痛風(fēng)泄?jié)岱綄?duì)高尿酸血癥的治療機(jī)制

王慧超，張威，李鐵軍

(河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南　開(kāi)封　475000)

高尿酸血癥(HUA)是一種常見(jiàn)的慢性非傳染性代謝性疾病，早期臨床上常無(wú)明顯伴隨癥狀及體征，其危害性也往往被人們所忽視。高尿酸血癥是一種尿酸鹽超飽和狀態(tài)，當(dāng)超過(guò)其最大溶解度時(shí)可以析出結(jié)晶沉積關(guān)節(jié)處誘發(fā)炎癥進(jìn)而引起痛風(fēng)，因而HUA也通常被認(rèn)作是痛風(fēng)發(fā)生的最直接原因和生化基礎(chǔ)[1]。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，餐桌膳食搭配比例的改變以及人口老齡化趨勢(shì)，高尿酸血癥患病率在國(guó)內(nèi)外均呈現(xiàn)出上升趨勢(shì),成為嚴(yán)重危害大眾健康的主要疾患之一，我國(guó)成人高尿酸血癥的的患病率為8.4%～13.3%，對(duì)其防治刻不容緩[2-4]。

目前，HUA的治療可采用藥物和非藥物治療相結(jié)合的手段。臨床上常用降血尿酸的西藥主要為抑制尿酸生成和促進(jìn)尿酸排泄兩類(lèi)[5]。前者以別嘌醇片，后者以苯溴馬隆片、丙磺舒為代表。臨床降尿酸作用顯著，但與此同時(shí)，在服藥過(guò)程中的副作用也會(huì)不同程度的出現(xiàn)，如皮疹、消化道刺激、血液系統(tǒng)損害、肝腎功能損害等，嚴(yán)重時(shí)危及生命，影響患者的持續(xù)服藥，病情出現(xiàn)反復(fù)，一定程度上限制了其在臨床上的應(yīng)用[6-7]。尋找新型安全有效的降尿酸藥物也因此成為了國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。中醫(yī)藥治療從整體觀出發(fā)，辨證論治，標(biāo)本兼顧，同時(shí)注重個(gè)體差異，近年來(lái)通過(guò)采用健脾補(bǔ)腎、清熱利濕、活血化瘀等治則，在治療高尿酸血癥上取得了較好的療效，且副作用少，獲得了更多的關(guān)注[8]。但對(duì)于作用機(jī)理研究還相對(duì)不夠深入，因此通過(guò)中藥干預(yù)實(shí)驗(yàn)性高尿酸血癥,加強(qiáng)中醫(yī)藥治療HUA的作用機(jī)制研究,對(duì)本病的治療具有重要意義。

痛風(fēng)泄?jié)岱绞菍?dǎo)師根據(jù)長(zhǎng)期臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，結(jié)合眾多醫(yī)家的思想，在二妙散基礎(chǔ)上加味而成，臨床應(yīng)用中取得了較好的療效，具有明顯止痛，降低血尿酸作用。近年隨著流行病學(xué)的深入研究，發(fā)現(xiàn)HUA與代謝綜合征、心血管疾病、腎臟疾病等密切相關(guān)，因此，HVA發(fā)生與否也和系統(tǒng)性免疫炎性反應(yīng)存在一定的關(guān)系，炎癥因子在其中有怎樣的表現(xiàn)，都是這一領(lǐng)域亟待解決的問(wèn)題。目前我們對(duì)高尿酸血癥炎癥反應(yīng)過(guò)程中參與的炎癥因子及其機(jī)制仍未完全明確。本文擬通過(guò)觀察痛風(fēng)泄?jié)岱綄?duì)高尿酸血癥大鼠的IL-17/IL-23水平，進(jìn)一步驗(yàn)證其降尿酸療效，并初步探討其作用機(jī)制，為HUA的防治提供了一定的參考，也為本方今后臨床推廣應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD雄性SPF級(jí)健康大鼠60只,體質(zhì)量(200±20)g,購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、痛風(fēng)泄?jié)岱礁邉┝拷M、痛風(fēng)泄?jié)岱街袆┝拷M、痛風(fēng)泄?jié)岱降蛣┝拷M、別嘌醇組，每組10只。

1.2　主要試劑與藥物

1.2.1試劑

黃嘌呤氧化酶(XO)試劑盒(A002，南京建成生物技術(shù)有限公司)；BCA蛋白定量試劑盒(20201ES76，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；IL-17(ab119535)、IL-23 ELISA(ab64708)試劑盒，IL-17一抗(Abcam，ab79056)，IL-23一抗(Abcam，ab45420)，免疫組化二抗試劑盒(SP0023，北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；DAB顯色試劑盒(AR1022，武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2.2藥物

陽(yáng)性對(duì)照組藥物采用別嘌醇片(100 mg/片，上海信誼萬(wàn)象藥業(yè)股份有限公司，100片/盒，國(guó)藥準(zhǔn)字：H31020344)；造模藥物應(yīng)用鹽酸乙胺丁醇片(0.25 g/片，上海信誼藥廠有限公司，100片/盒，國(guó)藥準(zhǔn)字：H31021140)、腺嘌呤(AdenineAladdin industrial Corportion)；治療藥物藥物為痛風(fēng)泄?jié)岱剑翰捎弥兴幟饧孱w粒(深圳市三九現(xiàn)代中藥有限公司)，購(gòu)于淮河醫(yī)院草藥房。組方：黃柏15 g，蒼術(shù)15 g，防已20 g，苦參15 g，土茯苓30 g，澤瀉15 g，萆薢15 g，豬苓15 g，紅花15 g，桃仁15 g，川芎15 g，全蝎10 g，穿山甲10 g，青風(fēng)藤30 g，伸筋草30 g，共計(jì)生藥265 g。

1.3　主要儀器及耗材

酶標(biāo)儀(ELX800，BioTek)；微量臺(tái)式高速離心機(jī)(TG15-W，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司)；多功能全自動(dòng)生化分析儀(7180，日立)；生化培養(yǎng)箱(上海一恒科儀有限公司)；輪轉(zhuǎn)切片機(jī)(KD-1508A，科迪儀器)；快速勻漿器(SK96-A，江蘇新康醫(yī)療器械有限公司)；普通光學(xué)顯微鏡及拍照系統(tǒng)(上海光學(xué)儀器廠)；黏附載玻片(25 mm×75 mm，江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司)；精密電子分析天平(梅特勒)；85-2恒溫磁力攪拌器(江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠)。

2　方法

2.1　高尿酸血癥模型復(fù)制

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，參照文獻(xiàn)，取0.05 g/ml鹽酸乙胺丁醇和0.02 g/ml腺嘌呤進(jìn)行灌胃造模。上午9點(diǎn)給予腺嘌呤(100 mg/kg)+乙胺丁醇(250 mg/kg)進(jìn)行灌胃,1次/日；當(dāng)日下午2點(diǎn)給予蒸餾水灌胃，共14 d。

2.2　給藥方法

以成人體質(zhì)量60 kg計(jì)算，按人鼠藥物劑量換算1 kg大鼠劑量約為1公斤成人體重的6.3倍計(jì)算給藥量，不同劑量之間呈2倍遞增關(guān)系，設(shè)痛風(fēng)泄?jié)岱礁?、中、低生藥劑量組(24 g/kg、12 g/kg、6 g/kg)，分別配制成1.6 g/ml、0.8 g/ml、0.4 g/ml濃度藥液，按15 ml/kg灌胃，置于4℃冰箱備用；別嘌醇片給藥劑量為10 mg/kg，研末配制成0.68 mg/ml，按15 ml/kg灌胃，置于4℃冰箱備用。治療組處理如下：上午9點(diǎn)給予腺嘌呤(100 mg/kg)+乙胺丁醇(250 mg/kg)進(jìn)行灌胃,1次/日；當(dāng)日下午2點(diǎn)給予1.6 g/ml痛風(fēng)泄?jié)岱交?.68 mg/ml別嘌醇灌胃，給藥體積按15 ml/kg，共14 d。

2.3　指標(biāo)觀察方法

2.3.1一般情況觀察

每日密切觀察大鼠飲食、飲水、運(yùn)動(dòng)及尿量情況。

2.3.2血清X(qián)O檢測(cè)

設(shè)置空白管與測(cè)定管并標(biāo)記，每組取10份大鼠血清標(biāo)本，再次離心取上清液，分裝標(biāo)記置于冰盒上，提前取出試劑1、試劑4，前者置于水浴鍋融化(37℃水浴)，后者臨用前稀釋?zhuān)喜僮?；?zhǔn)備完畢后，空白管滴加60 μl蒸餾水，測(cè)定管滴加60 μl上清液，避光條件下兩管均依次滴加試劑1、2、3、4后混勻，37℃水浴20 min，隨后滴加試劑5，混勻，反應(yīng)液體積共2.33 ml，取200 μl加入微量樣板孔，采用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定OD值。

2.3.3IL-17、IL-23檢測(cè)

取大鼠血清，參照ELISA試劑盒操作說(shuō)明，通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)血清中IL-17、IL-23水平。

2.3.4腎組織病理學(xué)觀察

各組大鼠采血后，迅速置于操作臺(tái)，取腎組織，置于4%多聚甲醛中固定，8h后依次進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片(5 μm)，進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡觀察染色情況并進(jìn)行攝片分析。

2.3.5肝組織XO水平測(cè)定

取肝組織置于-80℃冰箱備用，實(shí)驗(yàn)前解凍標(biāo)本，每組選取10個(gè)標(biāo)本，均稱取0.35 g，分管標(biāo)記，按照1:9的比例(即重量：體積)加入0.9%生理鹽水3.15 ml，置于冰上，機(jī)械勻漿，勻漿液(10%)配制完汲取同體積用BCA法測(cè)定勻漿液蛋白濃度，余下勻漿液在3 000 r/min轉(zhuǎn)速條件下離心10 min，留取上清備測(cè)OD值，步驟同血清X(qián)O測(cè)定。

2.3.6腎臟組織中IL-17、IL-23表達(dá)檢測(cè)

組織切片脫蠟至水化，微波修復(fù)抗原，3% H2O2消除非特異性染色，正常山羊血清封閉，一抗過(guò)夜，二抗孵育，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。各實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)取5個(gè)標(biāo)本，各個(gè)標(biāo)本隨機(jī)拍照3個(gè)高倍視野，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。

2.4　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3　結(jié)果

3.1　一般狀態(tài)觀察

由于預(yù)實(shí)驗(yàn)熟練掌握了灌胃技術(shù)，在模型復(fù)制和灌胃過(guò)程中，未發(fā)生灌胃導(dǎo)致的死亡。與正常組比較，模型大鼠飲食、飲水量減少，活動(dòng)緩慢，毛色欠光澤，尿量明顯減少，各治療組與對(duì)照組一般情況無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.2　血清X(qián)O水平比較

如表1所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠XO水平明顯升高(P<0.01)，經(jīng)痛風(fēng)泄?jié)岱礁?中劑量預(yù)治療，XO水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)，但低劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組無(wú)明顯差異(P>0.05)。

表1　血清黃嘌呤氧化酶(XO)水平比較

注：與A組比較，**P<0.01;與B組比較，#P<0.05,##P<0.01

3.3　血清IL-17、IL-23水平比較

如表2所示，經(jīng)灌胃造模后，大鼠血清IL-17、IL-23水平明顯升高，從對(duì)照組(0.05±0.02)pg/ml，(0.03±0.01)pg/ml，升高至(41.64±11.23)pg/ml，(29.88±7.99)pg/ml，(P<0.05)， 痛風(fēng)泄?jié)岱礁邉┝拷MIL-17、IL-23水平較模型組明顯降低(23.65±6.85)pg/ml，(17.88±4.63)pg/ml，(P<0.05或P<0.01)，痛風(fēng)泄?jié)岱街袆┝拷MIL-17、IL-23水平也明顯降低(32.94±8.86)pg/ml，(9.67±5.97)pg/ml，(P<0.05或P<0.01)，低劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組比較無(wú)明顯差異(P>0.05)。

表2　血清IL-17、IL-23水平比較

注：與A組比較，**P<0.01；與B組比較，#P<0.05,##P<0.01

圖1　腎組織病理學(xué)改變(HE染色，400×)

3.4　腎組織病理學(xué)改變

如圖1所示。對(duì)照組：腎組織結(jié)構(gòu)正常，正常形態(tài)腎小球，結(jié)構(gòu)清楚、無(wú)硬化萎縮，腎間質(zhì)未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)區(qū)及管腔內(nèi)未見(jiàn)尿酸鹽結(jié)晶沉積，腎近曲及遠(yuǎn)曲小管上皮細(xì)胞未見(jiàn)腫脹，脫落，空泡變性表現(xiàn)，管腔無(wú)擴(kuò)大。模型組：大量腎小球出現(xiàn)萎縮現(xiàn)象，硬化，腎間質(zhì)可有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)表現(xiàn)，間質(zhì)區(qū)及管腔內(nèi)有較多尿酸鹽結(jié)晶沉積，大量腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)水腫，脫落，空泡變性，管腔擴(kuò)張明顯。痛風(fēng)泄?jié)岱礁邉┝拷M：少量腎小球有萎縮現(xiàn)象，但無(wú)硬化，腎間質(zhì)可有少量散在炎性細(xì)胞浸潤(rùn)表現(xiàn)，間質(zhì)區(qū)及管腔內(nèi)偶見(jiàn)尿酸鹽結(jié)晶沉積，小部分腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)水腫，脫落，空泡變性，管腔無(wú)明顯擴(kuò)張。痛風(fēng)泄?jié)岱街袆┝拷M：部分腎小球有萎縮現(xiàn)象，但無(wú)硬化，腎間質(zhì)可有少量散在炎性細(xì)胞浸潤(rùn)表現(xiàn)，間質(zhì)區(qū)及管腔內(nèi)可見(jiàn)少量尿酸鹽結(jié)晶沉積，部分腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)水腫，脫落，空泡變性，部分管腔明顯擴(kuò)張。痛風(fēng)泄?jié)岱降蛣┝拷M：部分腎小球出現(xiàn)萎縮、硬化，腎間質(zhì)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)區(qū)及管腔內(nèi)可見(jiàn)較多尿酸鹽結(jié)晶沉積，大量腎小管上皮細(xì)胞表現(xiàn)出水腫、脫落及空泡變性等特點(diǎn)，管腔擴(kuò)大明顯。別嘌醇組：部分腎小球出現(xiàn)萎縮、硬化，腎間質(zhì)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)區(qū)及管腔內(nèi)可見(jiàn)少量尿酸鹽結(jié)晶沉積，部分腎小管上皮細(xì)胞表現(xiàn)出水腫、脫落及空泡變性等特點(diǎn)，部分管腔明顯擴(kuò)張。

3.5　肝組織XO水平

由表3與對(duì)照組比較，模型組大鼠肝組織XO水平明顯升高(P<0.01)，經(jīng)痛風(fēng)泄?jié)岱礁?中劑量預(yù)治療，XO水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)，而低劑量組與模型組比較無(wú)明顯差異(P>0.05)。

表3　肝臟組織黃嘌呤氧化酶(XO)水平比較

注：與A組比較，**P<0.01；與B組比較，##P<0.01

3.6　腎臟組織中IL-17、IL-23表達(dá)

如圖2所示，免疫組化結(jié)果顯示：對(duì)照組大鼠腎組織內(nèi)可見(jiàn)到IL-17、IL-23表達(dá)微弱；病變組織內(nèi)IL-17、IL-23蛋白表達(dá)面積增加，顏色深，半定量分析統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，平均光密度較對(duì)照組明顯升高(P<0.05)，與模型組比較，痛風(fēng)泄?jié)岱礁摺⒅袆┝拷M大鼠腎組織內(nèi)IL-17、IL-23平均光密度明顯降低(P<0.05)，中劑量組和別嘌醇組較模型組平均光密度有下降趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表4。

圖2　腎臟組織中IL-17、IL-3表達(dá)情況比較

組別nIL-17IL-23對(duì)照組(A)100.397±0.0670.185±0.049模型組(B)100.693±0.094**0.498±0.091**痛風(fēng)泄?jié)岱礁邉┝拷M(C)100.467±0.066#0.301±0.010#痛風(fēng)泄?jié)岱街袆┝拷M(D)100.508±0.087#0.395±0.072#痛風(fēng)泄?jié)岱降蛣┝拷M(E)100.602±0.0960.446±0.083別嘌醇組(F)100.612±0.1080.417±0.089

注：與A組比較，**P<0.01；與B組比較，##P<0.01

4　討論

高尿酸血癥(HUA)是一種常見(jiàn)的非傳染性代謝性疾病，隨著物質(zhì)生活改善、膳食搭配比例改變以及人口老齡化，高尿酸血癥患病率在國(guó)內(nèi)外均呈上升趨勢(shì)。鑒于高尿酸血癥的高患病率及與其他疾病并發(fā)，世界衛(wèi)生組織將高尿酸血癥列入代謝綜合征范疇，已成為繼糖尿病之后的第二大代謝類(lèi)疾病，對(duì)其防治刻不容緩[2]。

HUA的發(fā)生有基因缺陷、尿酸合成增多或(和)排泄障礙等。前期的研究發(fā)現(xiàn),HUA常伴發(fā)高血壓、脂代謝紊亂、糖代謝異常、肥胖等，因此慢性低毒炎癥反應(yīng)貫穿始終；痛風(fēng)是尿酸鹽微結(jié)晶觸發(fā)體內(nèi)炎癥反應(yīng)而導(dǎo)致的急性發(fā)作，由此我們是否也可以推測(cè)在未發(fā)展至痛風(fēng)的長(zhǎng)期高尿酸血癥的患者其體內(nèi)也存在慢性低度炎癥，從而引發(fā)血管內(nèi)皮損傷[9]。炎性細(xì)胞因子具有多種生物學(xué)效應(yīng)，是一類(lèi)主要由免疫系統(tǒng)細(xì)胞生成的內(nèi)源性多肽，亦可介導(dǎo)多種免疫反應(yīng)。近幾年，人們對(duì)代謝性疾病的發(fā)病機(jī)制的研究不斷深入，多項(xiàng)研究指出：低度的慢性的系統(tǒng)性炎性反應(yīng)也是代謝性疾病發(fā)生的核心之一，同時(shí)也是代謝綜合征各個(gè)組分間的聯(lián)系點(diǎn)和紐帶。因此，本文從炎癥因子的角度探討高尿酸血癥的發(fā)生機(jī)制及痛風(fēng)泄?jié)岱降闹委煓C(jī)制。

IL-17是首次在小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的新型促炎性細(xì)胞因子[10]，2007年發(fā)現(xiàn)IL-17是由一類(lèi)從CD4+T細(xì)胞分化而來(lái)的名為T(mén)h17的細(xì)胞分泌的[11-12]，目前研究已證實(shí)，IL-17與多種自身免疫病發(fā)病機(jī)制有關(guān)，被認(rèn)為具有介導(dǎo)炎性反應(yīng)、自身免疫性疾病等重要免疫調(diào)節(jié)作用[13-15]。IL-23是IL-12分子家族中的促炎性細(xì)胞因子，參與機(jī)體控制 感染和自身免疫性疾病發(fā)生[16]。IL-23對(duì)于維持Thl7細(xì)胞增殖和存活有重要的意義和作用，IL-23還可以顯著增強(qiáng)IL-17的分泌和產(chǎn)生[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，HUA血清及組織中IL-17及IL-23水平和表達(dá)均明顯升高，提示細(xì)胞因子是HUA病理過(guò)程中重要的發(fā)病機(jī)制，而痛風(fēng)泄?jié)岱皆诮档脱蛩崴?，改善腎損傷能的同時(shí)，有效抑制血清及組織IL-17及IL-23水平和蛋白表達(dá)，表明痛風(fēng)泄?jié)岱娇赡芡ㄟ^(guò)抑制炎性細(xì)胞因子起到降低血尿酸的治療作用。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為,HUA患病原因總體歸于尿酸生成增多或(和)排泄障礙兩方面因素[18-19]。尿酸生成方面，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為體內(nèi)參與嘌呤代謝相關(guān)酶的活性異常是導(dǎo)致尿酸合成增多的重要因素，其中XO作為嘌呤代謝終末階段的關(guān)鍵酶，直接調(diào)控尿酸的合成，影響顯著并且也已成為開(kāi)發(fā)降尿酸新藥的重要靶點(diǎn)[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型大鼠血清及組織中XO水平明顯增高，高、中劑量的痛風(fēng)泄?jié)岱侥苡行Ц纳七@種高XO狀態(tài)，提示痛風(fēng)泄?jié)岱娇赡芡ㄟ^(guò)抑制XO活性起到降低血尿酸的治療作用。但XO與IL-23/IL-17在HUA發(fā)病過(guò)程中的因果關(guān)系，目前尚未見(jiàn)任何報(bào)道，這些研究?jī)?nèi)容將是我們課題組今后重點(diǎn)研究的重點(diǎn)。

綜上，痛風(fēng)泄?jié)岱娇捎行Ы档蛯?shí)驗(yàn)大鼠血尿酸水平，改善腎功能，改善實(shí)驗(yàn)大鼠腎臟病理?yè)p害，保護(hù)修復(fù)腎單位，減輕腎組織炎癥反應(yīng)。痛風(fēng)泄?jié)岱浇档脱蛩崴降臋C(jī)制可能與抑制實(shí)驗(yàn)大鼠血清及肝XO活性，下調(diào)腎小管IL-17/IL-23蛋白表達(dá)有關(guān)。