龍牙肝泰膠囊抗肝纖維化的藥效學研究

張玉昆，馮月男，卞敬琦，遲文成，隋雨桐，姜廣坤，牛雯穎，姜慶輝，李陸軍*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江　哈爾濱　150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江　哈爾濱　150040)

肝纖維化是諸多致病因素導致肝細胞發(fā)生壞死、凋亡及炎癥反應時，肝內纖維結締組織異常增生與沉積的病理過程，是慢性肝病重要的病理特征，也是進一步向肝纖維化發(fā)展的主要中間環(huán)節(jié)[1]。當前研究結果認為,肝炎病毒、血吸蟲感染、酒精損傷、藥物代謝、膽汁淤積、化學中毒、代謝障礙等均可引起肝纖維化。大量研究表明，肝星狀細胞(HSC)的活化與細胞外基質(ECM)代謝失衡是肝纖維化的重要機制，已經證實ECM來源于HSC，HSC活化后分泌大量ECM，造成ECM代謝失衡，進而形成肝纖維化。

龍牙楤木又名遼東楤木，為五加科植物龍牙楤木[Araliaelata(Miq.)Seem.]的干燥根皮及莖皮[2]。龍牙肝泰膠囊是將龍牙楤木根、莖皮粉碎成粗粉，加90%乙醇加熱回流提取等工藝制成的膠囊劑，龍牙肝泰膠囊作為純中藥制劑，上市近15年，患者群累計超過500萬人。對患者群用藥效果進行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，龍牙肝泰膠囊對病毒性肝損傷、酒精性肝損傷有顯著的保肝護肝作用，對脂肪肝、肝纖維化、肝腹水等病癥與其他藥物配合使用有明顯的治療改善作用[3-4]。本實驗旨在觀察肝纖維化模型大鼠血清中谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)、透明質酸(HA)、層黏連蛋白(LN)、Ⅳ型膠原(CⅣ)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、肝組織病理組織學檢查的改變以及肝臟組織中金屬蛋白酶抑制劑(TIMP-1)、基質金屬蛋白酶(MMP-1)水平,探討龍牙肝泰膠囊抗肝纖維化的作用機制，為臨床用藥提供指導。

1　材料與儀器

1.1　藥品與試劑

葵花護肝片(陽性對照藥物，黑龍江葵花藥業(yè)股份有限公司)；龍牙肝泰膠囊(實驗受試藥物，黑龍江久久藥業(yè)有限責任公司)；AST、ALT測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；大鼠血清HA、LN、CⅣ和PCⅢ酶聯(lián)免疫試劑盒(南京安培化工科技有限公司)；TIMP-1、MMP-1試劑盒(上海森雄科技實業(yè)有限公司)；四氯化碳(CCl4,分析純，沈陽化學試劑廠)。

1.2　實驗動物

SD雄性大鼠，體質量160～180 g，室溫飼養(yǎng)，自由進食。由黑龍江中醫(yī)藥大學藥物安全性評價中心(黑龍江中醫(yī)藥大學GLP)提供，動物合格證編號：SCXK(黑)200804001。

1.3　實驗儀器

分析天平(梅特勒)；魅力2000全自動生化分析儀；博塞全自動酶標儀；moticam 3000顯微攝影成像系統(tǒng)(美國motic公司)；Image-pro plus6.0病理圖像分析系統(tǒng)。

2　實驗方法

2.1　實驗分組

取SD大鼠60只，按體質量隨機分為龍牙肝泰膠囊高、中、低劑量組，正常對照組(空白組)，纖維化組(模型組)，葵花護肝片對照組(陽對組)，每組10只，共6組。

2.2　模型建立與給藥方案

每日上午8時左右，除空白組外，其余各組動物，按1 ml/kg體質量灌胃給予油劑CCl4，將CCl4與橄欖油等比例混合配成50%的油劑CCl4，每周灌胃2次，每周稱重，按體質量調整給藥劑量；空白組按1 ml/kg體質量灌胃給予橄欖油，持續(xù)8周。每日下午15時左右給予藥物干預，每周5次，持續(xù)8周。各組給藥劑量分別為：低劑量組42 mg/kg，中劑量組84 mg/kg，高劑量組168 mg/kg，陽對組545 mg/kg；模型組與空白組動物按10 ml/kg體質量給予生理鹽水。

2.3　指標檢測

末次給藥2 h后，乙醚麻醉，腹主動脈取血，3 000 r/min離心制備血清，測定血清中谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)、透明質酸(HA)、層黏連蛋白(LN)、Ⅳ型膠原(CⅣ)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)水平,取肝臟組織部分液氮冷凍(-70℃保存),測定TIMP-1、MMP-1水平，另一部分用10%福爾馬林固定進行病理學檢查。

2.4　統(tǒng)計學處理

采用SPSS16.0軟件對各組數(shù)據結果進行t檢驗，結果用均值加減標準差的形式表示，P≤0.05表示具有統(tǒng)計學差異。

3　結果

3.1　龍牙肝泰膠囊對肝纖維化大鼠肝功能的影響

實驗結果表明,模型組與空白組比較，大鼠血清中AST、ALT水平極顯著性升高(P<0.01)；龍牙肝泰膠囊各劑量組、陽對組與模型組比較，血清中AST、ALT水平均極顯著性降低(P<0.01)。結果見表1。

表1　龍牙肝泰膠囊對肝纖維化大鼠血清中AST、ALT水平的影響

注：與模型組比較，P<0.01；與空白組比較，P<0.01

3.2　龍牙肝泰膠囊對大鼠血清中肝纖維化標志物的影響

實驗結果表明，模型組與空白組比較，血清中肝纖維化標志物中HA、LN、CⅣ、PCⅢ水平均極顯著性升高(P<0.01)。與模型組比較，高劑量組、陽對組，能極顯著性降低肝纖維化大鼠血清中HA、LN、CⅣ水平(P<0.01)，顯著性降低PCⅢ水平(P<0.05)；中劑量組能極顯著性降低肝纖維化大鼠血清中HA水平，顯著性降低LN、CⅣ水平(P<0.05)，對PCⅢ水平有降低的趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；低劑量組能顯著性降低肝纖維化大鼠血清中HA水平(P<0.05)，對LN、CⅣ、PCⅢ水平有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義。結果見表2。

表2　龍牙肝泰膠囊對肝纖維化大鼠血清中HA、LN、CⅣ、PCⅢ水平的影響

注：與模型組比較，P<0.01，P<0.05；與空白組比較，P<0.01

3.3　龍牙肝泰膠囊對肝纖維化大鼠肝組織中TIMP-1、MMP-1水平的影響

實驗結果表明,模型組與空白組比較，大鼠肝臟組織中TIMP-1水平顯著性升高(P<0.05)；陽對組、高劑量組與模型組比較,大鼠肝組織中TIMP-1水平顯著性降低(P<0.05)；中、低劑量組大鼠肝組織中TIMP-1水平有降低的趨勢，但無統(tǒng)計學意義。模型組與空白組比較，大鼠肝臟組織中MMP-1水平極顯著性降低(P<0.01)；陽對組與模型組比較,肝纖維化大鼠肝組織中MMP-1水平顯著性升高(P<0.05)；高劑量與模型組比較,肝纖維化大鼠肝組織中MMP-1水平極顯著性升高(P<0.01)；中、低劑量組與模型組比較,肝纖維化大鼠肝組織中MMP-1水平有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結果見表3。

表3　龍牙肝泰膠囊對肝纖維化大鼠肝臟組織中TIMP-1、MMP-1水平的影響

注：與模型組比較，P<0.01,*P<0.05；與空白組比較，P<0.01,△P<0.05

3.4　龍牙肝泰膠囊對肝纖維化大鼠肝臟組織病理學的影響結果

空白組：細胞排列整齊，界限清晰，細胞核正常，無胞質融合，無纖維化，無炎性細胞，見圖1。

模型組：細胞排列紊亂，細胞質與細胞核界限不清晰，細胞核固縮，胞質融合，呈現(xiàn)脂肪變性，局部出現(xiàn)纖維化，呈彌散性病變，散在許多血細胞及炎細胞，見圖2。

陽對組：細胞排列基本整齊，細胞核成圓形，肝細胞無變性壞死，少見炎性細胞，見圖3。

高劑量組：細胞排列整齊，界限清晰，細胞核呈圓形，無胞質融合，無肝細胞壞死變性，見圖4。

中劑量組：細胞排列略有紊亂，胞質見少量融合，胞漿呈疏松，見炎性細胞及變性細胞，見圖5。

低劑量組：細胞排列不齊，界限不清，細胞核大多呈圓形，局部纖維化及少量血細胞，見圖6。

圖1　空白組HE染色圖(400×)

圖2　模型組HE染色圖(400×)

圖3　陽對組HE染色圖(400×)

圖4　高劑量組HE染色圖(400×)

圖5　中劑量組HE染色圖(400×)

圖6　低劑量組HE染色圖(400×)

4　討論

肝纖維化是肝臟組織大量膠原沉著富集為特點的病變，多數(shù)肝纖維化過程中，都伴隨著肝細胞的損傷、變性、壞死等病理改變[5]。CCl4慢性中毒所致肝纖維化與臨床肝纖維化形成的過程極為相似，主要包括過氧化反應、肝組織酶的活化、炎癥反應等。上述反應均可引起細胞損傷，肝細胞代謝失衡。病生理指標表現(xiàn)為谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)水平的升高、肝纖維化標志物HA、LN、CⅣ、PCⅢ水平升高等。這一系列性的改變與肝星狀細胞(HSC)的活化與細胞外基質(ECM)代謝失衡密切相關。當過量的ECM產生時，會被金屬蛋白酶抑制劑(MMP)降解，同時基質金屬蛋白酶(TIMP)又能抑制MMP的活性，所以，MMP與TIMP之間的平衡穩(wěn)定是保護肝細胞正常的前提[6]。

龍牙肝泰膠囊內容物是龍牙楤木醇提物，主要成分是皂苷，水解后的苷元以齊墩果酸為主。研究發(fā)現(xiàn),龍牙楤木醇提物具有抗炎、抗腫瘤、保肝、護肝等藥理作用[7-8]。作為純中藥制劑，龍牙肝泰膠囊已在市場銷售15年，降酶保肝作用顯著，對肝纖維化、脂肪肝、肝硬化療效顯著。本實驗通過對肝纖維化大鼠模型肝功能、肝纖維化標志物、病理檢查以及肝組織中MMP-1與TIMP等指標的系統(tǒng)性研究可以發(fā)現(xiàn),龍牙肝泰膠囊對肝纖維化大鼠有明顯的治療作用，其作用機制可能與維持肝細胞的穩(wěn)定性、降低肝細胞損傷、各型膠原的累積、穩(wěn)定HSC的活化、使金屬蛋白抑制劑與基質金屬蛋白酶處于動態(tài)平衡等相關。肝纖維化致病因素與形成過程還尚未完全明確，故對龍牙肝泰膠囊的藥理作用與臨床適用證的增加也有待進一步研究探討。