FAC對體外培養(yǎng)皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞分化率的影響

焦玲玲　焦倩　杜希恂　李勇　張培　姜宏

[摘要]目的探討不同濃度檸檬酸鐵銨（FAC）對體外培養(yǎng)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）細(xì)胞活力和分化率影響。

方法體外培養(yǎng)胚胎14～15 d的皮質(zhì)NSCs；應(yīng)用CCK8細(xì)胞增殖和毒性檢測試劑盒檢測經(jīng)FAC處理后NSCs細(xì)胞活力的改變，免疫熒光染色檢測Nestin、βtubulin Ⅲ和膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）陽性細(xì)胞，Western Blot檢測NSCs的βtubulin Ⅲ和GFAP蛋白表達(dá)水平。

結(jié)果分離培養(yǎng)的皮質(zhì)NSCs能增殖形成神經(jīng)球，且經(jīng)分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)后可分化為βtubulin Ⅲ或GFAP陽性的細(xì)胞。不同濃度（10～100 mg/L）的FAC均可降低細(xì)胞活力（F=55.86，q=9.154～15.880，P<0.01）。不同濃度的FAC不影響NSCs的βtubulin Ⅲ和GFAP蛋白表達(dá)水平（P>0.05）。

結(jié)論FAC可降低皮質(zhì)NSCs細(xì)胞活力，但不影響NSCs向神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的分化比例。

[關(guān)鍵詞]神經(jīng)干細(xì)胞；鐵；細(xì)胞活力；細(xì)胞分化

[中圖分類號]R329.2

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號] 20965532（2018）02017205

神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）是存在于胚胎腦部和成熟個體中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有增殖和多向分化潛能的一類細(xì)胞，可通過對稱性分裂進(jìn)行增殖和自我更新，通過不對稱性分裂分化成為神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞等[14]。因其具有增殖和多向分化潛能，NSCs移植可彌補(bǔ)丟失的神經(jīng)元，成為神經(jīng)系統(tǒng)疾病細(xì)胞替代治療的可行性方案之一[58]。但移植入體內(nèi)的NSCs的存活、凋亡、增殖和分化受到宿主機(jī)體內(nèi)微環(huán)境的影響，因此研究影響NSCs存活和分化的因素對干細(xì)胞移植治療至關(guān)重要[910]。越來越多的研究顯示了金屬鐵與神經(jīng)退行性疾病有密切聯(lián)系，如帕金森?。≒D）和阿爾茲海默?。ˋD）等[1113]。近年來研究表明，PD病人黑質(zhì)致密帶的鐵含量升高明顯，水平異常升高的鐵可能通過促進(jìn)活性氧（ROS）的生成，損傷多巴胺（DA）能神經(jīng)元[1415]。有研究顯示，AD病人腦內(nèi)的海馬和皮質(zhì)區(qū)鐵沉積明顯增加[16]。有文獻(xiàn)報道，給予高鐵飲食的新生小鼠紋狀體內(nèi)鐵明顯增多，且腦干和紋狀體內(nèi)羥自由基水平增高[17]。因此，移植于腦內(nèi)的NSCs的存活和分化可能受到高鐵微環(huán)境的影響。然而，高鐵環(huán)境對NSCs分化率的影響尚未見報道。檸檬酸鐵銨（FAC）是一種廣泛應(yīng)用于制備鐵負(fù)載模型的三價鐵[1819]，可造成細(xì)胞內(nèi)的高鐵狀態(tài)。本文通過體外培養(yǎng)皮質(zhì)NSCs，外源性給予FAC的方法，觀察不同濃度的FAC對皮質(zhì)NSCs細(xì)胞活力和分化率的影響。

1材料和方法

1.1實(shí)驗材料

Wistar大鼠（購自北京維通利華實(shí)驗動物技術(shù)有限公司），F(xiàn)AC（Sigma公司），DMEM/F12培養(yǎng)液（Hyclone公司），表皮生長因子（EGF）、堿性成纖維生長因子（bFGF）、N2 supplement、B27 supplement和胎牛血清（Gibco公司），兔源βactin抗體（CST公司），小鼠源βtubulin Ⅲ抗體、山羊抗鼠IgG熒光二抗（Invitrogen公司），辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠和山羊抗兔IgG二抗（Absin公司），4，6二氨基2苯基吲哚（DAPI）細(xì)胞核染色液（Roche公司）。

1.2皮質(zhì)NSCs的培養(yǎng)和鑒定

取孕14～15 d大鼠胚胎大腦皮質(zhì)部位組織，機(jī)械剪碎和吹打后過濾離心，細(xì)胞計數(shù)后種植在培養(yǎng)瓶中，置于溫度37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的無菌孵箱中培養(yǎng)，使用含有DMEM/F12、體積分?jǐn)?shù)0.02的B27 supplement、體積分?jǐn)?shù)0.01的N2 supplement、10 μg/L的bFGF、20 μg/L的EGF、10 g/L青霉素和鏈霉素混合液的完全培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。NSCs培養(yǎng)4～5 d時進(jìn)行傳代，傳至第3代時，將100 μL的NSCs種植于多聚賴氨酸包被的玻片上，密度為（1～2）×108/L，使用含體積分?jǐn)?shù)0.01胎牛血清的分化培養(yǎng)液進(jìn)行誘導(dǎo)分化，分化7 d后用預(yù)冷的40 g/L多聚甲醛固定NSCs，免疫熒光染色后觀察細(xì)胞分化情況。

1.3免疫熒光染色

NSCs經(jīng)固定后封閉，加入小鼠源單克隆抗體（βtubulin Ⅲ、GFAP、Nestin），于4 ℃孵育過夜；洗脫后加山羊抗鼠IgG熒光二抗（1∶500）室溫孵育1～2 h，加入DAPI室溫染色5～15 min后洗脫并封片，熒光顯微鏡下觀察、拍照。

1.4細(xì)胞活力檢測

將第3代的皮質(zhì)NSCs傳代種植于96孔板，每孔100 μL，種植密度為（1～2）×108/L，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后加入不同濃度（0、10、50和100 mg/L）的FAC，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。在測定前的2～4 h，每孔加入10 μL的CCK8溶液，然后將96孔板置于POLARstar+OPTIMA微板測試儀上檢測，檢測波長為450 nm。以吸光度值為縱軸、時間為橫軸計算細(xì)胞活力的變化。

1.5Western Blot檢測

種植于6孔板的細(xì)胞加裂解液提取蛋白質(zhì)，采用BCA法測蛋白濃度。按每孔20 μg蛋白上樣，蛋白經(jīng)SDSPAGE電泳后電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，于室溫下用100 g/L的脫脂奶粉封閉1 h，加入相應(yīng)一抗（兔源βactin抗體及小鼠源βtubulinⅢ、GFAP抗體），于4 ℃孵育過夜，洗脫后用1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，ECL發(fā)光液顯影，UPV凝膠成像系統(tǒng)成像后用Image J軟件讀取條帶的灰度值。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS和GraphPad Prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果以[AKx-D]±s表示，組間比較采用Oneway ANOVA檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1NSCs的培養(yǎng)和鑒定

在皮質(zhì)NSCs培養(yǎng)5 d時可增殖成直徑200～300 μm的神經(jīng)球。免疫熒光染色顯示，神經(jīng)球細(xì)胞Nestin陽性，說明皮質(zhì)NSCs能保持神經(jīng)干細(xì)胞的增殖特性（圖1A）；皮質(zhì)NSCs經(jīng)誘導(dǎo)分化7 d后，可見βtubulin Ⅲ陽性的神經(jīng)元和GFAP陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞（圖1B），說明皮質(zhì)NSCs具有多向分化潛能，可向神經(jīng)元或星形膠質(zhì)細(xì)胞分化。

2.2FAC對NSCs細(xì)胞活力的影響

NSCs經(jīng)10、50和100 mg/L的FAC處理后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，檢測細(xì)胞活力分別為0.133±0.009、0.087±0.006、0.086±0.008。與不給予FAC處理的對照組（0.198±0.024）相比，10、50和100 mg/L FAC處理組NSCs細(xì)胞活力均顯著降低（n=4，F(xiàn)=55.86，q=9.154～15.880，P<0.01）；與10 mg/L FAC處理組相比較，50和100 mg/L FAC處理組NSCs細(xì)胞活力均顯著下調(diào)（q=6.537、6.729，P<0.01）；50和100 mg/L FAC處理組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

2.3FAC對NSCs分化率的影響

Western Blot檢測顯示，與不給予FAC處理的對照組相比較，10、50和100 mg/L FAC處理組的βtubulin Ⅲ和GFAP蛋白表達(dá)水平均無顯著變化（n=3，P>0.05）。見圖2。

3討論

NSCs是腦內(nèi)具有增殖分裂和多向分化潛能的神經(jīng)母細(xì)胞。本研究應(yīng)用免疫熒光染色法證實(shí)，體外培養(yǎng)的大鼠胚胎皮質(zhì)NSCs可增殖形成神經(jīng)球，且隨著培養(yǎng)時間的延長，細(xì)胞數(shù)量增多，體積變大，培養(yǎng)至第5天時，神經(jīng)球細(xì)胞呈Nestin陽性，證明培養(yǎng)的干細(xì)胞具備NSCs增殖分裂的特性。NSCs還可向多種神經(jīng)細(xì)胞分化，如分化為神經(jīng)元（DA能、膽堿能、GABA能）、星形膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞等。本文研究結(jié)果顯示，皮質(zhì)NSCs經(jīng)誘導(dǎo)分化7 d后，可以出現(xiàn)GFAP陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞和βtubulin Ⅲ陽性的神經(jīng)元，進(jìn)一步證實(shí)NSCs的多向分化潛能。NSCs的分化可以受到多種因素的調(diào)控，除了受內(nèi)在基因的調(diào)控，更受到周圍復(fù)雜微環(huán)境的影響[2021]。

鐵是人體必需的微量元素，是許多生物大分子的重要組成部分，參與了生命的基本活動，在腦內(nèi)還參與了神經(jīng)遞質(zhì)和髓鞘的合成[2225]。PD病人黑質(zhì)總鐵含量較同年齡的健康人高70%左右，鐵水平增高可促進(jìn)H2O2生成羥自由基[20]。本文研究結(jié)果顯示，10～100 mg/L的FAC可降低皮質(zhì)NSCs細(xì)胞活力，進(jìn)一步證實(shí)了過量的鐵對細(xì)胞的毒性作用。氧化應(yīng)激增強(qiáng)、自由基生成增多均可造成氧化損傷，并能引起細(xì)胞死亡[2627]。有研究表明，胞內(nèi)高鐵可通過芬頓反應(yīng)產(chǎn)生過量的ROS，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[18，28]。近年來發(fā)現(xiàn)的鐵死亡是一種細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡被打亂并形成鐵離子依賴的氧化性死亡方式，鐵聚集和鐵依賴的脂質(zhì)形成及胞質(zhì)ROS生成是鐵死亡的重要因素[13，18，2930]，但目前還沒有文獻(xiàn)報

道鐵死亡是否參與了NSCs的死亡。有研究顯示， FAC可能通過芬頓反應(yīng)產(chǎn)生的ROS促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化[31]。然而，也有研究表明，F(xiàn)AC對軟骨細(xì)胞的分化起到抑制作用[32]。本研究觀察到，F(xiàn)AC不影響體外培養(yǎng)皮質(zhì)NSCs向神經(jīng)元或星形膠質(zhì)細(xì)胞的分化比例，可能FAC對不同細(xì)胞分化的影響具有特異性，其機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。

綜上所述，F(xiàn)AC可降低皮質(zhì)NSCs的存活能力，進(jìn)而影響神經(jīng)再生，但對皮質(zhì)NSCs的分化無顯著影響。

[參考文獻(xiàn)]

[1]TITOMANLIO L， KAVELAARS A， DALOUS J， et al. Stem cell therapy for neonatal brain injury：perspectives and challenges[J]. Annals of Neurology， 2011，70（5）：698712.

[2]BEIER D， HAU P， PROESCHOLDT M， et al. CD133（+） and CD133（-） glioblastomaderived cancer stem cells show differential growth characteristics and molecular profiles[J]. Cancer Research， 2007，67（9）：40104015.

[3]RISPOLI R， CONTI C， CELLI P， et al. Neural stem cells and glioblastoma[J]. Neuroradiol J， 2014，27（2）：169174.

[4]CHOI H W， KIM J S， CHOI S， et al. Neural stem cells differentiated from iPS cells spontaneously regain pluripotency[J]. Stem Cells （Dayton， Ohio）， 2014，32（10）：25962604.

[5]ROSSIGNOL J， FINK K， DAVIS K， et al. Transplants of adult mesenchymal and neural stem cells provide neuroprotection and behavioral sparing in a transgenic rat model of Huntingtons disease[J]. Stem Cells（Dayton， Ohio）， 2014，32（2）：500509.

[6]KANG X J， XU H D， TENG SASA， et al. Dopamine release from transplanted neural stem cells in Parkinsonian rat striatum in vivo[J]. Proceedings of the National Academy of

Sciences of the United States of America， 2014，111（44）：1580415809.

[7]LEE I S， JUNG K， KIM I S， et al. Human neural stem cells alleviate Alzheimerlike pathology in a mouse model[J]. Molecular Neurodegeneration， 2015，10（1）：116.

[8]KIM S U， LEE H J， KIM Y B. Neural stem cellbased treatment for neurodegenerative diseases[J]. Neuropathology， 2013，33（5）：491504.

[9]GIUSTO E， DONEGA M， COSSETTI C， et al. Neuroimmune interactions of neural stem cell transplants：from animal disease models to human trials[J]. Experimental Neurology， 2014，260（5）：1932.

[10]LU P， GRAHAM L， WANG Yaozhi， et al. Promotion of survival and differentiation of neural stem cells with fibrin and growth factor cocktails after severe spinal cord injury[J]. Journal of Visualized Experiments：JoVE， 2014（89）：e50641.

[11]HADZHIEVA M， KIRCHES E， MAWRIN C. Review：iron metabolism and the role of iron in neurodegenerative disorders[J]. Neuropathology and Applied Neurobiology， 2014，40（3）：240257.

[12]DUCE J A， TSATSANIS A， CATER M A， et al. Ironexport ferroxidase activity of βamyloid precursor protein is inhibited by Zinc in Alzheimers disease[J]. Cell， 2010，142（6）：857867.

[13]WARD R， ZUCCA F A， DUYN J H， et al. The role of iron in brain ageing and neurodegenerative disorders[J]. Lancet Neurology， 2014，13（10）：10451060.

[14]FISCHER R， MAIER O. Interrelation of oxidative stress and inflammation in neurodegenerative disease：role of TNF[J]. Oxidative Medicine and Cellular Longevity， 2015， 2015：610813.

[15]DIAS V， JUNN E， MOURADIAN M M. The role of oxidative stress in Parkinsons disease[J]. Journal of Parkinsons disease， 2013，3（4）：461491.

[16]UVERSKY V N， LI J， FINK A L. Metaltriggered structural transformations， aggregation， and fibrillation of human alphasynuclein.A possible molecular NK between Parkinsons di

sease and heavy metal exposure[J]. The Journal of Biological Chemistry， 2001，276（47）：4428444296.

[17]BATISTANASCIMENTO L， PIMENTEL C， MENEZES R A， et al. Iron and neurodegeneration：from cellular homeostasis to disease[J]. Oxidative Medicine and Cellular Longevity， 2012， 2012（1）：128647.

[18]LI S W， LIU C M， GUO J， et al. Iron overload induced by ferric ammonium citrate triggers reactive oxygen speciesme

diated apoptosis via both extrinsic and intrinsic pathways in human hepatic cells[J]. Human & Experimental Toxicology， 2016，35（6）：598607.

[19]KAUR D， PENG Jun， CHINTA S J， et al. Increased murine neonatal iron intake results in Parkinsonlike neurodegeneration with age[J]. Neurobiology of Aging， 2007，28（6）：907913.

[20]SOMMER L， RAO M. Neural stem cells and regulation of cell number[J]. Progress in Neurobiology， 2002，66（1）：118.

[21]HARE D J， ARORA M， JENKINS N L， et al. Is earlylife iron exposure critical in neurodegeneration[J]？ Nature Reviews Neurology， 2015，11（9）：536544.

[22]POLIN V， CORIAT R， PERKINS G， et al. Iron deficiency：from diagnosis to treatment[J]. Digestive and Liver Disease， 2013，45（10）：803809.

[23]SANGANI R G， GHIO A J. Iron， human growth， and the global epidemic of obesity[J]. Nutrients， 2013，5（10）：42314249.

[24]MUNOZ P， HUMERES A. Iron deficiency on neuronal function[J]. Biometals： an International Journal on the Role of Metal ions in Biology， Biochemistry， and Medicine， 2012，25（4）：825835.

[25]WARD R J， CRICHTON R R， TAYLOR D L， et al. Iron and the immune system[J]. Journal of Neural Transmission（Vienna， Austria：1996）， 2011，118（3）：315328.