針刺對失眠大鼠血清去甲腎上腺素、多巴胺及5—羥色胺含量的影響

郭鑫　岳增輝　謝菊英　吳雪芬　鄭雪娜

摘要：目的 觀察循經(jīng)選穴針刺對失眠大鼠外周血清單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺（5-HT）、多巴胺（DA）、去甲腎上腺素（NE）含量及腧穴配伍效應(yīng)的影響，探討針刺治療失眠癥的作用機(jī)制。方法 將60只SD大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、百會(huì)+神門組、百會(huì)+三陰交組和百會(huì)+非經(jīng)非穴組，每組12只，腹腔注射對氯苯丙氨酸混懸液制作大鼠失眠模型，各針刺組針刺相應(yīng)腧穴，每次30 min，連續(xù)7 d。ELISA檢測大鼠血清NE、DA、5-HT的含量。結(jié)果 與空白組比較，模型組大鼠血清5-HT、DA、NE含量明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，各針刺組大鼠血清DA、NE含量明顯降低（P<0.05，P<0.01），百會(huì)+三陰交組大鼠血清5-HT含量明顯降低（P<0.05）；各針刺組間比較，百會(huì)+神門組總體療效優(yōu)于百會(huì)+三陰交組及百會(huì)+非經(jīng)非穴組。結(jié)論 針刺改善大鼠睡眠結(jié)構(gòu)可能與血清單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量有關(guān)，循經(jīng)選穴針刺可能是影響腧穴配伍效應(yīng)的因素之一。

關(guān)鍵詞：針刺；失眠；循經(jīng)選穴；去甲腎上腺素；多巴胺；5-羥色胺；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.04.010

中圖分類號(hào)：R245 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2018）04-0046-05

Abstract： Objective To observe the effects of acupuncture in acupoints at different meridians on 5-HT， DA， NE in the peripheral serum of insomnia rats； To explore the mechanism of action of acupuncture for the treatment of insomnia. Methods Sixty SD rats were randomly divided into blank group， model group， Baihui+Shenmen group， Baihui+Sanyinjiao group， and Baihui+non-acupoint group， with 12 rats in each group. Injection of PCPA suspension of rats was used to establish insomnia model. Each acupuncture group received corresponding acupoints， 30 min each time， for 7 days. The levels of 5-HT， DA and NE in serum were measured by ELISA. Results Compared with the blank group， the levels of 5-HT， DA and NE in the model group were significantly higher than those in the blank group （P<0.01）. Compared with the model group， the contents of DA and NE in the acupuncture groups were significantly lower than those in the model group （P<0.05， P<0.01）， and the 5-HT in Baihui+Sanyinjiao group was significantly lower than those in the model group （P<0.05）. Among all acupuncture groups， overall efficacy of Baihui+Shenmen group was better than Baihui+Sanyinjiao group and Baihui+non-acupoint group. Conclusion Acupuncture can improve sleep structure in rats may be related to serum monoamine neurotransmitters. Acupuncture in acupoints at different meridians may be one of the influencing factors of acupoint compatibility effects.

Keywords： acupuncture； insomnia； acupoints at different meridians； norepinephrine； dopamine； 5-hydroxy tryptamine； rats

失眠是指入睡困難、睡眠維持障礙和早醒，且對睡眠時(shí)間或質(zhì)量不滿意，繼而影響日常功能的一種主觀體驗(yàn)[1]。現(xiàn)代生物學(xué)研究認(rèn)為，自主晝夜節(jié)律和睡眠內(nèi)穩(wěn)態(tài)驅(qū)動(dòng)共同參與調(diào)節(jié)睡眠-覺醒周期[2]，褪黑素（melatonin，MT）作為一種內(nèi)源性生理物質(zhì)，是該節(jié)律調(diào)節(jié)系統(tǒng)的重要組成部分，其與受體結(jié)合后，促使或抑制與睡眠-覺醒周期相關(guān)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)睡眠的作用[3]。近年來研究表明，失眠與血中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量有關(guān)，參與覺醒的神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺（DA）、去甲腎上腺素（NE）屬興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，一般規(guī)律為二者含量越高動(dòng)物越清醒，而高水平的5-羥色胺（5-HT）釋放是維持覺醒狀態(tài)的必要條件[4-7]。針刺作為一種有效治療和改善失眠的手段，在臨床研究中不斷得到驗(yàn)證[8]，而正確的腧穴配伍是提高針刺療效的關(guān)鍵因素之一[9]。循經(jīng)選穴為臨床治療中最常用的取穴方法之一，是指在疾患所屬經(jīng)脈的循行路線上選取穴位來治療此病。本課題以對氯苯丙氨酸（PCPA）所致的失眠大鼠模型為實(shí)驗(yàn)對象，以針刺“百會(huì)”“神門”“三陰交”等為治療手段，ELISA檢測血清5-HT、DA、NE的含量，研究不同經(jīng)絡(luò)選穴針刺治療失眠是否與外周血中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量變化相關(guān)，從而探討針刺治療失眠癥的療效機(jī)制及循經(jīng)選穴針刺對腧穴配伍效應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)SD雄性大鼠60只，8～9周齡，體質(zhì)量220～250 g，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（湘）2013-0004。正式實(shí)驗(yàn)開始前，大鼠適應(yīng)性分籠飼養(yǎng)1周，每籠5只。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室，溫度23～26 ℃，相對濕度45%～65%。

1.2 主要試劑與儀器

PCPA，美國Sigma公司，批號(hào)SHBC0245V；戊巴比妥鈉，Merck公司，批號(hào)908M034；碳酸氫鈉，成都市科龍化工試劑廠；氫氧化鈉，成都市科龍化工試劑廠；阿拉伯膠，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。動(dòng)物型超純水機(jī)，摩爾公司；pH精密試紙，墊中墊公司；電熱水恒溫杯，Promega公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司；自動(dòng)平衡離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司；全自動(dòng)酶標(biāo)洗板機(jī)，匯松科技發(fā)展有限公司；多功能酶標(biāo)分析儀，匯松科技發(fā)展有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，Promega公司；華佗牌一次性0.25 mm×25 mm無菌針灸針，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司。

1.3 分組

飼養(yǎng)1周后將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、百會(huì)+神門組、百會(huì)+三陰交組和百會(huì)+非經(jīng)非穴組，每組12只。

1.4 造模

采用經(jīng)典PCPA造模方法建立失眠大鼠模型[10]。實(shí)驗(yàn)開始前，大鼠先適應(yīng)性自由進(jìn)食喂養(yǎng)7 d，保持鼠籠干燥清潔，7 d后稱重。除空白組外，其余各組第8日開始腹腔注射PCPA混懸液（50 mg/mL），每日1次，連續(xù)2 d，制作失眠大鼠模型。PCPA臨用前按大鼠500 mg/kg體質(zhì)量用量，用事先配制好的弱堿性生理鹽水配制成混懸液。預(yù)實(shí)驗(yàn)測得PCPA按大鼠35 mg/kg體質(zhì)量為引起100%大鼠失眠的最小閾劑量。取與大鼠體質(zhì)量相對應(yīng)劑量的混懸液腹腔注射。同時(shí)，空白組予等體積弱堿性生理鹽水腹腔注射。首次注射PCPA混懸液36 h后，觀察模型組大鼠生理狀態(tài)，失眠大鼠會(huì)出現(xiàn)晝夜節(jié)律缺失、日間與夜晚皆活動(dòng)不斷、對外界刺激異常敏感、煩躁不安等癥狀，結(jié)合采用經(jīng)典的戊巴比妥鈉翻正實(shí)驗(yàn)，觀察空白組與模型組大鼠的睡眠潛伏期及睡眠總時(shí)間的差異，進(jìn)行失眠模型評(píng)價(jià)，模型組與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）為造模成功。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠注射戊巴比妥鈉后睡眠潛伏期較造模前明顯延長，睡眠總時(shí)間明顯縮短（P<0.05），提示造模成功[11]。

1.5 干預(yù)

造模后，于第2次注射PCPA混懸液24 h后，開始對實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行操作。各針刺組大鼠選穴參考大鼠穴位定位[12]?？瞻捉M大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，不做任何處理；模型組大鼠予仰臥位束縛于鼠板上，只捆綁，不進(jìn)行針刺，每日1次，每次30 min，連續(xù)7 d，每日捆綁結(jié)束后正常進(jìn)食；百會(huì)+神門組選取“百會(huì)”（位于頂骨正中處）、雙側(cè)“神門”（位于前肢內(nèi)側(cè)腕部橫紋尺骨邊緣）；百會(huì)+三陰交組選取“百會(huì)”、雙側(cè)“三陰交”（位于后肢內(nèi)踝尖直上10 mm）；百會(huì)+非經(jīng)非穴組選取“百會(huì)”“非經(jīng)非穴點(diǎn)”（位于肘內(nèi)側(cè)，肘尖與腋窩連線中點(diǎn)）[13]，非經(jīng)非穴點(diǎn)在非經(jīng)脈循行路線上及非穴位所在部位，此點(diǎn)參照成都中醫(yī)藥大學(xué)所制定的選穴方法。具體操作如下：將大鼠仰臥位束縛于鼠板上，定穴后剪毛、消毒，采用0.25 mm×25 mm針灸針進(jìn)行針刺，百會(huì)從后向前平刺20 mm，神門直刺1 mm，三陰交和非經(jīng)非穴點(diǎn)均直刺5 mm，留針30 min，每10 min行針1次，行針時(shí)間1 min，不提插、只捻轉(zhuǎn)，行平補(bǔ)平瀉手法，幅度和頻率為均等手法，30 min時(shí)，在行針結(jié)束后出針，每日1次，每日治療后正常進(jìn)食，連續(xù)7 d。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 行為學(xué)觀察

觀察大鼠精神狀態(tài)、動(dòng)作與反應(yīng)靈敏性、晝夜節(jié)律，體質(zhì)量及活動(dòng)度、飲食飲水等與失眠癥相關(guān)指標(biāo)。

1.6.2 生化指標(biāo)檢測

治療結(jié)束后，各組大鼠禁食12 h，腹主動(dòng)脈采血3 mL，室溫自然凝固10～20 min，2000～3000 r/min離心20 min，收集上清液，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩LISA檢測血清NE、DA、5-HT含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，組間比較用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠行為學(xué)觀察比較

空白組大鼠晝夜節(jié)律及行為活動(dòng)正常，大小便情況變化不明顯，毛發(fā)光澤；模型組和各針刺組大鼠在注射PCPA混懸液后出現(xiàn)白天夜晚活動(dòng)不停，晝夜節(jié)律消失、互相打斗，毛發(fā)光澤度差，籠內(nèi)墊料較空白組潮濕，糞便顏色變淺。

2.2 大鼠死亡情況

實(shí)驗(yàn)中共有7只大鼠死亡，其中模型組4只、百會(huì)+三陰交組1只、百會(huì)+非經(jīng)非穴組2只。

2.3 針刺對模型大鼠血清去甲腎上腺素含量的影響

與空白組比較，模型組大鼠血清NE含量明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，百會(huì)+神門組、百會(huì)+三陰交組、百會(huì)+非經(jīng)非穴組大鼠血清NE含量明顯降低（P<0.01）；與百會(huì)+神門組比較，百會(huì)+三陰交組和百會(huì)+非經(jīng)非穴組大鼠NE含量變化明顯（P<0.05，P<0.01）；與百會(huì)+三陰交組比較，百會(huì)+非經(jīng)非穴組大鼠血清NE含量變化明顯（P<0.01）。結(jié)果見圖1。

2.4 針刺對模型大鼠血清多巴胺含量的影響

與空白組比較，模型組大鼠血清DA含量明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，百會(huì)+神門組、百會(huì)+三陰交組、百會(huì)+非經(jīng)非穴組大鼠血清DA含量明顯降低（P<0.01）；與百會(huì)+神門組比較，百會(huì)+非經(jīng)非穴組大鼠血清DA含量變化明顯（P<0.01）；與百會(huì)+三陰交組比較，百會(huì)+非經(jīng)非穴組大鼠血清DA含量變化明顯（P<0.01）。結(jié)果見圖2。

2.5 針刺對模型大鼠血清5-羥色胺含量的影響

與空白組比較，模型組大鼠血清5-HT含量明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，百會(huì)+三陰交組大鼠血清5-HT含量明顯降低（P<0.05），百會(huì)+神門組和百會(huì)+非經(jīng)非穴組5-HT含量無明顯變化（P>0.05），但有下降趨勢；與百會(huì)+神門組比較，百會(huì)+三陰交組和百會(huì)+非經(jīng)非穴組大鼠血清5-HT含量無明顯變化（P>0.05）；與百會(huì)+三陰交組比較，百會(huì)+非經(jīng)非穴組大鼠血清5-HT含量變化明顯（P<0.01）。結(jié)果見圖3。

3 討論

古人對失眠有“不寐”“目不瞑”“不得眠”等描述，其病因病機(jī)主要為陰陽氣血失調(diào)、肝失疏瀉、心腎不交、心神失養(yǎng)、脾胃不和、虛火擾心、痰瘀互結(jié)等[14]。百會(huì)，系督脈之要穴，一身陽氣匯聚之處，具有安神健腦之功效，《針灸大成》有“思慮勞傷心脾，灸百會(huì)”的記載，足見百會(huì)治療失眠的作用。神門，系手少陰心經(jīng)之原穴，具有鎮(zhèn)心安神之功效。心主血脈，又主神明，為君主之官，是五臟六腑之大主，精神之所舍?？梢娛吲c心的關(guān)系非常緊密，而作為心經(jīng)的原穴，神門對治療失眠起著非常重要的作用。三陰交系足太陰脾經(jīng)之要穴，也是肝、脾、腎三條陰經(jīng)交會(huì)之處，從失眠病因病機(jī)可知，其與此三臟關(guān)系非常緊密，所以，三陰交也是治療失眠的重要腧穴。研究發(fā)現(xiàn)，古代治療失眠的156個(gè)針灸處方中，神門和三陰交最為常用且療效顯著[15]。臨床中腧穴配伍十分常見，其主要目的是發(fā)揮穴位的協(xié)同作用，以提高臨床療效，因?yàn)椴⒎侨我庋ㄎ幌嗯涠伎善鸬搅夹宰饔肹16]。有研究表明，針刺不同經(jīng)穴對家兔胃黏膜的保護(hù)作用中足陽明胃經(jīng)效果較其他經(jīng)脈更高[17]，表明疾病所屬臟腑本經(jīng)穴位的治療效果優(yōu)于他經(jīng)穴位。

作為目前臨床運(yùn)用廣泛的腧穴配伍方法之一，按經(jīng)脈配伍及循經(jīng)選穴包括選擇本經(jīng)脈上的腧穴配伍治療該臟腑病或經(jīng)脈病的本經(jīng)配伍[18]。本課題以失眠為研究對象，心主神志，將百會(huì)作為固定穴，循經(jīng)選穴取“神門”，辨證取穴選“三陰交”，再以“非經(jīng)非穴組”作為對照，使實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)更為合理。

睡眠是中樞神經(jīng)內(nèi)部發(fā)生主動(dòng)調(diào)節(jié)的過程，其發(fā)生與某些特定結(jié)構(gòu)及不同遞質(zhì)的作用密切相關(guān)[19]，單胺類神經(jīng)遞質(zhì)就是其中之一，包括DA、NE、5-HT等。DA、NE被認(rèn)為是與覺醒有關(guān)的中樞神經(jīng)遞質(zhì)，行為覺醒的維持可能與DA遞質(zhì)系統(tǒng)有關(guān)，而腦電覺醒的維持則與NE遞質(zhì)系統(tǒng)有關(guān)[4]，DA為合成NE的前體物，關(guān)于腦內(nèi)DA神經(jīng)元對睡眠和覺醒的影響，一般認(rèn)為腦內(nèi)DA神經(jīng)元興奮，動(dòng)物覺醒增加，睡眠少；反之，覺醒少，睡眠增加。5-HT在人體除骨骼肌、外周神經(jīng)和腎上腺外，其余各組織器官中廣泛分布，作為上行激活系統(tǒng)的重要組成部分在維持覺醒和警覺狀態(tài)中發(fā)揮重要作用，但其與睡眠-覺醒關(guān)系還在繼續(xù)探索之中。有學(xué)者認(rèn)為，5-HT既是促進(jìn)覺醒又是促進(jìn)慢波睡眠的物質(zhì)，而究竟發(fā)揮哪方面的作用可能與哪種5-HT受體亞型系統(tǒng)被激活有關(guān)，與被激活發(fā)生的時(shí)間也相關(guān)[20]。但本研究中尚未發(fā)現(xiàn)其明顯作用，需進(jìn)一步研究探討。

本實(shí)驗(yàn)采用PCPA經(jīng)典失眠造模方法，以戊巴比妥鈉翻正實(shí)驗(yàn)指標(biāo)來確定造模成功與否。與空白組比較，模型組睡眠時(shí)間明顯縮短、睡眠潛伏期明顯延長（P<0.05），提示失眠造模成功，且各單胺類神經(jīng)遞質(zhì)均較空白組明顯升高（P<0.01）。與模型組比較，各針刺組DA和NE含量明顯降低（P<0.01），顯示出一定改善睡眠的療效，起到安神鎮(zhèn)靜的作用；而各針刺組5-HT含量變化不明確，究其原因：首先，本研究為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，其中存在一些不可控因素，進(jìn)一步的研究可考慮加大樣本量以完善整個(gè)研究，這樣有助于更好地闡明大鼠血清5-HT含量在失眠治療中的作用。國外許多研究者早將5-HT轉(zhuǎn)換率（五羥吲哚乙酸/5-羥色胺）作為5-HT能神經(jīng)元興奮性指標(biāo)來進(jìn)行促眠分析[21-23]，本研究仍采用測量5-HT含量的方法，有待改進(jìn)；其次，本課題取材于股動(dòng)脈，由于血腦屏障的存在，5-HT很難通過血腦屏障作用，而以往研究大多取材為大腦，取材部位的不同可能導(dǎo)致不同的結(jié)果；再次，5-HT含量變化與睡眠有關(guān)，但是否可將其作為觀察治療失眠療效的特異性指標(biāo)，這點(diǎn)還值得繼續(xù)探索。各針刺組間比較，百會(huì)+神門組和百會(huì)+三陰交組對降低失眠大鼠血清DA含量水平相當(dāng)，且兩者作用均明顯優(yōu)于百會(huì)+非經(jīng)非穴組（P<0.01），而百會(huì)+神門組在降低血清NE水平上，明顯優(yōu)于其余2組（P<0.05，P<0.01），表明神門治療失眠癥效果最優(yōu)，三陰交療效次之，這也正好說明固定穴位配伍本經(jīng)穴位效果優(yōu)于其他穴位，循經(jīng)選穴是影響腧穴配伍效應(yīng)的因素之一。

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（收稿日期：2017-10-11）

（修回日期：2017-10-24；編輯：華強(qiáng)）