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    當歸多糖對阿爾茨海默病模型大鼠學習記憶及β—淀粉樣蛋白代謝的影響

    2018-07-12 07:29:16王虎平吳紅彥李海龍馬春林曾慶濤崔淑梅朱凱敏
    中國中醫(yī)藥信息雜志 2018年4期
    關鍵詞:象限批號多糖

    王虎平 吳紅彥 李海龍 馬春林 曾慶濤 崔淑梅 朱凱敏

    摘要:目的 觀察當歸多糖對阿爾茨海默?。ˋD)模型大鼠學習記憶、海馬β-淀粉樣蛋白前體(APP)、β-淀粉樣蛋白(Aβ)1-42及血清乙酰膽堿(Ach)、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)、乙酰膽堿酯酶(AChE)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)的影響,探討其防治AD的作用機制。方法 70只SPF級Wistar大鼠經(jīng)水迷宮學習記憶能力篩選合格后,隨機選取10只大鼠(雌雄各半)為假手術組,其余大鼠以腦立體定位注射Aβ25-35復制AD大鼠模型,以水迷宮學習記憶能力篩選造模成功的50只大鼠隨機分為模型組、陽性藥組和當歸多糖低、中、高劑量組,每組10只。模型組和假手術組大鼠給予生理鹽水灌胃,各給藥組大鼠給予相應藥液灌胃,每日給藥體積均為2 mL/100 g,連續(xù)28 d。給藥25~28 d Morris水迷宮測試大鼠學習記憶能力,然后取材檢測血清Ach、ChAT、AChE、SOD、MDA及海馬APP、Aβ1-42。結果 與假手術組比較,模型組大鼠定位航行實驗逃避潛伏期明顯延長,目標象限滯留時間縮短,空間探索實驗首次到達原逃生平臺位置潛伏時間延長,穿越原平臺位置及目標象限滯留的時間縮短,血清Ach含量與ChAT、SOD活性明顯降低,AChE活性及MDA水平明顯升高,海馬APP、Aβ1-42含量升高,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05,P<0.01);與模型組比較,各給藥組大鼠逃避潛伏期均不同程度縮短,目標象限滯留時間延長,首次到達原逃生平臺位置潛伏時間縮短,跨原平臺次數(shù)增加,血清Ach含量和ChAT、SOD活性升高,AChE活性及MDA水平明降低,海馬APP、Aβ1-42含量降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05,P<0.01)。結論 當歸多糖可能通過改善膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)、提高抗自由基氧化能力及促進Aβ的代謝,改善AD模型大鼠學習記憶能力,對AD有一定的防治作用。

    關鍵詞:當歸多糖;Morris水迷宮;神經(jīng)遞質(zhì);抗氧化;β-淀粉樣蛋白前體;β-淀粉樣蛋白1-42;大鼠

    DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2018.04.011

    中圖分類號:R285.5 文獻標識碼:A 文章編號:1005-5304(2018)04-0051-05

    Abstract: Objective To investigate effects of angelica polysaccharide on learning and memory abilities, Ach, ChAT, AChE, SOD, MDA in serum, APP and Aβ1-42 in hippocampus in model rats with Alzheimer disease (AD); To explore the mechanism of angelica polysaccharide for the treatment of AD. Methods Seventy SPF Wistar rats were selected for learning and memory ability by water maze. 10 rats were randomly selected (half female and half male) as sham-operation group, and the others were injected with Aβ25-35 by stereotatic techniques, copying AD model rats. 50 rats for learning and memory ability by water maze were successfully divided into model group, positive group, angelica polysaccharide low-, medium-, and high-dose groups, with 10 rats in each group. Rats in model group and sham-operation group were given normal saline for gavage, while rats in medication groups were given relevantmedicine for gavage, 2 mL/(100 g·d), for 28 d. The learning and memory ability of rats in each group was tested by Morris water maze during 25-28 days, and the contents of Ach, ChAT, AChE, SOD, MDA in serum and APP and Aβ1-42 in hippocampus were determined. Results Compared with the sham-operation group, the escape latent period of model group was significantly prolonged in place navigation experiment; the target quadrant time was shortened; the latent time for the first time to reach the original escape platform was longer in spatial probe test; the residence time of crossing the original platform position and the target quadrant was shorter; the levels of Ach, the activity of ChAT and SOD in serum decreased; the levels of MDA, the activity of AChE in serum increased; the levels of APP and Aβ1-42 in hippocampus increased, with statistical significance (P<0.05, P<0.01). Compared with model group, the escape latent period of each medication group was shortened in different degrees after the intervention treatment; the residence time of target quadrant was prolonged; the latent time for the first time to reach the original escape platform was shortened; the number of cross platform increased; the levels of Ach, the activity of ChAT and SOD in serum increased; the levels of MDA and the activity of AChE in serum decreased; the levels of APP and Aβ1-42 in hippocampus significantly decreased, with statistical significance (P<0.05, P<0.01). Conclusion Angelica polysaccharide may effectively improve the learning and memory of ability of AD model rats to improve anti-free radical oxidation and promote Aβ metabolism and promote learning and memory ability of AD model rats, which have some preventive and therapeutic effects on AD.

    Keywords: angelica polysaccharide; Morris water maze test; neurotransmitter; antioxidation; APP; Aβ1-42; rats

    隨著世界各國人口結構的老齡化,阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease,AD)已成為嚴重影響老年人生活質(zhì)量甚至威脅生命健康的殺手。因此,深入探究AD的發(fā)病機制、研發(fā)行之有效的AD防治藥物已成為世界醫(yī)學的研究熱點。我們前期進行了當歸防治AD的相關實驗[1-2],確證了當歸防治AD的有效性。本研究將從藥效物質(zhì)基礎入手,探討當歸主要活性成分當歸多糖對AD的防治作用及其機制。

    1 實驗材料

    1.1 動物

    SPF級Wistar大鼠70只,雌雄各半,3月齡,體質(zhì)量(200±20)g,中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州畜醫(yī)研究所實驗動物場,動物許可證號SCXK(甘)2015-0001。

    飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學科研實驗中心SPF級動物實驗室。

    1.2 藥物及制備

    當歸多糖(純度98%)購于陜西慈緣生物技術有限公司,合同號ZYY-CY1601103;鹽酸多奈哌齊片,衛(wèi)材(中國)藥業(yè)有限公司,批號1604043;青霉素(160萬U),華北制藥股份有限公司,批號F6057301。精密稱取當歸多糖適量,充分溶于蒸餾水,配制成濃度分別為0.008 8、0.017 6、0.035 2 g/mL當歸多糖低、中、高劑量溶液;將鹽酸多奈哌齊片研為粉末,溶于蒸餾水,配制成濃度為0.045 mg/mL溶液。

    1.3 主要試劑與儀器

    β-淀粉樣蛋白(Aβ)25-35購于上海強耀生物科技有限公司,批號20160509;Rat APP ELISA KIT,上海酶聯(lián)生物科技有限公司,批號1069820;Rat Aβ1-42 ELISA KIT,上海酶聯(lián)生物科技有限公司,批號1069821;Rat乙酰膽堿(Ach)ELISA KIT,上海酶聯(lián)生物科技有限公司,批號1069818;Rat膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)ELISA KIT,上海酶聯(lián)生物科技有限公司,批號1069819;乙酰膽堿酯酶(AChE)試劑盒,南京建成生物化學試劑有限公司,批號20161218;丙二醛(MDA)試劑盒,南京建成生物化學試劑有限公司,批號20161221;超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒,南京建成生物化學試劑有限公司,批號20161221;考馬斯亮蘭蛋白測試盒,南京建成生物化學試劑有限公司,批號20161220。Morris水迷宮視頻跟蹤系統(tǒng),成都泰盟科技有限公司,型號WMT-100;酶標分析儀,北京普朗新技術有限公司,型號DNM-9602;紫外分光光度計,日本島津,型號UV-120-02;數(shù)字恒溫水浴鍋,江蘇正基儀器有限公司,型號HH-S2;臺式高速冷凍離心機,上海天美生化儀器設備有限公司,型號CT14RD;HANGPING電子秤,上海精科公司天平儀器廠,型號JY4001;大鼠腦立體定位儀,成都泰盟科技有限公司,型號WT-200;牙科鉆,韓國世新公司,型號STRONG-90;微量進樣器,上海安亭微量進樣器廠。

    2 實驗方法

    2.1 造模劑β-淀粉樣蛋白25-35的孵育

    取1 mg Aβ25-35溶于100 μL滅菌生理鹽水(濃度10 μg/μL),充分混勻,置于37 ℃孵育箱中孵育7 d,待其纖維化為聚集狀態(tài)后置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    2.2 分組及造模

    所有供試大鼠適應性飼養(yǎng)3 d后進行水迷宮實驗學習記憶能力篩選,剔除不合格大鼠3只。將篩選合格大鼠隨機選取10只(雌雄各半)作為假手術組,其余大鼠全部進行手術造模,造模大鼠7 d后進行水迷宮實驗學習記憶能力測試,篩選測試合格、造模成功50只大鼠隨機分為模型組、陽性藥組和當歸多糖低、中、高劑量組,每組10只(雌雄各半)。造模大鼠稱重后,腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉,參考《大鼠腦立體定位圖譜》[3]行海馬CA1區(qū)注射Aβ25-35溶液2 μL,碘伏擦拭傷口并涂青霉素粉末10萬U。30 ℃恒溫室內(nèi)單籠留置至蘇醒后放回大籠,并每日肌肉注射青霉素10萬U/只,連續(xù)7 d。假手術組大鼠等位點注射同劑量生理鹽水,不注射Aβ25-35溶液,其余操作同上。

    2.3 給藥

    手術造模后自然飼養(yǎng)至第7日開始給藥。模型組和假手術組大鼠給予生理鹽水灌胃,當歸多糖低、中、高劑量組和陽性藥組大鼠分別給予相應藥液灌胃,每日給藥體積均為2 mL/100 g,連續(xù)28 d。

    2.4 Morris水迷宮實驗

    2.4.1 定位航行實驗

    Morris水迷宮水池按方位分為4個象限,將逃生平臺放置在固定象限。測試時將大鼠面向池壁從4個象限各自的固定入水點放入水中,記錄其入水后尋找到平臺的時間,即為逃避潛伏期。如大鼠在2 min內(nèi)未找到平臺,則記為120 s。共歷時4 d,毎日更換入水象限進行測試。

    2.4.2 空間探索實驗

    Morris水迷宮實驗第5日撤走水下逃生平臺,任選1個象限入水點將大鼠放入水池,讓大鼠在無平臺情況下憑記憶尋找平臺位置。記錄大鼠入水后首次到達原平臺位置的潛伏期及120 s內(nèi)穿越原平臺位置的次數(shù)及在目標象限滯留時間百分比。

    2.5 β-淀粉樣蛋白前體和β-淀粉樣蛋白1-42測定

    空間探索實驗結束后,各組大鼠自由飲水、禁食12 h,腹主動脈取血,4 ℃、10 000 r/min離心3 min,取血清,ELISA測定Ach含量及ChAT活性,比色法測定SOD、AChE活性及MDA水平,然后處死動物,迅速取出腦組織,分離海馬,加生理鹽水制成10%勻漿,4 ℃、10 000 r/min離心5 min,吸取上清液,ELISA測定APP、Aβ1-42含量。

    3 統(tǒng)計學方法

    采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示,組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

    4 結果

    4.1 動物死亡情況

    由于手術造模創(chuàng)傷較大,且動物灌胃給藥,實驗周期較長,各組均出現(xiàn)了不同程度的動物死亡。其中模型組、假手術組和當歸多糖低、中劑量組各死亡2只,陽性藥組死亡3只,當歸多糖高劑量組死亡1只。

    4.2 Morris水迷宮定位航行實驗結果

    與假手術組比較,模型組大鼠逃避潛伏期明顯延長、目標象限滯留時間縮短(P<0.01);與模型組比較,當歸多糖各劑量組大鼠逃避潛伏期明顯縮短(P<0.05,P<0.01),目標象限滯留時間均不同程度延長,其中當歸多糖高劑量組延長最明顯。見表1。

    4.3 Morris水迷宮空間探索實驗結果

    與假手術組比較,模型組大鼠首次到達原平臺位置潛伏時間明顯延長、穿越原平臺位置次數(shù)明顯減少、在目標象限滯留時間明顯縮短(P<0.01);與模型組比較,當歸多糖高劑量組大鼠首次到達原平臺位置潛伏期明顯縮短(P<0.05),當歸多糖各劑量組大鼠穿越原平臺位置次數(shù)明顯增加(P<0.05,P<0.01),當歸多糖高、中劑量組在目標象限滯留時間明顯延長(P<0.01)。見表2。

    4.4 當歸多糖對模型大鼠血清乙酰膽堿、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶、乙酰膽堿酯酶、超氧化物歧化酶和丙二醛水平的影響

    與假手術組比較,模型組大鼠血清Ach含量和ChAT、SOD活性降低,AChE活性增強,MDA水平升高(P<0.01);與模型組比較,當歸多糖各劑量組大鼠血清Ach含量升高、ChAT活性增強、AChE活性減弱、MDA水平降低,當歸多糖中、高劑量組大鼠血清SOD活性增強(P<0.05,P<0.01)。見表3。

    4.5 當歸多糖對模型大鼠海馬β-淀粉樣蛋白前體和β-淀粉樣蛋白1-42含量的影響

    與假手術組比較,模型組大鼠海馬組織APP、Aβ1-42含量明顯升高(P<0.01);與模型組比較,當歸多糖各劑量組大鼠海馬組織Aβ1-42含量明顯降低,當歸多糖中、高劑量組大鼠海馬組織APP含量明顯降低(P<0.05,P<0.01)。見表4。

    5 討論

    現(xiàn)代醫(yī)學認為,AD作為一組病因未明的原發(fā)性退行性腦部疾病,其發(fā)病是多種因素(包括生物和社會心理因素)共同作用的結果,可能與家族遺傳、基因突變、免疫功能紊亂、神經(jīng)遞質(zhì)及生化改變、鋁中毒、神經(jīng)生長營養(yǎng)因子缺失、激素水平下降、能量代謝降低等諸多因素有關[4-8],并提出了β淀粉樣蛋白級聯(lián)學說、膽堿能缺陷學說、氧化應激學說、tau蛋白異常磷酸化學說等多種發(fā)病機制學說[9-10],將膽堿酯酶抑制劑、抗氧化劑、抗炎藥物、神經(jīng)營養(yǎng)因子、興奮性氨基酸等藥物應用于AD的對癥治療且取得了一定的療效,但目前少見突破性進展。因此,采用現(xiàn)代生物技術手段,在中醫(yī)理論指導下,挖掘古方、名方、驗方開展中醫(yī)藥新型制劑的創(chuàng)新研究必然是防治AD的重要方法和手段,具有廣闊的前景。

    我們前期研究提出了從肝論治AD的科研假說[11],并在疏肝養(yǎng)血名方逍遙散、黑逍遙散實驗結果[12-13]的基礎上嘗試性地開展了當歸單味藥防治AD的實驗研究。研究表明,單味當歸可改善東莨菪堿所致癡呆模型小鼠學習記憶能力,降低潛伏時間,顯著升高小鼠腦組織SOD、ChAT、單胺氧化酶活性,降低MDA、AChE;當歸含藥血清可顯著提高Aβ25-35誘導PC12細胞凋亡MTT的OD值,降低乳酸脫氫酶的釋放,升高細胞活力、降低凋亡率,能有效預防Aβ25-35對神經(jīng)細胞的損傷,保護神經(jīng)細胞的膜結構的完整性,提高細胞生存活力,減輕Aβ25-35引起的PC12細胞凋亡[1-2]。

    研究表明,老年斑(senileplaques,SP)作為AD的特征性病理之一,其核心成分是Aβ,而Aβ主要來源于APP。APP是細胞內(nèi)一種跨膜蛋白質(zhì),在體內(nèi)或體外可被多種蛋白激酶磷酸化,廣泛的存在各種組織中,尤其在腦組織中表達最高[14]。大多情況下,APP由α-分泌酶裂解成具有神經(jīng)營養(yǎng)作用的可溶性APP,與進一步在γ-分泌酶的作用能裂解成無神經(jīng)細胞毒性P3-40、P3-42的C83。只有極少數(shù)的APP才在β-分泌酶的作用下裂解成β-APPs與C99,C99在γ-分泌酶的作用下最終裂解成Aβ40和Aβ42,其中Aβ42更容易聚集,具有較強的細胞毒性。因此,腦內(nèi)Aβ42產(chǎn)生與清除機制的平衡遭到破壞,導致Aβ42在腦內(nèi)過多堆積,呈現(xiàn)出彌散型斑塊即SP。當然,Aβ42的聚積還可促使氧化應激、Ca2+內(nèi)流,導致線粒體功能紊亂,神經(jīng)細胞產(chǎn)能障礙,激活了神經(jīng)細胞凋亡機制的表達。Aβ42還可破壞機體膽堿能系統(tǒng),激發(fā)腦內(nèi)炎癥反應,損傷神經(jīng)軸突和突觸,破壞神經(jīng)元內(nèi)離子的平衡,進而改變激酶/磷酸酶的活性,引起tau蛋白的過度磷酸化,形成神經(jīng)纖維纏結(NFTs)[15]??梢?,APP是Aβ的物質(zhì)基礎,而Aβ又是SP的核心成分,也是其形成的基礎,亦與NFTs的形成高度相關,因此,APP、Aβ尤其Aβ1-42的大量堆砌將會激發(fā)氧化應激、破壞膽堿能系統(tǒng)等多種機制、通過多種途徑促成AD的發(fā)生。

    本研究結果顯示,當歸多糖可顯著縮短模型大鼠逃避潛伏期,延長目標象限滯留時間,縮短首次到達原逃生平臺位置潛伏時間,增加穿越原平臺次數(shù),并可顯著提升血清Ach含量與ChAT、SOD活性,降低血清AChE活性、MDA水平及海馬APP、Aβ1-42含量,改善模型大鼠的學習記憶能力,對AD具有一定的防治作用,其可能與促進Aβ的代謝、改善膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)及提升抗自由基氧化能力等多種途徑有關。

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    (收稿日期:2017-06-04)

    (修回日期:2017-07-04;編輯:華強)

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