醫(yī)用幾丁糖對兔腱骨愈合和肌腱粘連的影響

王曉龍　李肯　李利平　趙夏　翟申浩　于騰波

[摘要]目的探討醫(yī)用幾丁糖在兔肩袖肌腱修復術(shù)后對兔腱骨愈合和肌腱及周圍組織粘連的影響。方法挑選18只成年健康雄性新西蘭大白兔，建立肩袖損傷動物模型，然后隨機分為醫(yī)用幾丁糖組（A組）和生理鹽水對照組（B組），每組9只。兩組均于岡上肌切斷后2周行腱骨縫合，重建岡上肌止點，并按分組進行藥物處理。術(shù)后6周應用大體解剖觀察、肌腱吻合處粘連程度等級評分和組織學檢查等方法，系統(tǒng)評價醫(yī)用幾丁糖對腱骨愈合和肌腱及周圍組織粘連的影響。

結(jié)果術(shù)后6周，A組肌腱及周圍組織粘連程度輕于B組，差異有統(tǒng)計學意義（H=50.879，P<0.05）；與B組相比，A組軟骨細胞增生明顯（t=12.408，P<0.05），肌腱處成纖維細胞數(shù)量明顯減少（t=8.687，P<0.05）。A組無明顯脂肪浸潤，而B組可見脂肪空泡。A組成纖維細胞排列緊密，排列方向與正常肌腱細胞方向大致相同，其內(nèi)可見少量新生毛細血管，整體愈合與正常兔肩袖組織較為相似，愈合良好；B組的成纖維母細胞及成纖維細胞排列紊亂無序，無明顯毛細血管增生，整體愈合較差。

結(jié)論醫(yī)用幾丁糖在促進腱骨愈合的同時，也減少了肌腱及周圍組織粘連的發(fā)生。

[關(guān)鍵詞]幾丁糖；回旋套損傷；腱骨愈合；組織粘連；兔

[中圖分類號]R684.8

[文獻標志碼]A

[文章編號] 20965532（2018）02016206

肩袖損傷是好發(fā)于中老年人的肩關(guān)節(jié)疾患，其發(fā)病率占肩關(guān)節(jié)疾病的17%～40%[1]，是引起病人肩部疼痛和肩關(guān)節(jié)活動受限的主要原因。近年來，隨著關(guān)節(jié)鏡技術(shù)的不斷發(fā)展，關(guān)節(jié)鏡下肩袖損傷修補術(shù)已成為肩袖損傷最主要的治療方式[2]。但是，肩袖的愈合過程非常復雜，既涉及內(nèi)源性愈合機制，又涉及外源性愈合機制[3]。在內(nèi)源性愈合過程中，肌腱細胞增殖并產(chǎn)生細胞外基質(zhì)；在外源性愈合過程中，肌腱成纖維細胞增生并破壞肌腱末端，雖然這是愈合過程中所必需的，但也會導致肌腱粘連[4]。另外，關(guān)節(jié)鏡下肩袖修補術(shù)后6周內(nèi)病人都要進行肩關(guān)節(jié)制動，但制動時間長易導致肌肉萎縮和關(guān)節(jié)粘連[5]。肌腱及周圍組織粘連可導致關(guān)節(jié)僵硬及活動不利，嚴重影響肩關(guān)節(jié)術(shù)后功能康復。因此，如何預防術(shù)后肌腱及周圍組織粘連和后期的關(guān)節(jié)僵硬，

已成為骨外科的重要研究課題之一。迄今為止，國內(nèi)外針對肩袖修補術(shù)后存在的肌腱及周圍組織粘連尚未找到比較理想的治療方法。隨著醫(yī)學研究的迅速發(fā)展，發(fā)現(xiàn)預防粘連的生物制劑如透明質(zhì)酸、幾丁糖及聚乳酸等可降低術(shù)后肌腱及周圍組織粘連的發(fā)生率[6]。目前大量的實驗研究已初步證實，醫(yī)用幾丁糖具有預防或減輕肌腱損傷肌腱吻合后肌腱粘連的作用[710]。既往研究主要關(guān)注的是幾丁糖在預防或減輕肌腱吻合后肌腱粘連中的作用，而本實驗著重研究的是幾丁糖對腱骨愈合和肌腱及周圍組織粘連的影響。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1動物骨骼成熟的健康雄性新西蘭大耳白兔（由青島大學實驗動物中心提供）18只，3～5月齡，體質(zhì)量2.5～3.0 kg。單籠普通飼養(yǎng)，術(shù)前觀察1周確認體健無疾病。

1.1.2主要器械與試劑組織切片機（德國Leica公司）、恒溫電熱水浴箱（北京醫(yī)療設備廠）、光學顯微鏡（日本OLYMPUS公司）、天平、電子秤；醫(yī)用幾丁糖液體敷料（長沙海潤生物有限公司）、水合氯醛、青霉素及制片用制劑。

1.2實驗方法

1.2.1兔肩袖損傷模型構(gòu)建用電子秤稱取10 g水合氯醛粉劑，溶于濃度為100 mL滅菌注射用水中，配制成100 g/L水合氯醛溶液。將兔稱質(zhì)量后，以100 g/L水合氯醛溶液按2.5 mL/kg行耳緣靜脈注射，麻醉深度為趾蹼反射消失。麻醉成功后將兔固定于兔手術(shù)臺上，于肩背部及雙上肢備皮至足底，然后用碘附消毒，鋪洞巾。在肩關(guān)節(jié)肱骨大結(jié)節(jié)處做長約2 cm的縱形皮膚切口，切開皮下筋膜，鈍性分離三角肌，暴露岡上肌肌腱大結(jié)節(jié)止點處，然后沿腱骨愈合處銳性切斷岡上肌肌腱末端，并在斷端肌腱邊緣處切除0.5 cm×0.5 cm的肌腱組織形成全層肩袖損傷，將切斷的岡上肌肌腱邊緣用絲線打結(jié)標記，便于后期手術(shù)時準確定位（圖1A～D）。檢查無活動性出血后逐層關(guān)閉切口。觀察家兔自然蘇醒，置單籠兔籠中飼養(yǎng)，患肢不制動。

1.2.2兔肩袖損傷的修復于岡上肌切斷后2周行腱骨縫合，重建岡上肌止點；沿原切口暴露岡上肌肌腱造?？冢浞炙山鈱霞∨c周圍組織的粘連，在大結(jié)節(jié)表面用骨磋去皮質(zhì)化處理；用復位巾鉗于肱骨大結(jié)節(jié)處打骨道（圖1E），用2號愛惜邦縫線以改良的MasonAllen方式對岡上肌腱行腱骨縫合，將岡上肌拉回縫合于原解剖止點（圖1F）。

1.2.3分組及藥物處理肩袖損傷模型建立后，將18只兔隨機分為醫(yī)用幾丁糖組（A組）和生理鹽水對照組（B組），每組9只。A組于肌腱縫合口內(nèi)及周圍用注射器注入醫(yī)用幾丁糖溶液0.2 mL，注射量的標準是在腱鞘內(nèi)肌腱縫合處均勻注滿（圖1G），以40絲線逐層縫合肌肉皮膚。B組于肌腱縫合口內(nèi)及周圍用注射器均勻注入生理鹽水0.2 mL，以40絲線逐層縫合肌肉皮膚。

1.2.4固定及術(shù)后預防感染術(shù)后用醫(yī)用高分子石膏將肘關(guān)節(jié)固定于屈曲90°位1周（圖1H），1周后拆除石膏，正?；顒印Ｔ炷：? d，肌肉注射青霉素4×105 U預防感染。術(shù)后10 d切口拆線，正常飼養(yǎng)。

1.3觀察指標

兩組兔均于術(shù)后6周處死，取實驗肌腱標本，首先進行解剖觀察，對岡上肌腱吻合處進行粘連等級分級，然后進行組織學檢查，并比較兩組軟骨細胞和成纖維細胞數(shù)。

1.3.1解剖觀察沿原手術(shù)切口切開皮膚筋膜，暴露縫合后的岡上肌腱，觀察岡上肌腱周圍組織的病理性變化、吻合口周圍肌腱顏色、岡上肌腱表面是否光滑、岡上肌腱與周圍組織的粘連情況、岡上肌腱的滑動性。肌腱及周圍組織粘連程度按照湯錦波的TAM五級評分法[11]進行粘連等級分級。Ⅰ級：肌腱周圍無粘連存在，但可以有少量肉芽組織；Ⅱ級：少量膜樣、束帶狀粘連，局限于縫合處，對肌腱滑動基本無影響；Ⅲ級：小塊狀或?qū)拵钍杷烧尺B，纖維細長、疏松、質(zhì)軟，肌腱滑動部分受限；Ⅳ級：中等程度粘連，向縫合點遠近蔓延，肌腱滑動明顯受限或幾乎不能滑動；Ⅴ級：致密粘連，肌腱與鞘管壁、皮下緊密相連，不易分離，范圍廣，肌腱無任何滑動。

1.3.2組織學檢查完成粘連等級分級后，迅速切下縫合口周圍長約1.5 cm的肌腱組織和骨組織。以40 g/L甲醛溶液浸泡組織標本24 h后進行脫鈣處理。脫鈣結(jié)束以自來水沖洗標本后，清除關(guān)節(jié)周圍軟組織，用銳利刀片將標本沿腱骨移行方向縱向切開，修整標本為約1.0 cm×0.5 cm×0.5 cm大小的組織塊，脫水、透明、浸蠟、包埋及切片。對石蠟切片進行蘇木精伊紅（HE）染色，在光學顯微鏡下進行觀察、分析，照相。

選取染色滿意的切片，每張切

片隨機取5個固定測量窗（測量窗面積10 000 μm），應用計算機系統(tǒng)（Image Pro Plus6）于高倍光鏡（100倍）下計數(shù)腱骨愈合區(qū)域附近1 mm范圍內(nèi)的成纖維細胞及軟骨細胞。

1.4統(tǒng)計學分析

應用SPSS 12.0軟件進行統(tǒng)計學分析。肌腱及周圍組織粘連程度分級數(shù)據(jù)為有序分類變量且不符合正態(tài)分布，兩組比較采用H檢驗；成纖維細胞及軟骨細胞數(shù)符合正態(tài)分布，以[AKx-D]±s形式表示，兩組比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有顯著意義。

2結(jié)果

2.1解剖觀察

所有兔術(shù)后進食無明顯異常，切口均一級愈合。A組肩袖表面可見清亮滑液，有少量瘢痕組織和新鮮肉芽組織增生，色澤紅潤，肩袖組織與周圍組織分離清楚，粘連等級為Ⅰ～Ⅱ級（圖2A、B）。B組肩袖組織與周圍組織粘連嚴重，無法明顯分離完整清晰肩袖組織，肩袖周圍可見大量增生肉芽組織，粘連等級為Ⅳ～Ⅴ級（圖2C、D）。術(shù)后6周A組肌腱及周圍組織粘連程度均輕于B組，差異均有統(tǒng)計學意義（H=50.879，P<0.05）。見表1。

2.2組織學觀察

術(shù)后6周，與正常兔肩袖相比，A組腱骨愈合處可見大量新生軟骨細胞，骨皮質(zhì)內(nèi)可見少量破骨細胞及成骨細胞，肌腱處見成纖維母細胞及成纖維細胞，成纖維細胞排列緊密，排列方向與正常肌腱細胞損傷有重要研究意義。目前，用于研究肩袖損傷的模型動物主要有大鼠、兔、犬、羊以及靈長類動物等。兔的肩胛下肌與人類有類似的解剖學和生物力學特性，尤其適用于研究肩袖損傷后的肌腱改變（肌腱及周圍組織粘連、脂肪浸潤等）[12]；在組織學上，兔肩袖肌腱包括與人類相似的由肌腱到骨的移行區(qū)域，可用于腱骨愈合的研究[1213]；兔肩袖的愈合方式與人類的相似[14]；此外，兔肩袖損傷模型還常用來觀察各種生長因子、組織工程材料對肩袖損傷的治療效果[1516]?；谏鲜鲈?，本研究選用兔建立肩袖損傷模型，研究醫(yī)用幾丁糖在兔肩袖肌腱修復術(shù)后對腱骨愈合和肌腱及周圍組織粘連的影響。

幾丁糖具有生物相容性、生物可降解性、無毒性和吸附性等特點[17]，是一種良好的促進腱骨愈合和防止肌腱粘連的生物材料。幾丁糖預防關(guān)節(jié)再粘連的可能機制如下。①潤滑作用和生物屏障作用：幾丁糖在理化性質(zhì)上與關(guān)節(jié)內(nèi)氨基多糖相似，具有黏彈性，另外幾丁糖具有良好的成膜性，置于術(shù)后有可能發(fā)生粘連的組織之間起到“短期屏障”作用，從而達到預防關(guān)節(jié)粘連的目的[18]；②促進組織修復，抑制成纖維細胞的增生，減少膠原纖維分泌合成，從而預防岡上肌腱粘連的發(fā)生[1920]；③止血作用：減少創(chuàng)面出血可預防粘連形成[2]；④抗菌作用：幾丁糖能抑制受創(chuàng)組織自身炎癥的發(fā)生，使岡上肌腱內(nèi)源性愈合，預防肌腱粘連的發(fā)生[21]。目前，臨床上應用的幾丁糖制劑形式主要包括醫(yī)用幾丁糖液體輔料和幾丁糖凝膠，由于液體輔料比凝膠形式具有更良好的物理擴散性及生物可降解性，因此本研究直接采用醫(yī)用幾丁糖液體敷料作為實驗用藥，探討其對兔肩袖損傷模型修復術(shù)后腱骨愈合和肌腱及周圍組織粘連的影響。

有研究結(jié)果顯示，術(shù)后2周幾丁糖組肌腱幾乎未見明顯的愈合，術(shù)后早期（4周內(nèi)），由于幾丁糖薄膜的隔離作用影響了外源性愈合，幾丁糖對愈合有明顯的抑制作用；術(shù)后4周時肌腱開始愈合，幾丁糖組肌腱周圍毛細血管數(shù)量增加，這與幾丁糖刺激血管內(nèi)皮細胞生長有關(guān)，有利于以后的肌腱愈合[22]。肌腱及周圍組織粘連大多發(fā)生在修復的早期（術(shù)后5～7 d為粘連的高發(fā)期），幾丁糖在體內(nèi)1～2周開始降解，4周降解完畢，因此幾丁糖的半衰期與腱骨愈合期和粘連高峰期相吻合。有研究將軟骨細胞接種于幾丁糖凝膠中，可見軟骨細胞在幾丁糖中維持圓形，增殖、分化活躍，表明幾丁糖能夠穩(wěn)定地維持軟骨細胞的表型表達[24]。有研究顯示，軟骨細胞不僅在幾丁糖膜上生長良好，而且還分泌膠原Ⅱ[25]。這些研究結(jié)果表明幾丁糖適合作為軟骨組織工程研究的細胞載體材料。另外，幾丁糖和軟骨基質(zhì)糖氨多糖結(jié)構(gòu)相似，具有良好的生物相容性和可降解性，對軟骨細胞有較好的吸附作用，可促進軟骨細胞的增殖與分化，具有促進軟骨修復的能力[2627]，表明幾丁糖是一種良好的修復和重建軟骨載體。本實驗結(jié)果顯示，A組在腱骨愈合處軟骨細胞的分化增殖較B組明顯活躍，提示幾丁糖可促進軟骨細胞的增殖，而軟骨細胞增殖可以增強腱骨界面組織的軟骨再生能力，從而促進兔肩袖肌腱的生物修復。另外，A組在肌腱處的成纖維細胞排列緊密，沿受力方向排列，與正常肌腱細胞方向大致相同，這有利于肌腱的結(jié)構(gòu)重塑和構(gòu)建。肩袖修補術(shù)后，肩袖肌肉常存在不同程度的脂肪浸潤，可導致組織彈性的下降，影響肩關(guān)節(jié)功能的恢復[28]。有研究顯示，幾丁糖具有降血脂的作用，其機制可能是由于它具有抑制脂肪吸收的作用[29]，例如用高脂膳食喂養(yǎng)家兔建立動脈粥樣硬化模型，幾丁糖可以減輕肝臟脂肪樣變[30]。本研究結(jié)果顯示，A組肌腱組織中無明顯脂肪浸潤，而B組有明顯脂肪浸潤并可見少量脂肪空泡。據(jù)此我們推測，幾丁糖具有減輕肌腱組織脂肪樣變的作用，此方面的研究國內(nèi)外尚未見報道，需今后增加動物模型的數(shù)量做進一步的探討。

RODEN等[30]的研究結(jié)果顯示，當骨長入由骨隧道的邊緣和肌腱形成的纖維血管界面組織時，腱骨愈合就開始了。在重建后至少8周內(nèi)愈合的韌帶應該得到保護。LIU等[31]在術(shù)后6周內(nèi)觀察到間接腱骨插入，因此至少在兔模型中腱骨重要的愈合時期應確定在術(shù)后的前6周內(nèi)。張輝等[22]通過切斷來亨雞的趾深屈肌腱、在其周圍包裹幾丁糖薄膜來觀察肌腱的愈合情況，結(jié)果顯示幾丁糖薄膜在早期（即4周內(nèi)）可以影響肌腱愈合，4周后可加快肌腱愈合和增加肌腱抗張強度。有研究探討了幾丁糖促進肌腱愈合的機制：①具有促進組織（上皮細胞）生理性愈合的作用；②具有屏障作用；③具有抗菌作用；④具有防粘連作用[32]。綜合本實驗結(jié)果，我們認為幾丁糖在兔肩袖肌腱修復術(shù)后的腱骨修復過程中起到積極促進作用。

肌腱及周圍組織粘連發(fā)生的機制是由于參與肌腱愈合的肌腱細胞和腱周組織來源的外源細胞（成纖維細胞為主）生長連接成整體的組織。肌腱在外源性愈合過程中，成纖維細胞從外周向損傷中心生長，同時分泌合成大量的膠原纖維，參與肌腱的愈合，是形成肌腱及周圍組織粘連的原因。內(nèi)源性愈合通過肌腱本身細胞增生、分化、分泌膠原纖維來完成肌腱的修復，不對肌腱及周圍組織粘連產(chǎn)生影響[2]。因此，肌腱的粘連程度取決于這兩種愈合機制在肌腱愈合過程中所占的比例大小。腱骨修復與成纖維細胞的數(shù)量有關(guān)，成纖維細胞數(shù)量增多在一定程度上促進了肌腱的外源性愈合，而減少了內(nèi)源性愈合，因此不利于兔肩袖腱骨的生物修復。有研究結(jié)果表明，幾丁糖能抑制腱周圍成纖維細胞增生，預防肌腱粘連，但不影響肌腱愈合質(zhì)量[21]。幾丁糖可抑制成纖維細胞增生，促進腱骨愈合，腱鞘光滑且間隙較寬，無明顯粘連。肉芽組織在組織損傷后1～2周逐漸成熟，此時成纖維細胞產(chǎn)生越來越多的膠原纖維從而轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維細胞，肉芽組織轉(zhuǎn)化為纖維結(jié)締組織進一步轉(zhuǎn)變?yōu)轳：劢M織。本研究的大體解剖觀察結(jié)果顯示，A組肩袖表面瘢痕組織和肉芽組織明顯少于B組，表明幾丁糖可使肉芽組織生成減少，從而減少了纖維瘢痕組織的形成。本研究的組織學檢查結(jié)果與大體解剖觀察相吻合，即與B組比較，A組肌腱處成纖維母細胞及成纖維細胞數(shù)量明顯減少，提示幾丁糖可以抑制成纖維細胞的生長，抑制外源性愈合，從而達到預防肌腱及周圍組織粘連的目的。根據(jù)實驗結(jié)果我們推斷：成纖維細胞是粘連和瘢痕組織的效應細胞，是粘連形成的決定性因素之一；幾丁糖能夠抑制成纖維細胞增生，減少膠原纖維和瘢痕組織形成的機會，從而預防肌腱及周圍組織粘連。上述研究結(jié)果也為我們大體解剖觀察到的A組肩袖肌腱及周圍組織粘連等級顯著低于B組提供了理論依據(jù)。有研究初步闡明了幾丁糖抑制成纖維細胞增生和膠原生成分子機制，即在術(shù)后肌腱愈合過程中幾丁糖是通過上調(diào)miR29介導下調(diào)TGFβ1/Smad3，從而抑制成纖維細胞增殖。

需要指出的是，本研究存在如下局限性。最主要的是實驗動物的樣本量較小，而大樣本的動物實驗才能得出更準確的結(jié)論。其次，根據(jù)文獻報道，肩袖修補術(shù)后6周各種變化最明顯，故本研究只選擇術(shù)后6周觀察結(jié)果，而選擇術(shù)后不同時期進行觀察所得結(jié)論可能更能說明問題。最后，盡管兔是建立肩袖損傷模型的合適動物，但它與人類并不完全相同。本研究以兔岡上肌肌腱（最常見的肌腱破裂）作為觀察對象，然而最近研究表明兔的肩胛下肌可能更類似于人類的岡上肌[33]。今后我們將使用兔肩胛下肌作為觀察對象，進一步探討幾丁糖在肩袖修補術(shù)后對腱骨愈合和肌腱及周圍組織粘連的影響。

綜上所述，幾丁糖具有促進兔肩袖損傷修復術(shù)后腱骨愈合和預防肌腱及周圍組織粘連的作用，這為臨床上肩袖修補術(shù)后促進腱骨愈合和防止肌腱及周圍組織粘連的發(fā)生提供了一種可行的方法。

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（本文編輯馬偉平）