新疆野山杏總黃酮對小鼠鎮(zhèn)痛作用考察

谷虹霏，戴小華，阿依姑麗·艾合麥提，賈楠楠，張少鵬，楊若藍

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆　烏魯木齊　830052)

野山杏具有豐富的營養(yǎng)價值和廣泛的藥理學(xué)功效，含有多種黃酮類化合物，這是近年來被廣為關(guān)注的天然產(chǎn)物之一。大量研究表明，黃酮類化合物具有抗氧化[1]、降血脂[2]、抗炎[3]、鎮(zhèn)痛[4]、保肝[5]和抗腫瘤[6]等多種藥理作用。黃酮類化合物與化學(xué)合成藥物相比毒性較小，與嗎啡和阿司匹林的作用機制不同，是一類新型的鎮(zhèn)痛藥物[7]。有研究表明,小葉榕葉總黃酮[8]也具有良好的鎮(zhèn)痛作用，對緩解疼痛疾病的治療具有重要意義。

本研究在張華[9]和劉江波[10]的研究基礎(chǔ)上以新疆野山杏為材料，采用有機溶劑超聲提取法及大孔吸附樹脂純化法，純化新疆野山杏總黃酮；通過建立小鼠疼痛模型[11-12]，對新疆野山杏總黃酮的鎮(zhèn)痛作用進行考察，為進一步開發(fā)新疆野山杏的藥用價值提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料及試劑

野山杏果肉(采自新疆哈密伊吾縣)；蘆丁標(biāo)品(上海源葉生物科技有限公司)；醋酸(遼寧東寧藥業(yè)有限公司)；阿司匹林(BJ-27466，拜耳醫(yī)藥保健有限公司)；生理鹽水(石家莊四藥有限公司)；無水乙醇、甲醇、亞硝酸鈉、硝酸銀、氫氧化鈉(天津市致遠化學(xué)試劑有限公司)。

昆明種小鼠由新疆醫(yī)科大學(xué)動物中心提供，許可證號為SYXK-新2003-0001。

1.2　設(shè)備與儀器

超聲波藥品處理機(JBT/C-YCL400T/3P(D,濟寧金百特工程機械有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE-52B，上海亞榮化儀器廠)；可見分光光度計(723，上海欣茂儀器有限公司)；循環(huán)水多用真空泵(SHB-Ⅲ，鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-S，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9246A，上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；電子天平(SL202N，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)；智能熱板儀(RB-200，成都泰盟科技有限公司)。

1.3　實驗方法

1.3.1樣品制備

張均、張垍為唐朝玄宗時期的宰相張說之子，頗受唐玄宗器重，分別在朝中擔(dān)任過重要官職。張均為張說長子，曾任大理寺卿一職；張垍為張說次子，為當(dāng)朝駙馬。二人在安史之亂中投靠于安祿山，并分別在其軍中擔(dān)任偽中書令、宰相之職。安史之亂被平定之后，二人結(jié)局或死或發(fā)配。但究竟孰死孰生，《資治通鑒》記載與《舊唐書》《新唐書》《冊府元龜》記載并不相同。

取一定量的野山杏果實干燥、粉碎，過40目篩，加50倍量體積分?jǐn)?shù) 50%乙醇超聲1 h，提取2次，抽濾，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，大孔樹脂純化干燥后得野山杏總黃酮。用生理鹽水將野山杏總黃酮配制為所需的濃度，4℃保存?zhèn)溆肹1]。

1.3.2動物準(zhǔn)備

昆明種小鼠100只，體質(zhì)量(21±2)g，雌雄各50只。實驗前小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，挑選飲水、進食以及活動正常的小鼠納入實驗。

1.3.3野山杏總黃酮的含量測定

1.3.3.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20.00 mg于棕色容量瓶中，用60%乙醇溶液定容至100 mL，搖勻，得到濃度為0.20 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.00，2.00，3.00，4.00，5.00，6.00，7.00，8.00，9.00 mL，分別置于25 mL 棕色容量瓶中，分別滴加50 g/L亞硝酸鈉溶液0.7 mL，混勻，靜置6 min，再分別滴加100 g/L硝酸鋁溶液0.7 mL，混勻，靜置6 min，再加40 g/L氫氧化鈉溶液5 mL，最后用甲醇定容至25 mL，搖勻，放置10 min。取配制好的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，在UV2550紫外分光光度計510 nm處測定吸光度，以吸光值A(chǔ)為縱坐標(biāo)、蘆丁濃度C為橫坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線[1]。

1.3.3.2含量測定

稱取“1.3.1”制備的樣品20.0 mg，用60%乙醇溶液溶解并定容至100 mL容量瓶中。吸取2 ml配制好的樣品溶液于25 mL棕色容量瓶中，按照蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法分別滴加50 g/L亞硝酸鈉溶液0.7 mL、40 g/L氫氧化鈉溶液5 mL、100 g/L硝酸鋁溶液0.7 mL，最后用60%乙醇定容至刻度線，搖勻。在510 nm處測定野山杏總黃酮的吸光度，每組平行測3次，根據(jù)吸光度并結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到總黃酮含量[1]。

1.3.4小鼠醋酸扭體實驗

取50只雌雄各半的昆明種小鼠，按每組10只隨機分為高劑量組(15 mg/kg)、中劑量組(11 mg/kg)、低劑量組(7.5 mg/kg)、陽性對照組(阿司匹林10 mg/kg)、空白對照組(生理鹽水)。野山杏總黃酮、阿司匹林和生理鹽水為小鼠灌胃給藥，每日給藥1次，連續(xù)3天，第3天給藥前12 h禁食，不禁水。第3天給藥30 min后，以1%醋酸溶液0.2 ml 皮下注射，30 min后記錄小鼠10 mim內(nèi)扭體次數(shù)，以此作為痛閾指標(biāo)[11]。藥物對扭體反應(yīng)的抑制率為：

1.3.5小鼠熱板致痛實驗

取50只雌性昆明種小鼠，按每組10只隨機分為高劑量組(15 mg/kg)、中劑量組(11 mg/kg)、低劑量組(7.5 mg/kg)、陽性對照組(阿司匹林10 mg/kg)、空白對照組(生理鹽水)。將小鼠放置在恒溫55℃的熱板上，以小鼠出現(xiàn)舔足反應(yīng)的時間作為痛閾指標(biāo)，其中舔足反應(yīng)為熱刺激小鼠足部產(chǎn)生疼痛的反應(yīng)。實驗前篩選痛閾5～30 s者為合格實驗鼠，給藥前測定小鼠舔足反應(yīng)時間2次，2次測量間隔5 min，取其平均值作為基礎(chǔ)痛閾。野山杏總黃酮、阿司匹林和生理鹽水為小鼠灌胃給藥，每日給藥1次，連續(xù)3天，第3天給藥后10、30、60 min測定痛閾指標(biāo)[12]。

1.3.6小鼠溫浴甩尾實驗

取50只雌雄各半的昆明種小鼠，按每組10只隨機分為高劑量組(15 mg/kg)、中劑量組(11 mg/kg)、低劑量組(7.5 mg/kg)、陽性對照組(阿司匹林10 mg/kg)、空白對照組(生理鹽水)。將小鼠尾尖浸入48℃恒溫水中約5 cm，以小鼠出現(xiàn)甩尾反應(yīng)的時間作為痛閾指標(biāo)，其中甩尾反應(yīng)指熱刺激小鼠尾部產(chǎn)生疼痛的反應(yīng)。實驗前預(yù)選痛閾5～30 s者為合格實驗鼠，給藥前測小鼠舔足反應(yīng)時間2次，2次測量間隔5 min，取其平均值作為基礎(chǔ)痛閾。野山杏總黃酮、阿司匹林或生理鹽水為小鼠灌胃給藥，每日給藥1次，連續(xù)3天，第3天給藥2 h后測定每只小鼠熱板致痛實驗的痛閾指標(biāo)[11]。

1.4　數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)用Excel進行處理，數(shù)據(jù)分析用SPSS19.0進行分析，采用單因素方差分析。

2　結(jié)果

2.1　蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可知，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為：A=11.162C+0.012 2(R2=0.999)，說明在0.016～0.072 mg/mL的范圍內(nèi)蘆丁質(zhì)量濃度C與吸光度A之間有良好的線性關(guān)系。

圖1　蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2　野山杏總黃酮的含量

在UV2550紫外分光光度計510 nm處測定野山杏總黃酮的吸光度，每組平行3次測定，取平均值。根據(jù)測定的吸光度值結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得出總黃酮含量為817 mg/mL。

2.3　野山杏總黃酮對小鼠醋酸扭體反應(yīng)的影響

各劑量組對小鼠扭體反應(yīng)的抑制情況見表1。與空白對照組比較，野山杏總黃酮低、中、高劑量組和陽性對照組均具有極顯著性差異(P<0.01)，其中野山杏總黃酮低、中、高劑量組疼痛抑制率分別為16.57%、26.12%、51.68%。結(jié)果表明,野山杏總黃酮低、中、高劑量組和陽性對照組均能明顯減少醋酸致痛模型中小鼠扭體次數(shù)，具有一定的劑量依賴性，隨著劑量增大，抑制疼痛作用越強。

表1　不同劑量野山杏總黃酮對醋酸致小鼠扭體反應(yīng)的影響

注：與空白對照組比較，**P<0.01

2.4　野山杏總黃酮對小鼠熱板舔足反應(yīng)的影響

如表2所示，與空白對照組比較，野山杏總黃酮高、中、低劑量組均可明顯延長小鼠舔足反應(yīng)時間，抑制小鼠的疼痛舔足反應(yīng)，具有明顯鎮(zhèn)痛作用。其中，野山杏總黃酮的高、中劑量組在60 min內(nèi)均具有明顯延長熱板法致痛模型中小鼠痛閾的作用(P<0.01)。

表2　不同劑量野山杏總黃酮對熱板致小鼠舔足反應(yīng)的影響

注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.5　野山杏總黃酮對小鼠溫浴甩尾反應(yīng)的影響

如表3所示,野山杏總黃酮野山杏總黃酮低、中、高劑量組和陽性對照組與空白對照組相比,均明顯延長小鼠甩尾反應(yīng)時間(P<0.01)。野山杏總黃酮的低劑量對熱板致痛的小鼠痛閾具有一定的抑制作用，野山杏總黃酮的高劑量可明顯延長溫浴致痛模型中小鼠的痛閾(P<0.01)，具有顯著的鎮(zhèn)痛作用。

表3　不同劑量野山杏總黃酮對溫浴致小鼠甩尾反應(yīng)的影響

注：與空白對照組比較，**P<0.01

3　討論

野山杏總黃酮是從野山杏果肉中提取的有效成分,且總黃酮大多具有抗炎、鎮(zhèn)痛等藥理作用。張蓓蓓等[7]研究表明，滁菊總黃酮的鎮(zhèn)痛作用機制可能與促進血清和腦組織中NO的釋放，抑制其前列腺素E2的生成有關(guān)，其中可能有部分中樞機制參與。因此本實驗采用熱板致痛法、溫浴致痛法和扭體致痛法3種不同類型經(jīng)典小鼠疼痛模型[11-12]，觀察新疆野山杏總黃酮的鎮(zhèn)痛作用。其中，熱板致痛法、溫浴致痛法屬于熱刺激，代表的是小鼠軀體體表痛，而醋酸致痛法則屬于化學(xué)刺激，代表的是小鼠體內(nèi)內(nèi)臟痛。熱板致痛法、溫浴致痛法引起的是急性疼痛，而醋酸致痛法引起的是緊張性的病理性疼痛[13-14]。熱板致痛法和溫浴致痛法主要利用小鼠足趾和尾部對熱刺激十分敏感的特點，小鼠主要表現(xiàn)為舔足，甩尾，縮尾等反應(yīng)；醋酸致痛法將醋酸注入小鼠腹腔，引起腹膜炎，誘導(dǎo)產(chǎn)生病理性疼痛，以此來考察新疆野山杏總黃酮的鎮(zhèn)痛作用。

在本實驗中，野山杏總黃酮高、中、低劑量組均對醋酸致小鼠疼痛扭體反應(yīng)有明顯的抑制作用。這與余行等[15]研究中大葉紫珠總黃酮高、中、低劑量組均具有明顯鎮(zhèn)痛作用的研究結(jié)果一致。野山杏總黃酮高、中、低劑量組均可顯著延長熱板致小鼠疼痛舔足反應(yīng)時間，具有明顯提高小鼠舔足反應(yīng)痛閾的作用。這與俸婷婷等[16]研究桑白皮總黃酮對熱板致小鼠疼痛舔足反應(yīng)無明顯抑制作用的結(jié)論不一致。溫浴致小鼠疼痛實驗中，野山杏總黃酮高、中、低劑量組能明顯提高小鼠甩尾反應(yīng)痛域，特別是高劑量組作用明顯。通過3種不同類型經(jīng)典小鼠疼痛模型實驗觀察得出新疆野山杏總黃酮可明顯抑制小鼠疼痛反應(yīng)，隨著劑量的增加，抑制作用越明顯，痛閾相應(yīng)提高，具有一定的劑量依賴性。野山杏總黃酮具有明顯得鎮(zhèn)痛作用，因此可以認為野山杏鎮(zhèn)痛作用的有效成分是總黃酮，但具體的黃酮成分有待進一步研究。

由于熱板法、溫浴法同是熱刺激的急性疼痛模型，在實驗設(shè)計過程中，采用熱板致痛小鼠疼痛模型觀察小鼠給藥后10 min，30 min，60 min后疼痛反應(yīng)的痛閾提高率。溫浴致痛小鼠疼痛模型觀察給藥2 h后疼痛反應(yīng)的痛閾提高率。通過2種熱刺激疼痛模型觀察不同時間范圍內(nèi)野山杏總黃酮對小鼠疼痛反應(yīng)時間和痛閾提高率的影響，由表2分析可知，在給藥2 h后，熱刺激致小鼠疼痛反應(yīng)痛域呈先增長后降低的趨勢，在30 min到60 min范圍達到峰值。在熱板致痛實驗中，隨著時間的增加，在給藥10 min～30 min內(nèi)，野山杏總黃酮高、中、低劑量組對小鼠舔足反應(yīng)痛域提高幅度較大，30 min～60 min內(nèi)，痛域提高幅度較小。然而本研究中新疆野山杏總黃酮純化后純度較高，鎮(zhèn)痛作用顯著，小鼠疼痛模型實驗中對小鼠灌胃新疆野山杏總黃酮藥劑量設(shè)置有限，其最佳藥效劑量和最佳藥效作用時間還有待進一步研究確定。

綜上所述，本實驗考察了新疆野山杏總黃酮的鎮(zhèn)痛作用，結(jié)果顯示野山杏總黃酮具有顯著的鎮(zhèn)痛作用。但是在最佳藥效作用時間和劑量以及其主要作用成分，還有待進一步研究。本研究為新疆本土特色資源開發(fā)利用提供研究基礎(chǔ)，具有十分重要的意義。