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    4個蘋果品種的AFLP分子標記研究

    2018-07-12 06:49:16王曉英郭廷松王新花殷紅燕邊曉惠孔風芹
    關鍵詞:元帥紅星條帶

    王曉英,郭廷松,王新花*,殷紅燕,李 慧,楊 波,高 紅,邊曉惠,孔風芹

    1.泰安市泰山林業(yè)科學研究院,山東 泰安 271000

    2.泰安市徂徠山林場,山東 泰安 271000

    3.泰安市林業(yè)局,山東 泰安 271000

    4.肥城市潮泉鎮(zhèn),山東 泰安 271000

    元帥系蘋果的果實大,高樁,果面濃紅,色澤艷麗,果皮厚,肉質松脆,酸甜適口,芳香濃郁;幼樹樹勢強健,盛果期樹勢易衰弱,枝條粗壯,易形成短果枝,結果早,豐產,而果實耐貯藏性較差,果實容易軟化變綿[1]。不同元帥系品種在枝條、貯藏性等性狀間存在較大差異[2-6],DNA分子標記是現代分子生物學發(fā)展出來的一類重要的遺傳標記,已廣泛應用于遺傳圖譜的構建、種質資源的管理和鑒定、基因的定位與克隆等,目前應用于蘋果種質資源研究的分子標記主要是RAPD、SSR、SRAP、AFLP[7-20],相對而言,AFLP標記能夠提供的信息量更大,多態(tài)檢出率更高,且穩(wěn)定性好,重復性強[21,22],而AFLP分子標記應用較少[18-20]。本試驗以不同元帥系蘋果品種為研究材料,利用AFLP技術進行遺傳分析,通過對基因組DNA的限制性酶切片段進行選擇性擴增而揭示特有基因,從基因水平直接反映品種間差異,突破傳統(tǒng)方法的局限性,為新品種選育和鑒定提供依據。

    1 材料和方法

    1.1 實驗材料

    供試蘋果品種共4個(表1):(1)紅星;(2)泰山紅星,是紅星變異品種,泰山林場栽植,經多年栽培觀察,其生長勢強,果實可在室溫下自然放置2~3個月,到春節(jié)食用,比紅星蘋果的貯藏時間長;(3)沂蒙短枝紅星;(4)授粉品種金冠,均由泰安市泰山林業(yè)科學研究院蘋果種質資源圃提供。

    表1 蘋果品種名稱Table 1 Apple variety name

    1.2 操作步驟

    1.2.1 基因組DNA提取 用改良CTAB法提取蘋果基因組DNA,0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

    1.2.2 限制性酶切及連接 0.5 mL離心管中加入20 μL反應體系(DNA模板4 μL,Adapter 1 μL,PstI/MseI 2 μL,10×NEB buffer 2.5 μL,10m mol/LATP 2.5 μL,5 U/μL T4 Ligase 1 μL,H2O 7 μL),混勻離心數秒,37℃保溫5 h,8℃保溫4 h,4℃過夜。PstI接頭1:5′>CTC GTA GAC TGC GTA CAT GCA<3′,MseI接頭1:5′>GAC GAT GAG TCC TGA G<3′;PstI接頭2:5′> TGTACG CAG TCTAC<3′;MseI接頭2:5′>TAC TCA GGA CTC AT<3′。

    1.2.3 預擴增 25 μL 反應體系(模板 DNA 2 μL,10 mmol/L 預擴引物 1 μL,10 mmol/L dNTP 0.5 μL,10× PCR buffer 2.5 μL,2 U/μLTaq酶 0.5 μL,ddH2O 18.5 μL)離心數秒,進行 PCR 擴增 94 ℃ 2 min,30輪循環(huán)(94℃30 s,56℃30 s,72℃80 s),72℃5 min,將預擴增產物4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.4 選擇性擴增 預擴產物稀釋后作為選擴模板,按25 μL體系(模板DNA2 μL,10×PCR buffer 2.5 μL,1 mmol/L dNTP 0.5 μL,1 mmol/LPstI引物 1 μL,1 mmol/LMseI引物 1 μL,2 U/μL Taq 酶 0.5 μL,ddH2O 17.5 μL)混勻后,離心數秒,進行PCR循環(huán),第一輪擴增參數:94℃30 s,65℃30 s,72℃80 s,以后每輪循環(huán)溫度遞減0.7℃,擴增12輪。接著按94℃30 s,55℃30 s,72℃80 s擴增23輪,延伸加時,72℃5 min。

    1.2.5 凝膠分析 選擇性擴增產物和上樣緩沖液比例為8:3,渦旋混勻,95℃變性,8 min后,立即冰浴,取4 μL上樣到ABI 377測序儀,進行4%聚丙烯酰胺凝膠電泳,自動采集原始膠圖。對照(Marker)為 ROX500分子量內標。電泳結束后用Genescan3.1從原始膠圖中提取數據,然后用Binthere將片段的大小提取出來,再用Excel將數據轉換成0和1數據,用Ntsys2.10進行聚類分析。用Max comp程序對聚類結果和相似系數矩陣之間的相關性進行Mantel檢驗。

    2 結果與分析

    2.1 引物篩選和多態(tài)性分析

    通過對64對AFLP引物的篩選,篩選出了12對多態(tài)性較強且擴增產物清晰的引物組合(表2)。

    表2 12對AFLP引物標記條帶數統(tǒng)計Table 2 12 pairs of band numbers of AFLP primer markers statistics

    12對引物共擴增條帶826條,其中多態(tài)性帶595條;平均1對引物擴增條帶69條,多態(tài)性帶50條,多態(tài)百分比為72.0%。12對引物組合均能揭示DNA多態(tài)性,其中引物Pst I GAC/Mse I CTA擴增出多態(tài)性條帶最少為31條,多態(tài)性比例最小為55.4%,Pst I GAT/Mse I CAT擴增的多態(tài)性帶為68條,多態(tài)性比例最高為93.2%。

    2.2 凝膠分析

    利用篩選得到的12對引物對4個蘋果品種的基因組DNA進行擴增,AFLP擴增產物長度介于70~500 bp之間,結果條帶清晰。4個蘋果品種經其中6對引物擴增的電泳圖譜見圖1。

    圖1 6對引物的擴增結果Fig.1 Amplification results of 6 pairs of primers(6對引物:Pst I GAA/Mse I CAA、Pst I GAG/Mse I CAC、Pst I GAG/Mse I CAG、Pst I GAC/Mse I CAT、Pst I GAT/Mse I CAA、Pst I GAT/Mse I CAT)

    2.3 品種的多態(tài)性分析

    泰山紅星蘋果共擴增出558個條帶,其中多態(tài)性條帶351條,顯著多于其他3個種質,多態(tài)性比率最高,為62.9%,含有102條特有帶;沂蒙短枝紅星和紅星擴增出條帶分別為517、497條,多態(tài)性條帶分別為310、290條,特有帶分別為64和55條。金冠共擴增出380個條帶,多態(tài)性條帶173條,多態(tài)比例最低,為45.5%,其特有帶為59條(表3)。

    表3 4個蘋果品種多態(tài)性分析Table 3 Genetic diversity analysis of 4 varieties of apple

    2.4 遺傳相似系數分析

    4個品種間遺傳相似系數變化范圍為0.5846~0.7515,紅星、泰山紅星和沂蒙短枝紅星間遺傳相似系數較高,其中紅星和沂蒙短枝紅星間遺傳相似系數最高為0.7515。金冠與其他供試品種的遺傳相似系數都較小,說明其間遺傳距離較遠(表4)。

    表4 4個蘋果種質的遺傳相似系數Table 4 Genetic similarity coefficients of 4 varieties of four apple germplasm

    2.5 聚類分析

    基于AFLP的擴增結果,用NTSYS2·10進行UPGMA聚類分析,得到4個蘋果種質的親緣關系樹狀圖(圖2)。將聚類結果進行Mantel檢驗,相關系數為0.802,達到極顯著水平,表明聚類結果很好地體現了4個蘋果品種間的親緣關系。從聚類結果圖可以看出,AFLP標記可將供試的4個品種完全區(qū)分開。

    基于AFLP技術進行聚類分析,在遺傳相似系數閡值0.65處作切割線,將4個品種分為2類。第I為金冠,第Ⅱ類由3個品種組成,分別為紅星、泰山紅星和沂蒙短枝紅星,三者親緣關系較近,遺傳相似系數范圍為0.7050~0.7515。

    圖2 4個蘋果品種的UPGMA聚類圖Fig.2 UPGMAdendrograms of four apple cultivars

    3 結論與討論

    祝軍等[22]用AFLP分子標記的PstI/MseI體系的4對引物在25個品種中共擴增出了224條不同分子量DNA帶,4對引物共發(fā)現多態(tài)性位點122個,占55.0%,平均每條引物擴增56條不同分子量DNA帶,本研究采用AFLP分子標記的PstI/MseI體系篩選出了12對多態(tài)性較強且擴增產物清晰的引物組合,在4個蘋果品種中共擴增出826條DNA片段,其中多態(tài)性條帶為595條,多態(tài)性位點所占比例為72.0%,平均每條引物擴增69條不同分子量DNA帶,擴增DNA帶和多態(tài)性位點比例顯著提高,因此本AFLP分子標記技術體系可應用于蘋果遺傳多樣性與品種鑒定。

    蘋果分布較廣,基因組雜合度高,在長期的自然演化和種間雜交過程中,形成了生態(tài)適應性差異較大、數量龐大的變異新種和新的無性系,進行傳統(tǒng)的遺傳育種費時、費力且費用較高,近年來DNA分子標記技術在蘋果上的發(fā)展和應用,成為蘋果遺傳育種研究的重要方法和輔助育種手段[23]。本研究利用AFLP分子標記技術對3個元帥系蘋果品種的DNA標記結果表明,泰山紅星、沂蒙短枝紅星和紅星擴增出條帶分別為558、517、497條,其中多態(tài)性條帶分別為351、310、290條,說明3個元帥系蘋果品種的遺傳物質存在差異,需對其遺傳規(guī)律進行深入研究。

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