一測多評法測定黃蛭內(nèi)異膠囊中5種蒽醌類成分含量

徐沖　沈潔　夏敏　楊敏　冷靜

摘要：目的 采用一測多評法對黃蛭內(nèi)異膠囊中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚5種蒽醌類成分進行含量測定，并與外標法進行比較，確定一測多評法對該制劑質(zhì)量控制的應(yīng)用價值。方法 采用Waters Symmetry C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為甲醇-0.4%磷酸溶液（85∶15），流速1.000 mL/min，檢測波長440 nm，柱溫30 ℃，以大黃素為內(nèi)參物建立各成分相對校正因子，計算各成分含量。結(jié)果 以校正因子計算所得各成分含量與外標法實測結(jié)果無明顯差異，相對誤差均小于5%。結(jié)論 一測多評法可用于黃蛭內(nèi)異膠囊的質(zhì)量控制，方法有效可靠。

關(guān)鍵詞：一測多評法；黃蛭內(nèi)異膠囊；蒽醌類；含量測定

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.04.014

中圖分類號：R284.1 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）04-0066-05

Abstract： Objective To determine the contents of 5 anthraquinones （aloe-emodin， phein， emodin， chrysophanol， physcion） in Huangzhi Neiyi Capsule through a quantitative analysis of multi-component by single-marker （QAMS）， To determine the application value of QAMS by comparing with external standard method （ESM）. Methods HPLC was performed at 30 ℃ with Waters Symmetry C18 column （4.6 mm × 250 mm， 5 μm）， methanol-0.4% phosphoric acid （85：15） as mobile phase at the wavelength 440 nm， and flow rate of 1.000 mL/min. The relative correction factors of other anthraquinones were calculated respectively by emodin as the reference. Results The values calculated by QAMS were compared with the values measured by ESM， and no significant difference was showed （RSD<5%）. Conclusion For the availability and reliability， QAMS can be applied for quality evaluation of Huangzhi Neiyi Capsules.

Keywords： quantitative analysis of multi-component by single-marker； Huangzhi Neiyi Capsules； anthraquinones； content determination

中藥復(fù)方制劑具有成分復(fù)雜、靶點多樣的特點，因此，單一成分的含量檢測難以全面體現(xiàn)其整體質(zhì)量，而多指標的質(zhì)量控制方法又存在著對照品供應(yīng)不足問題，限制了中藥制劑的質(zhì)量評價研究。一測多評法（quantitative analysis of multi-components by single- marker，QAMS）是指在建立多指標質(zhì)量控制方法時，以某一代表性成分（廉價、易得、有效）作為內(nèi)標物，建立該內(nèi)標物與其他成分間的相關(guān)關(guān)系，得出相對校正因子，并利用該因子計算出其他組分的含量[1-2]。QAMS基于多指標質(zhì)量控制的研究思路，符合中醫(yī)強調(diào)整體治療的理論，在降低檢測成本的同時，解決了對照品供應(yīng)不足的問題，是當前較具可行性的中藥質(zhì)量控制手段[3-7]。

黃蛭內(nèi)異膠囊系由重慶市名中醫(yī)夏敏主任中醫(yī)師經(jīng)驗方開發(fā)而成的醫(yī)院制劑，主含熟大黃、制香附及水蛭等，具有助肝行氣、活血化瘀、祛瘀止痛功效，臨床用于治療子宮內(nèi)膜異位癥。為更好地控制黃蛭內(nèi)異膠囊的質(zhì)量，本研究采用QAMS對制劑中的有效成分大黃蒽醌類進行含量測定，并將計算值與外標法（ESM）實測值進行比較，驗證QAMS評價該制劑質(zhì)量的適用性與可行性。

1 儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司），XA205DU電子天平（Mettler Toledo），JA3003J電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司），AS10200AT超聲波清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

蘆薈大黃素對照品（純度99%，批號P1170093），Admas Reagent；大黃酸、大黃酚、大黃素、大黃素甲醚對照品（批號分別為110757-200206、110756- 201512、110796-200716、110758-201415），中國食品藥品檢定研究院。黃蛭內(nèi)異膠囊（批號160606、160607、160704、160705、160718、160815、160816、160817），本院中藥制劑室自制。甲醇、磷酸為色譜純，其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Waters Symmetry C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為甲醇-0.4%磷酸溶液（85∶15），流速1.000 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長440 nm，進樣量10 μL[8-11]。

2.2 混合對照品溶液的制備

分別精密稱取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對照品5.35、5.29、5.42、5.08、5.38 mg，加甲醇制成混合對照品溶液，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚濃度分別為0.053 5、0.052 9、0.054 2、0.050 8、0.053 8 mg/mL。

2.3 供試品溶液的制備

取黃蛭內(nèi)異膠囊（批號160607）內(nèi)容物研細（過4號篩），精密稱取細粉0.5 g，加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，冷卻后再次稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾。精密量取續(xù)濾液20 mL，水浴蒸干，加入8%鹽酸溶液10 mL，超聲處理（功率150 W，頻率40 kHz）2 min后加入三氯甲烷20 mL，加熱回流1 h，放冷，置于分液漏斗，用少量三氯甲烷洗滌容器，洗液并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層（10 mL×3），合并，水浴蒸干，殘渣加甲醇溶解，定量至10 mL量瓶，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得[12]。

2.4 陰性對照溶液的制備

根據(jù)黃蛭內(nèi)異膠囊處方組成，制備缺大黃的陰性樣品，按“2.3”項下方法制備，即得。

2.5 專屬性試驗

分別吸取對照品、供試品、陰性對照溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，在上述色譜條件下測定，結(jié)果各色譜峰分離度良好，色譜圖見圖1。

2.6 線性關(guān)系考察

分別吸取混合對照品溶液5、10、15、20、25、30 μL注入高效液相色譜儀中，測定峰面積。以峰面積為縱坐標，進樣量（μg）為橫坐標，進行線性回歸，結(jié)果見表1。

2.7 精密度試驗

精密吸取同一批號黃蛭內(nèi)異膠囊供試品溶液10 μL，連續(xù)進樣6次，在上述色譜條件下測定，結(jié)果蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的峰面積RSD分別為0.46%、0.50%、0.34%、0.49%、0.39%，表明儀器的精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗

取同一批號供試品溶液，分別于制備后的0、2、4、8、16、24 h，精密吸取10 μL，在上述色譜條件下測定，結(jié)果蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的峰面積RSD分別為0.26%、0.21%、0.15%、0.25%、0.15%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 重復(fù)性試驗

取同一批號黃蛭內(nèi)異膠囊內(nèi)容物0.5 g，平行6份，精密稱定，按“2.3”項下方法制備，分別進樣10 μL，測得蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含量分別為0.270%、0.139%、0.785%、0.116%、0.213%，RSD分別為2.43%、2.59%、3.75%、2.12%、2.50%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收率試驗

精密稱取上述批號黃蛭內(nèi)異膠囊內(nèi)容物9份，每份約0.25 g，隨機分為3組，每組按照內(nèi)容物含量的80%、100%、120%比例分別加入蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對照品溶液，加甲醇補足至50 mL，按“2.3”項下方法處理，分別精密進樣10 μL，根據(jù)峰面積計算加樣回收率及RSD。結(jié)果蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的加樣回收率分別為99.5 %、95.7%、99.1%、97.0%、97.8%，RSD分別為1.28%、0.80%、1.48%、0.40%、1.08%，表明該方法的準確度良好。

2.11 相對校正因子與相對保留值的測定

分別吸取“2.2”項下混合對照品溶液5、10、15、20、25、30 μL，測定各成分的峰面積及保留時間，并分別計算蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚與內(nèi)參物大黃素的相對校正因子及相對保留值，結(jié)果見表3、表4。相對校正因子f大黃素/蘆薈大黃素=1.010，f大黃素/大黃酸=1.334，f大黃素/大黃酚=0.920，f大黃素/大黃素甲醚=1.118，相對保留值r大黃素/蘆薈大黃素=2.197，r大黃素/大黃酸=1.437，r大黃素/大黃酚=0.747，r大黃素/大黃素甲醚=0.651，各成分相對校正因子及相對保留值的RSD均小于5%，表明QAMS建立的方法所得檢測結(jié)果準確可靠，可用于對黃蛭內(nèi)異膠囊中所含的大黃蒽醌類成分進行含量測定。

2.12 外標法與一測多評法測定結(jié)果比較

取8批黃蛭內(nèi)異膠囊，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別吸取大黃蒽醌類對照品與供試品溶液，在上述色譜條件下進行含量測定，采用ESM與QAMS分別對黃蛭內(nèi)異膠囊中的5種大黃蒽醌類成分進行相關(guān)計算[13-15]，結(jié)果見表5、表6。可見，各成分色譜峰定位比較與含量測定結(jié)果比較的相對誤差均小于5%，說明QAMS對于檢測黃蛭內(nèi)異膠囊中大黃蒽醌類成分含量具有較高的準確性，可以被用作含量測定的方法。

3 討論

本試驗采用QAMS對黃蛭內(nèi)異膠囊中5種大黃蒽醌類成分進行了含量測定。通過文獻調(diào)研，考察了254 nm和440 nm檢測波長[9，12]，發(fā)現(xiàn)在254 nm檢測波長處，樣品色譜圖雜質(zhì)峰較多，而在440 nm波長處雜質(zhì)峰少且陰性對照無干擾，故選擇440 nm作為檢測波長。

在同時測定大黃多指標成分時，由于蘆薈大黃素對照品不易獲得，常導(dǎo)致含量測定無法及時實施。而采用本研究所建立的QAMS方法，選用價廉、質(zhì)穩(wěn)、易得的大黃素作為內(nèi)標物，減少了對照品的種類和用量，在對照品缺乏的情況下也可方便有效地對其他4種蒽醌類成分（大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素）進行定量。且本研究結(jié)果顯示，QAMS測定所得含量結(jié)果與ESM測定結(jié)果基本一致，色譜峰定位亦準確，說明該方法能夠?qū)崿F(xiàn)對黃蛭內(nèi)異膠囊中多成分質(zhì)量控制的目的，在節(jié)省成本的同時極大增加了檢測的便利性，具有較高的應(yīng)用價值。

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（收稿日期：2017-10-12）

（修回日期：2017-10-25；編輯：陳靜）