蘆薈多糖對(duì)免疫功能影響的實(shí)驗(yàn)研究

朱鴻哲

(哈爾濱體育學(xué)院，黑龍江　哈爾濱　150001)

蘆薈[Aloeveravar.chinesis(haw.)Berg.]為百合科植物蘆薈或同屬植物的葉汁干燥品，含有蒽醌類化合物、糖類、氨基酸和各種有機(jī)酸、活性酶等多種化學(xué)成分[1]?！侗静輩R言》中就有“蘆薈，涼肝殺蟲之藥也，凡屬肝臟為病，有熱者，用之必?zé)o疑也。但味極苦，氣極寒，諸苦寒無(wú)出其右者”的記載[2]?，F(xiàn)代研究表明，已知蘆薈含有160多種化學(xué)成分，其中有生物活性或藥理作用的成分不少于100種，但就其特殊性和功效而言，主要包括蒽醌類化合物和蘆薈多糖兩大類。其中蘆薈多糖因其具有調(diào)節(jié)免疫、防輻射、抗腫瘤[3]等現(xiàn)代藥理作用而受到廣泛關(guān)注。

中醫(yī)學(xué)自《黃帝內(nèi)經(jīng)》起就把“治未病”作為主導(dǎo)思想，而“治未病”的重心就在于增強(qiáng)機(jī)體的免疫力、提高機(jī)體的抗病能力[4-6]。蘆薈作為一種傳統(tǒng)且易得的藥用植物，如能將其增強(qiáng)免疫的機(jī)理與傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論相結(jié)合，無(wú)疑將帶來(lái)巨大的現(xiàn)實(shí)意義。近年來(lái)，有大量的研究報(bào)道涉及蘆薈多糖的增強(qiáng)免疫功能，但對(duì)其作用機(jī)理的研究并不透徹，本實(shí)驗(yàn)著重研究蘆薈多糖在單核-巨噬細(xì)胞功能、NK細(xì)胞活性兩個(gè)方面的作用，以期闡明其增強(qiáng)免疫作用的機(jī)理。

1　材料和方法

1.1　樣品

蘆薈多糖：自制。取庫(kù)拉索蘆薈，原料清洗→去皮稱重→打漿→按比例加水→加熱浸提(超聲波處理30 min)→抽濾→清液保留，殘?jiān)偬崛?，合并提取液→濃縮→除蛋白→加95%乙醇沉淀→復(fù)溶后再加95%乙醇沉淀，反復(fù)3次→無(wú)水乙醇洗滌沉淀多糖→低溫真空干燥→蘆薈粗多糖[7]。

1.2　動(dòng)物

80只清潔級(jí)、雄性、體質(zhì)量18～22 g的KM小鼠，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供，許可證號(hào)：SCXK(黑)2013-001；飼料由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供，許可證號(hào)：SCXK(黑)2013-001；飼養(yǎng)環(huán)境為清潔級(jí)環(huán)境，溫度(23±2)℃，濕度(55±10)%。

1.3　分組及給藥

取120只小鼠，按體質(zhì)量隨機(jī)分成3個(gè)免疫實(shí)驗(yàn)組，每個(gè)免疫實(shí)驗(yàn)組設(shè)3個(gè)劑量組：260 mg/kg·BW(高劑量組，相當(dāng)于成人推薦劑量的20倍)、195 mg/kg·BW(中劑量組，相當(dāng)于成人推薦劑量的15倍)、130 mg/kg·BW(低劑量組，相當(dāng)于成人推薦劑量的10倍)，同時(shí)設(shè)立一個(gè)陰性對(duì)照組。第一免疫實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行碳廓清試驗(yàn)，第二免疫實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)，第三免疫實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行NK細(xì)胞活性測(cè)定試驗(yàn)。

各劑量組配制方法如下：高劑量組取樣品2 g加蒸餾水研磨至154 mL、中劑量組取樣品1.6 g加蒸餾水研磨至164 mL，低劑量組取樣品1 g加蒸餾水研磨至154 mL。各組動(dòng)物均按20 mL/kg·BW分別經(jīng)口灌胃，給予不同濃度的受試物，陰性對(duì)照組給予等容積蒸餾水作為對(duì)照。連續(xù)灌胃30天后，進(jìn)行相關(guān)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.4　主要儀器與試劑

動(dòng)物天平(德國(guó)Sartorius公司，BSA2201型)；紫外可見分光光度計(jì)(北京普析公司，TU-1901型)；二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Fisher公司，3111型)；酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司，Sunrise型)；電子天平(瑞士METTLER公司，AL204型)；離心機(jī)(德國(guó)SIGMA公司，6-16K型)；顯微鏡(日本OLYMPUS公司，BX53型)；智能循環(huán)水浴(德國(guó)IKA公司，IC control pro 20 c型)；恒溫恒濕培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Fisher公司，F(xiàn)orma3913)；無(wú)菌解剖器械、細(xì)胞計(jì)數(shù)板、紗布、載玻片、玻璃平皿、離心管、培養(yǎng)板。

RPMI 1640培養(yǎng)液(GIBCO公司，批號(hào)8113016)；胎牛血清(杭州天杭生物科技有限公司，批號(hào)121017)；青-鏈霉素(吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，批號(hào)11102101)；Giemsa染液(Sigma公司，批號(hào)BCBF9150)；氯化鈉注射液(哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)110723A9)。

1.5　試驗(yàn)方法

1.5.1小鼠碳粒廓清試驗(yàn)[8-9]

小鼠經(jīng)尾靜脈注射墨汁，按每10 g體質(zhì)量0.1 mL計(jì)算，在墨汁注射后2 min及10 min時(shí)，分別從小鼠眼眶靜脈叢采血20 μL，即刻加入到2 mL的0.1%濃度Na2CO3溶液中，同時(shí)以0.1%濃度的Na2CO3溶液調(diào)零，用紫外可見分光光度計(jì)(波長(zhǎng)600 nm)測(cè)OD值。將小鼠處死取脾臟及肝臟，稱重并計(jì)算各組小鼠的吞噬指數(shù)α。

1.5.2半體內(nèi)法測(cè)定小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)[8-10]

制備雞紅細(xì)胞(CRBC)懸液：將雞血放置在有玻璃珠的錐形瓶中脫纖，將錐形瓶以單一方向晃動(dòng)，加0.9%氯化鈉注射液反復(fù)洗滌2次，離心10 min去上清液(2 000 r/min)后以0.9%氯化鈉注射液將其配制成20%的CRBC懸液。

每只小鼠腹腔注射以上述方法制備的20%的CRBC懸液1 mL，30 min后脫臼處死小鼠，將其仰臥位固定，沿腹壁正中線剖開皮膚，經(jīng)腹腔注射0.9%氯化鈉注射液，輕輕晃動(dòng)固定板1 min后吸出腹腔洗液1 mL，各取0.5 mL分別滴于2個(gè)載玻片上，置于濕盒移置37℃恒溫培養(yǎng)箱孵育30 min。取出后用0.9%氯化鈉注射液漂洗以除懸浮細(xì)胞，晾干，以丙酮甲醇溶液(1∶1)固定后，用4%吉姆薩磷酸緩沖液染色，再用蒸餾水漂洗晾干。計(jì)算吞噬指數(shù)以及吞噬百分率。

1.5.3NK細(xì)胞活性測(cè)定[8-9]

處死小鼠，取其脾臟剪碎，過200目篩，用Hank's液反復(fù)將其洗滌3次，用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，使其終濃度調(diào)整為2×107個(gè)/mL。選用U型底96孔板，每只小鼠細(xì)胞懸液平行做3孔，均各取100 μL；靶細(xì)胞自然釋放孔(3孔)加培養(yǎng)液及靶細(xì)胞體積各100 μL；靶細(xì)胞最大釋放孔(3孔)加1% NP40及靶細(xì)胞體積各100 μL。于37℃ 5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后取出，離心5 min(1 500 r/min)，從每孔中吸取上清液100 μL，將其置于平底96孔板中，同時(shí)在每孔中分別加入基質(zhì)液100 μL。計(jì)時(shí)3 min后每孔加入濃度為1 moL/L的鹽酸溶液30 μL以終止反應(yīng), 在酶標(biāo)儀波長(zhǎng)為490 nm處測(cè)定各反應(yīng)孔吸光度, 并計(jì)算NK細(xì)胞活性。

1.6　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1　小鼠碳粒廓清試驗(yàn)

由表1可知，經(jīng)口灌胃給予不同劑量的蘆薈多糖30天后，與陰性對(duì)照組比較，各組小鼠碳粒廓清吞噬指數(shù)具有不同程度的增加，其中高劑量組與陰性對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。即蘆薈多糖具有增強(qiáng)小鼠碳粒廓清的功能。

表1　蘆薈多糖對(duì)小鼠碳粒廓清試驗(yàn)的影響

注：與陰性對(duì)照組比較，*P<0.05

2.2　小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)(半體內(nèi)法)

由表2可知，經(jīng)口給予小鼠不同劑量蘆薈多糖30天后，各劑量組吞噬百分率、吞噬指數(shù)與陰性對(duì)照組比較，均有不同程度的增加，其中高劑量組與陰性對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說(shuō)明蘆薈多糖有增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的功能。

表2　蘆薈多糖對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)(半體內(nèi)法)的影響

注：與陰性對(duì)照組比較，*P<0.05

2.3　NK細(xì)胞活性測(cè)定

由表3可知，經(jīng)口給予小鼠不同劑量蘆薈多糖30天后，小鼠NK細(xì)胞活性試驗(yàn)高、中劑量組NK細(xì)胞活性與陰性對(duì)照組比較，均有顯著性差異(P<0.05)。故蘆薈多糖對(duì)NK細(xì)胞活性有增強(qiáng)作用。

表3　蘆薈多糖對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性測(cè)定的影響

注：與陰性對(duì)照組比較，*P<0.05

3　討論

蘆薈是一種古老而傳統(tǒng)的常用中藥，國(guó)內(nèi)外研究表明，蘆薈多糖具有廣譜的調(diào)節(jié)免疫、抗輻射、抗艾滋病病毒、抗?jié)儭⒔笛?、降血糖、抗氧化等藥理活性[11-13]，此外對(duì)腦缺血具有保護(hù)作用[14-15]。而在眾多的藥理作用中，蘆薈多糖的調(diào)節(jié)免疫作用受到了最廣泛的認(rèn)可。

人體的免疫反應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞學(xué)過程，蘆薈多糖調(diào)節(jié)機(jī)體免疫的能力不僅能作用于免疫器官，如胸腺、脾臟等，同時(shí)能激活免疫細(xì)胞，如淋巴細(xì)胞、白細(xì)胞等，而且有著促進(jìn)抗體生成等功效，從而起著整體免疫調(diào)節(jié)作用[3]。巨噬細(xì)胞是天然免疫系統(tǒng)重要的效應(yīng)細(xì)胞之一，具有免疫防御、免疫監(jiān)視、免疫調(diào)節(jié)以及抗原呈遞等多種免疫功能，在機(jī)體的免疫系統(tǒng)中起重要作用[16]。自然殺傷細(xì)胞是人體質(zhì)量要的免疫細(xì)胞，一方面與免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤以及抗病毒感染有著密切的關(guān)系，另一方面也在某些特定條件下參與機(jī)體的超敏反應(yīng)以及機(jī)體自身免疫性疾病的發(fā)生。被活化的NK細(xì)胞能夠分泌并合成TNF-α、TNF-β等多種細(xì)胞因子，共同發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫以及造血作用，并直接殺傷靶細(xì)胞。

本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)口給予小鼠不同劑量蘆薈多糖30天后，鼠碳粒廓清試驗(yàn)及小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)(半體內(nèi)法)高劑量組與陰性對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；NK細(xì)胞活性測(cè)定高、中劑量組與陰性對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，顯示蘆薈多糖在單核-巨噬細(xì)胞功能、NK細(xì)胞活性兩個(gè)方面均具有增強(qiáng)免疫功能的作用，其在細(xì)胞免疫和體液免疫方面的作用，有待于進(jìn)一步研究。