以高烏甲素和冉烏頭堿含量最高[6-7]，而活性成分之一高烏甲素已開發(fā)出不同劑型應(yīng)用于臨床[8]，也有不良反應(yīng)案例報(bào)道[9]，其原因是高烏頭毒性較強(qiáng)[10]，而其毒性機(jī)制尚不清楚，使其臨床應(yīng)用受限。本實(shí)驗(yàn)先用系統(tǒng)溶劑法得到高烏頭不同溶劑萃取部分，為進(jìn)一步明確高烏頭的毒性部位，再用急性毒性試驗(yàn)方法對(duì)高烏頭不同溶劑萃取部分進(jìn)行比較，篩選出毒性部位，為闡明高烏頭的毒性成分提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)昆明種小鼠240只，雌雄各半，鼠齡6～8周，體質(zhì)量18～22 g，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（甘）2011-0001。飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，溫度23～26 ℃，相對(duì)濕度50%～60%，自由攝食飲水。

1.2 藥物及制備

高烏頭藥材，購(gòu)自甘肅省天祝藏族自治縣農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院楊扶德教授鑒定為高烏頭的干燥根。取高烏頭藥材，凈制，潤(rùn)軟，切片（厚約5 mm），自然干燥，篩去碎屑，用10倍量95%乙醇冷浸超聲2次，每次冷浸24 h，超聲45 min，過(guò)濾，合并2次濾液，回收乙醇，所得稠膏加水制成混懸液，依次用石油醚、三氯甲烷、水飽和乙酸乙酯、水飽和正丁醇分別萃?。糠N溶劑均200 mL×4），得到石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取部分，剩下為乙醇部分。將乙醇提取后的藥渣揮盡乙醇，加10倍量水浸泡1 h，回流提取1 h，抽濾；殘?jiān)偌?倍量水，回流提取1 h，抽濾，合并2次濾液，濃縮，得到水提部分?；厥杖軇r(shí)，除水、乙醇和正丁醇部分減壓濃縮溫度低于85 ℃，其他部分減壓濃縮溫度均低于35 ℃。將各萃取部分進(jìn)行冷凍干燥，備用。

1.3 主要試劑與儀器

石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、甲基纖維素等均為分析純，95%乙醇、二甲苯、石蠟、蘇木精，伊紅（天津市百世化工有限公司）。KQ3200DB超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），BT 125D電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司），奧林巴斯顯微鏡（日立，型號(hào)OLYMPUS BX60），LGJ-18S型冷凍干燥機(jī)（北京松源華興科技發(fā)展有限公司）。

1.4 預(yù)實(shí)驗(yàn)

取上述高烏頭各溶劑萃取部分適量，分別置于研缽中，用0.5%甲基纖維素溶解配制最大濃度藥液（以灌胃針能吸取和推動(dòng)為準(zhǔn)），給藥前禁食不禁水16 h，按體質(zhì)量給予小鼠灌胃給藥1次，找出最小100%死亡量（Dm）和最大0%不死量（Dn），進(jìn)行半數(shù)致死量（LD50）測(cè)定[11]，若無(wú)法測(cè)定LD50值，則按照《藥物單次給藥毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[12]的要求，測(cè)定最大給藥量值。

1.5 正式實(shí)驗(yàn)

1.5.1 高烏頭三氯甲烷、正丁醇及水提部分的半數(shù)致死量測(cè)定

選用小鼠160只，雌雄各半，隨機(jī)分為三氯甲烷部分、水提部分、正丁醇部分各5個(gè)組和空白對(duì)照組。給藥前禁食不禁水16 h，三氯甲烷、正丁醇、水提部分各組分別按照20 mL/kg給予對(duì)應(yīng)受試藥液灌胃，空白對(duì)照組給予給等體積0.5%甲基纖維素溶液灌胃[11]。觀察給藥后14 d內(nèi)小鼠各種反應(yīng)，并記錄死亡時(shí)間、死亡只數(shù)及體質(zhì)量變化，同時(shí)將死亡小鼠及時(shí)解剖，肉眼觀察各主要臟器有無(wú)明顯病理改變，10%甲醛溶液保存。

1.5.2 高烏頭石油醚、乙酸乙酯及乙醇萃取部分最大給藥量測(cè)定

選用小鼠80只，雌雄各半，隨機(jī)分為石油醚部分組、乙酸乙酯部分組、乙醇部分組和空白對(duì)照組。給藥前禁食不禁水16 h，各組均按照最大濃度（以灌胃針能吸取和推動(dòng)為準(zhǔn)）和最大體積（40 mL/kg）灌胃1次[12]。給藥后連續(xù)觀察14 d，記錄各組小鼠毒性反應(yīng)及死亡情況，并計(jì)算小鼠最大給藥量倍數(shù)。該劑量相當(dāng)于臨床日給藥量的倍數(shù)。

小鼠最大給藥量倍數(shù)=（小鼠日最大給藥量/ g）/（小鼠平均體質(zhì)量/20 g）×（成人平均體質(zhì)量（60 kg））/（成人日用量/9 g）

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以—x±s表示，組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。毒理學(xué)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用Bliss法[13]，同時(shí)計(jì)算LD50及95%可信區(qū)間。

2 結(jié)果

2.1 預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)得到高烏頭三氯甲烷、正丁醇及水提部分的Dm分別為192.83、3987.60、29 266.00 mg/kg，Dn分別為37.31、946.30、15 277.03 mg/kg；而石油醚、乙酸乙酯及乙醇部分于1 d內(nèi)給予0.4 mL×1、0.8 mL×1、0.8 mL×2，均不引起小鼠死亡，故不進(jìn)行LD50測(cè)定，進(jìn)行最大給藥量測(cè)定。

2.2 高烏頭三氯甲烷、正丁醇及水提部分半數(shù)致死量

高烏頭不同溶劑萃取部分對(duì)小鼠急性毒性強(qiáng)度差異較大，依次為三氯甲烷部分、水提部分、正丁醇部分，LD50分別為89.65、1805.40、24 409.41 mg/kg。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3 高烏頭石油醚、乙酸乙酯及乙醇部分最大給藥量

石油醚、乙酸乙酯、乙醇部分，分別按相應(yīng)最大濃度（0.067 2、0.077 7、0.709 4 g/mL）和最大給藥體積（均為40 mL/kg）灌胃給藥1次，連續(xù)觀察14 d，未見(jiàn)動(dòng)物死亡，小鼠大小便及顏色、毛色、眼、鼻、口腔分泌物均未見(jiàn)異常。結(jié)果最大給藥量分別為2686.01、3108.13、28 376.21 mg/kg，分別相當(dāng)于497.407、3453.333、697.199 g原藥材/kg（相當(dāng)于60 kg成人臨床用量的3316、23 022、4648倍）。

2.4 小鼠死亡潛伏時(shí)間、中毒癥狀、體質(zhì)量變化及尸檢情況

三氯甲烷部分：神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)為給藥后1～3 min活動(dòng)減少，4～5 min站立不穩(wěn)、抽搐、狂躁，7～8 min強(qiáng)直性抽搐，角弓反張，翻身，遺尿；心血管系統(tǒng)表現(xiàn)為體熱，雄鼠睪丸腫脹，心律不齊；呼吸系統(tǒng)表現(xiàn)為喘息，面、足部紫紺；消化系統(tǒng)表現(xiàn)為7～8 min腹部嚴(yán)重扭曲。一般7～18 min內(nèi)死亡，個(gè)別35 min死亡，且給劑量越大，死亡潛伏期越短，中毒癥狀越明顯。未死亡小鼠先安靜后興奮、爬籠，腹部微抽，約30 min后恢復(fù)自主活動(dòng)。對(duì)死亡小鼠解剖肉眼觀察可見(jiàn)大多出現(xiàn)肝臟瘀血、肺瘀血、胃腸脹氣、腹腔有輕微出血。存活小鼠于14 d后脫頸處死解剖，各臟器肉眼觀察未見(jiàn)明顯異常。

正丁醇部分：類似上述中毒癥狀，但較輕，死亡潛伏期明顯不同。一般15～30 min死亡，少數(shù)90 min以上死亡。對(duì)死亡小鼠解剖肉眼觀察結(jié)果與三氯甲烷部分相似。存活小鼠于14 d后脫頸處死解剖，各臟器肉眼觀察未見(jiàn)明顯異常。

水提部分：類似上述中毒癥狀，但輕微，一般在8～20 min內(nèi)死亡，個(gè)別24 min死亡。對(duì)死亡小鼠解剖肉眼觀察結(jié)果與三氯甲烷部分相似。存活小鼠14 d后脫頸處死解剖，各臟器肉眼觀察未見(jiàn)明顯異常。

石油醚部分：開始安靜，腹部微抽，平趴，乏力，站立不穩(wěn)，50 min后逐漸恢復(fù)正常。14 d后脫頸處死解剖，各臟器肉眼觀察未見(jiàn)明顯異常。

乙酸乙酯部分：開始安靜，偶見(jiàn)喉中鳴響，30 min后逐漸恢復(fù)自主活動(dòng)。14 d后脫頸椎處死解剖，各臟器肉眼觀察未見(jiàn)明顯異常。

乙醇部分：給藥后先靜止，呼吸急促，干嘔，腹部抽搐，6 h后逐漸恢復(fù)自主活動(dòng)，進(jìn)食飲水。14 d后脫頸處死解剖，各臟器肉眼觀察未見(jiàn)明顯異常。

各部分均顯示給藥劑量越大，死亡潛伏期越短，中毒癥狀越明顯；存活小鼠體質(zhì)量與空白對(duì)照組比較無(wú)明顯差異。見(jiàn)表2。

2.5 高烏頭三氯甲烷部分對(duì)小鼠主要臟器的影響

急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高烏頭三氯甲烷部分毒性最強(qiáng)（LD50最小），故選擇該組死亡小鼠主要臟器進(jìn)行HE染色觀察。病理觀察顯示，與空白對(duì)照組比較，高烏頭三氯甲烷部分組小鼠心、肝、肺、腎和腦的組織結(jié)構(gòu)與細(xì)胞形態(tài)均有一定改變。心臟部位細(xì)胞核增大；肝臟部位出現(xiàn)輕-中度脂肪變性、肝血竇擴(kuò)張和肝瘀血；肺部位出現(xiàn)肺泡壁增寬、增厚和代償性肺氣腫；腎臟部位出現(xiàn)腎小球體積增大，腎間質(zhì)有出血和毛細(xì)管充血、瘀血；腦部位出現(xiàn)胞漿個(gè)別細(xì)胞嗜酸性增強(qiáng)、體積變小。見(jiàn)圖1。

3 討論

觀察高烏頭6個(gè)溶劑萃取部分的中毒反應(yīng)發(fā)現(xiàn)，共同中毒癥狀為活動(dòng)減少、狂躁、呼吸抑制、抽搐，角弓反張而死亡。所不同的是，水提部分能明顯觀察到嘔吐現(xiàn)象，面、眼和腹部紫紺，眼球明顯外凸，遺尿。這些中毒癥狀說(shuō)明受試物中毒的靶器官主要是中樞神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)，與病理結(jié)果相符。文獻(xiàn)研究顯示，高烏頭中高烏甲素具鎮(zhèn)痛和局麻作用[14]，造成小鼠活動(dòng)減少和呼吸抑制很可能與高烏甲素有關(guān)，這與其他中藥毒性研究一致，毒性成分也是其有效成分。水提部分毒性反應(yīng)不同于其他部分，推測(cè)其含有的毒性成分可能與其他萃取部分不同。

在高烏頭正丁醇部分急性毒性實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，由于受給藥濃度和體積的限制，始終找不到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物100%死亡的劑量。共經(jīng)過(guò)4次預(yù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果均顯示，動(dòng)物死亡數(shù)量不隨給藥劑量的增大而增加，當(dāng)給藥劑量增大到一定程度，達(dá)到最大給藥量（能夠配制的最大濃度和最大給藥體積）時(shí)，死亡率最大達(dá)到60%。因此，在計(jì)算LD50時(shí)，數(shù)據(jù)中無(wú)動(dòng)物100%死亡率，原因可能是高烏頭毒性成分極性偏小，主要集中在三氯甲烷部位。

高烏頭具有很強(qiáng)的鎮(zhèn)痛抗炎活性，其含有的高烏甲素成分被列為我國(guó)首創(chuàng)的非成癮性鎮(zhèn)痛藥，被廣泛應(yīng)用于臨床，具有較好的市場(chǎng)應(yīng)用前景。同時(shí)高烏頭也有一定的毒性，歷代本草著作均記載“高烏頭辛、苦、溫，有毒”，使其臨床應(yīng)用受限。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)系統(tǒng)溶劑法和急性毒性試驗(yàn)對(duì)高烏頭進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)高烏頭不同溶劑萃取部分急性毒性差異很大，其中三氯甲烷部分毒性最大，乙醇部分毒性最小。有研究顯示，高烏頭中含有生物堿、黃酮、甾體等化學(xué)成分，其中以二萜生物堿為主，而此類生物堿主要集中在三氯甲烷部分[6，15]。對(duì)高烏頭毒性貢獻(xiàn)的物質(zhì)基礎(chǔ)可能與多種化學(xué)成分有關(guān)，具體與化學(xué)成分之間關(guān)系還需要后續(xù)進(jìn)一步分析研究，以期更好地應(yīng)用于臨床。

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（收稿日期：2017-03-15）

（修回日期：2017-03-27；編輯：華強(qiáng)）