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    血管緊張素Ⅱ受體抑制劑對去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠腰椎骨組織的影響及可能機(jī)制

    2018-07-12 05:46:10韋敏克韋建勛
    脊柱外科雜志 2018年3期
    關(guān)鍵詞:氯沙坦雌二醇小梁

    唐 林,韋敏克,韋建勛,柳 達(dá)

    1.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院骨科,廣西壯族自治區(qū) 530021

    2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院骨科,遼寧 110000

    絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松作為絕經(jīng)后女性的常見病和多發(fā)病,發(fā)生率呈逐年升高趨勢,嚴(yán)重威脅女性健康[1]。該病是由于雌激素缺乏而導(dǎo)致骨代謝異常的一種全身性骨骼疾病[2]。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)作為機(jī)體重要的體液調(diào)節(jié)系統(tǒng),廣泛存在于人體多種器官、組織中,廣泛參與機(jī)體多項(xiàng)生理功能[3],血管緊張素Ⅱ作為RAS主要的活性肽類物質(zhì),可與其受體結(jié)合在心血管疾病、先兆子癇、血管排斥反應(yīng)等多種生理病理過程中發(fā)揮重要作用[4]。近年來研究發(fā)現(xiàn),RAS組分存在于骨組織中,且在骨骼代謝、骨細(xì)胞增殖等過程中發(fā)揮重要作用[5]。Shuai等[6]指出,腰椎椎間盤突出癥患者腰椎骨小梁中存在RAS組分,且與骨密度和骨代謝密切相關(guān)。本研究擬對去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠進(jìn)行血管緊張素Ⅱ受體抑制劑干預(yù),探討其對腰椎骨組織的影響及可能的機(jī)制,以期為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松防治提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料和設(shè)備

    氯沙坦購自揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)四川海蓉藥業(yè)有限公司(國藥準(zhǔn)字H20080371),小鼠雌二醇檢測試劑盒、反轉(zhuǎn)錄和PCR試劑盒購自大連寶生物工程有限公司;堿性磷酸酶(ALP)檢測試劑盒、Ⅰ型前膠原羧基端前肽(PICP)檢測試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司;小鼠骨鈣蛋白(OCN)檢測試劑盒購自北京冬歌生物科技有限公司;血清鈣檢測試劑盒購自上海哈靈生物科技有限公司;TRIzol總RNA提取試劑盒購自Gibco公司;骨保護(hù)素(OPG)、核因子κB受體活化因子(RANK)、核因子κB受體活化因子配體(RANKL)及內(nèi)參引物序列均由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)合成;酶標(biāo)儀購自美國BioTek公司;實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自美國Bio-rad公司。

    1.2 實(shí)驗(yàn)動物

    SPF級雌性小鼠(Balb/c)60只購自河南省實(shí)驗(yàn)動物中心[合格證號SCXK(豫)2010-0002],8周齡,體質(zhì)量(21.2±2.0)g。利用隨機(jī)數(shù)字表將小鼠分為假手術(shù)組、模型組和氯沙坦治療組,每組20只。3組小鼠均腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉,取仰臥位固定,無菌操作,取背側(cè)正中切口,模型組和氯沙坦治療組均將雙側(cè)卵巢結(jié)扎切除,假手術(shù)組只切除雙側(cè)卵巢周圍與卵巢等重的脂肪組織。術(shù)后第5天起對小鼠進(jìn)行陰道涂片,每日1次,持續(xù)5 d,以未發(fā)現(xiàn)角化作為建模成功[7]。術(shù)后第7 天開始假手術(shù)組和模型組小鼠每天灌服0.5 mL生理鹽水,氯沙坦治療組小鼠按照10 mg/(kg·d)的劑量灌服氯沙坦水溶液0.5 mL[8]。3組小鼠術(shù)后均未用抗生素,自由活動,喂養(yǎng)于相同條件下,連續(xù)處理至術(shù)后12周,均未出現(xiàn)死亡。

    1.3 小鼠血清雌二醇、ALP、OCN和PICP水平檢測

    各組小鼠分別于建模后8周和12周時(shí)采血,采血前10 h禁食但不禁水。各組小鼠均于內(nèi)眥靜脈叢采血0.4 mL,室溫下靜置60 min,3 000 r/min離心10 min,留取血清保存于-30℃冰箱以備檢。利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)對血清中雌二醇、ALP、OCN和PICP水平進(jìn)行檢測,所有操作均在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室按照試劑盒說明完成。

    1.4 小鼠腰椎骨形態(tài)計(jì)量學(xué)檢測和三維形態(tài)重構(gòu)

    各組小鼠均于建模后12周取血后采用頸椎脫臼法處死,將下段腰椎取出,除去肌肉及軟組織,利用美國GE公司Micro-CT三維成像系統(tǒng)對小鼠L4椎體進(jìn)行骨形態(tài)計(jì)量學(xué)檢測和三維形態(tài)重構(gòu)。分析指標(biāo)包括骨密度(BMD)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)、骨小梁體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、骨小梁間隙(Tb.Sp)、骨小梁厚度(Tb.Th)、結(jié)構(gòu)模型指數(shù)(SMI)。

    1.5 小鼠腰椎組織中OPG、RANK和RANKL表達(dá)檢測

    取各組小鼠L5椎骨組織,研磨成粉末狀后轉(zhuǎn)移至勻漿器中,加入TRIzol總RNA提取試劑,冷凍勻漿后,置于滅菌離心管中,室溫下于320×g(g=9.806 65 m/s2)離心6 min,取上清。加入氯仿,充分混勻,靜置2 min,于4℃條件下12 000×g離心10 min,取上清,加入異丙醇,混勻,于-20℃冰箱放置15 min,于4℃條件下12 000×g離心10 min,獲得白色沉淀即為RNA。取白色沉淀,加入75%乙醇,于4℃條件下12 000×g離心5 min,去除液體,將離心管放置在超凈臺上吹4 min,加入無RNA酶的水對RNA進(jìn)行溶解。利用紫外分光光度計(jì)對總RNA純度進(jìn)行檢測,取D260/D280≥1.80作為合格樣品。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以cDNA作為模板進(jìn)行PCR。引物序列見表1。PCR反應(yīng)條件:95℃ 30 s,60℃ 30 s,72℃ 45 s,連續(xù)進(jìn)行40次循環(huán)。每個樣品均設(shè)置3個平行反應(yīng)復(fù)孔。用2-△△Ct法 獲 得 小 鼠 腰 椎 組 織 中OPG、RANK和RANKL相對表達(dá)量[9]。

    表1 引物序列Tab. 1 Primer sequence

    1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    利用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和分析,數(shù)據(jù)以表示,3組間比較采用F檢驗(yàn),如組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,采用LSD法進(jìn)行兩兩比較。不同時(shí)間點(diǎn)資料比較采用重復(fù)測量資料的方差分析。以P< 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 3組小鼠血清雌二醇、ALP、OCN和PICP水平比較

    3組小鼠血清雌二醇、ALP、OCN和PICP水平見表2。與假手術(shù)組相比,模型組和氯沙坦治療組小鼠8周、12周時(shí)血清雌二醇水平均降低;模型組小鼠8周、12周時(shí)血清ALP、OCN和PICP水平均升高;氯沙坦治療組小鼠8周時(shí)血清ALP、OCN和PICP水平均升高;差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。與模型組比較,氯沙坦治療組8周、12周時(shí)小鼠血清ALP、OCN和PICP水平差異均降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。與8周時(shí)相比,模型組12周時(shí)血清ALP、OCN和PICP水平均升高,氯沙坦治療組12周時(shí)血清ALP、OCN和PICP水平均降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。

    2.2 3組小鼠腰椎Micro-CT掃描結(jié)果比較

    3組小鼠腰椎Micro-CT掃描結(jié)果見表3。與假手術(shù)組相比,模型組和氯沙坦治療組BMD、Tb.N、BV/TV和Tb.Th均降低,而Tb.Sp和SMI均升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。與模型組相比,氯沙坦治療組BMD、Tb.N、BV/TV和Tb.Th均升高,而Tb.Sp和SMI均降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。三維重建圖像顯示,模型組小鼠腰椎骨微結(jié)構(gòu)破壞,骨小梁變疏松,連接性變差,多呈棒狀結(jié)構(gòu),局部出現(xiàn)較大空隙;氯沙坦治療組小鼠腰椎骨微結(jié)構(gòu)改善明顯,骨小梁數(shù)量增多,排列平行,孔隙減少(圖1)。

    表2 3組小鼠血清雌二醇、ALP、OCN和PICP水平比較Tab. 2 Comparison of serum levels of estradiol,ALP,OCN and PICP between 3 groupsn=20,

    表2 3組小鼠血清雌二醇、ALP、OCN和PICP水平比較Tab. 2 Comparison of serum levels of estradiol,ALP,OCN and PICP between 3 groupsn=20,

    注:*與假手術(shù)組相比,P< 0.05;△與模型組相比,P< 0.05;▲與8周時(shí)相比,P< 0.05Note:*P< 0.05,compared with sham group;△P< 0.05,compared with model group;▲P< 0.05,compared with 8 weeks

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    表3 3組小鼠腰椎Micro-CT分析參數(shù)Tab. 3 Micro-CT analysis parameters of lumbar spine in 3 groupsn=20,

    表3 3組小鼠腰椎Micro-CT分析參數(shù)Tab. 3 Micro-CT analysis parameters of lumbar spine in 3 groupsn=20,

    注:*與假手術(shù)組相比,P< 0.05;△與模型組相比,P< 0.05Note:*P< 0.05,compared with sham group;△P< 0.05,compared with model group

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    圖1 3組小鼠L4Micro-CT掃描三維成像Fig. 1 Micro-CT scan three-dimensional imaging of L4

    2.3 3組小鼠腰椎組織中OPG、RANK、RANKL表達(dá)比較

    3組 小 鼠 腰 椎 組 織 中OPG、RANK、RANKL相對表達(dá)量見表4。與假手術(shù)組相比,模型組和氯沙坦治療組小鼠腰椎組織中OPG mRNA、RANK mRNA相對表達(dá)量均降低,而RANKL mRNA相對表達(dá)量和RANKL/OPG比值均升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。與模型組相比,氯沙坦治療組小鼠腰椎組織中OPG mRNA、RANK mRNA相對表達(dá)量均升高,而RANKL mRNA相對表達(dá)量和RANKL/OPG比值均降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。

    3 討 論

    絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的發(fā)生與女性絕經(jīng)后雌激素水平下降有關(guān),切除成年小鼠雙側(cè)卵巢后出現(xiàn)骨代謝異常、骨量丟失,其過程與女性絕經(jīng)后骨代謝改變十分相似[9]。因此,本研究將8周齡小鼠雙側(cè)卵巢切除,建立骨質(zhì)疏松動物模型。ALP作為反映骨代謝狀況的間接指標(biāo)常用于骨形成及骨轉(zhuǎn)換的評價(jià)[10],OCN是反映骨礦化形成的特異性指標(biāo)[11],PICP則是體現(xiàn)成骨細(xì)胞合成骨膠原能力及骨形成的特異性指標(biāo)[12]。本研究顯示,模型組小鼠8周、12周時(shí)血清雌二醇水平均較假手術(shù)組降低,而血清ALP、OCN和PICP水平均升高,表明去除卵巢小鼠骨吸收大于骨形成。采用Micro-CT對3組小鼠腰椎進(jìn)行掃描,模型組BMD、Tb.N、BV/TV和Tb.Th均降低,而Tb.Sp和SMI均升高;三維成像顯示,模型組腰椎骨微結(jié)構(gòu)破壞,骨小梁變疏松,連接性變差,多呈棒狀結(jié)構(gòu),局部出現(xiàn)較大空隙,這些改變均提示采取切除小鼠雙側(cè)卵巢的方法可成功構(gòu)建骨質(zhì)疏松模型。

    表4 3組小鼠腰椎組織中OPG、RANK、RANKL表達(dá)比較Tab. 4 Comparison on expressions of OPG,RANK and RANKL in lumbar vertebrae between 3 groupsn=20,

    注:*與假手術(shù)組相比,P< 0.05;△與模型組相比,P< 0.05Note:*P< 0.05,compared with sham group;△P< 0.05,compared with model group

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    血管緊張素Ⅱ作為RAS關(guān)鍵性活化物質(zhì),可抑制成骨細(xì)胞中OPG基因表達(dá),抑制ALP活性,減少礦化結(jié)節(jié)形成,顯著抑制成骨細(xì)胞礦化能力[13]。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑可部分改善去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠骨組織負(fù)轉(zhuǎn)換狀態(tài)[14]。雌激素可抵抗由血管緊張素Ⅱ活化而引發(fā)的骨代謝異常及骨丟失[15]。Zhang等[16]發(fā)現(xiàn),利用腎素抑制劑阿利吉侖可通過骨骼中血管緊張素Ⅱ和緩激肽受體信號通路而對卵巢切除術(shù)誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松小鼠骨小梁發(fā)揮保護(hù)作用。本研究采用血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑氯沙坦對小鼠進(jìn)行灌胃處理,結(jié)果顯示,氯沙坦治療組12周時(shí)血清ALP、OCN和PICP水平均降低,說明氯沙坦灌服可在一定程度上抑制骨吸收。Micro-CT對3組小鼠腰椎進(jìn)行掃描,相關(guān)參數(shù)分析顯示,與模型組相比,氯沙坦治療組BMD、Tb.N、BV/TV和Tb.Th均升高,而Tb.Sp和SMI均降低;三維重建圖像顯示,與模型組相比,氯沙坦治療組腰椎骨微結(jié)構(gòu)改善明顯,骨小梁數(shù)量增多、排列平行、孔隙減少,進(jìn)一步說明氯沙坦可有效改善去卵巢小鼠骨質(zhì)疏松狀態(tài),減少骨轉(zhuǎn)換導(dǎo)致的骨丟失。

    有研究發(fā)現(xiàn),OPG-RANKL-RANK系統(tǒng)在骨質(zhì)疏松發(fā)生過程中扮演重要角色,OPG可阻斷RANKL與RANK結(jié)合,從而抑制破骨細(xì)胞形成,減少骨吸收,增加骨質(zhì)和骨量[17]。亦有研究發(fā)現(xiàn),血管緊張素Ⅱ可促進(jìn)成骨細(xì)胞中RANKL基因表達(dá),從而加速細(xì)胞活化、分化[18]。本研究結(jié)果顯示,與假手術(shù)組相比,模型組和氯沙坦治療組小鼠腰椎組織中OPG mRNA、RANK mRNA相對表達(dá)量均降低,而RANKL mRNA相對表達(dá)量和RANKL/OPG比值均升高;與模型組相比,氯沙坦治療組小鼠腰椎組織中OPG mRNA、RANK mRNA相對表達(dá)量均升高,而RANKL mRNA相對表達(dá)量和RANKL/OPG比值均降低。提示在使用血管緊張素Ⅱ受體抑制劑氯沙坦干預(yù)后,可通過活化OPG-RANKL-RANK系統(tǒng),降低RANKL/OPG比值而減少破骨細(xì)胞生成及成熟,從而減少骨流失。

    綜上所述,血管緊張素Ⅱ受體抑制劑可能通過促進(jìn)骨形成和抑制骨吸收來減少負(fù)轉(zhuǎn)換導(dǎo)致的骨丟失,從而改善去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠腰椎骨組織骨質(zhì)疏松狀態(tài)。

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