都宏霞,陶勁強(qiáng),2,王 翔,劉宴秀,俞 軒
(1.南京科技職業(yè)學(xué)院化工與材料學(xué)院,江蘇南京 210048;2.南京工業(yè)大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇南京 211800)
人參花是珍貴草藥五加科植物人參的花蕾[1],在我國(guó)主要生長(zhǎng)在河北北部、黑龍江、遼寧、吉林等地[2]。人參是我國(guó)的瑰寶,近年來,國(guó)內(nèi)外學(xué)者先后對(duì)人參的根、根莖、莖、葉及果實(shí)的化學(xué)成分做了較為系統(tǒng)的研究,但對(duì)人參花資源的研究報(bào)道甚少。
人參花作為一種具有潛在藥用和食用價(jià)值的植物,也在逐漸受到大家的關(guān)注[3-4],雖然研究的不多,但也取得了一定進(jìn)展,研究主要集中在花蕾發(fā)育的細(xì)胞學(xué)特征[5]、皂苷[6-7]、多糖[8]及揮發(fā)油等其他化學(xué)成分上[9-11],劉淑瑩等通過甲醇作為萃取溶劑,經(jīng)RRLC-Q-TOF-MS/MS分析得到14種人參皂苷[6],而徐斐等通過70%的乙醇提取,得到11種人參皂苷[7],回瑞華等通過超聲波提取得到人參花多糖提取最佳工藝[8],徐斐等通過水蒸氣回流法提取并鑒定出33種人參花揮發(fā)性成分[10]。關(guān)于人參花黃酮(Ginseng Flower Flavonoids,簡(jiǎn)稱GFF)的研究只見一篇報(bào)道,采用8種不同方法對(duì)人參花進(jìn)行炮制,比較其人參皂苷含量、黃酮、多糖的含量[11]。
黃酮類化合物是天然藥用植物的主要活性成分之一,具有多種生理功能[12-13],迄今為止還未有對(duì)GFF的提取工藝和抗氧化活性的系統(tǒng)研究,本文在單因素分析的基礎(chǔ)上,通過響應(yīng)面法優(yōu)化,初步確定GFF提取的最優(yōu)工藝,并對(duì)三種自由基的抗氧化活性進(jìn)行了測(cè)定,為GFF的研究奠定了重要的基礎(chǔ),為進(jìn)一步開發(fā)人參花資源提供了堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)。
新鮮人參花 六年生大花,吉林省長(zhǎng)白山土特產(chǎn)公司;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品 北京恒元啟天化工技術(shù)研究所;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼、鄰苯三酚 Sigma公司;乙醇、三氯化鋁、醋酸鉀、FeSO4·7H2O、水楊酸、H2O2、三羥甲基氨基甲烷、濃鹽酸均為分析純。
ME204E-02型電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;7600型紫外分光光度計(jì) 上海菁華科學(xué)儀器制造有限公司;TDL-50B型低速臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。
1.2.1 GFF的提取及測(cè)定 以新鮮人參花為原料,經(jīng)過洗滌、陰干等預(yù)處理,經(jīng)超微粉碎至40目、乙醇浸泡、微波提取,轉(zhuǎn)速3000~4000 r/min,時(shí)間20~30 min進(jìn)行離心分離,取出上清液,過0.45 μm濾膜,對(duì)D101大孔樹脂進(jìn)行預(yù)處理后,上樣,待吸附平衡后,用去離子水、分別用質(zhì)量濃度為30%、50%、70%、90%的乙醇溶液洗脫,每個(gè)濃度均洗脫3柱體積(BV),流速為1 BV/h,收集90%乙醇濃度的洗脫液,于45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)進(jìn)行濃縮后[14],再用50%的乙醇溶液進(jìn)行稀釋得到人參花黃酮樣品(GFF)。
人參花黃酮提取量的測(cè)量按文獻(xiàn)方法[15-16]并稍微修改。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液定容5.0 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品至25.0 mL。
稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(0.2 mg/mL)0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL分別置于6只比色管中,分別用質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%的乙醇溶液至5.0 mL,0.1 mol/L三氯化鋁溶液3.0 mL和1 mol/L醋酸鉀溶液5.0 mL,搖勻,同法制成空白對(duì)照:靜待40 min后于415 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度值,并通過originpro 2017軟件繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。
人參花中黃酮提取量的測(cè)定:吸取2 mLGFF提取液,按上述標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟反應(yīng)后,在415 nm處測(cè)定吸光度值,結(jié)果以人參花中含有相當(dāng)于蘆丁的毫克數(shù)表示,單位為mg/g。
式中:X表示標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的質(zhì)量濃度(mg/mL);v表示提取液的總體積(mL);N表示稀釋倍數(shù);m表示人參花粉末的質(zhì)量(g)。
1.2.2 微波提取GFF的單因素實(shí)驗(yàn)
1.2.2.1 微波功率對(duì)GFF提取量的影響 料液比1∶10,乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%,微波時(shí)間30 s,再分別取80、240、400、640、800 W的微波功率作為變量,觀察微波功率對(duì)其提取量的影響。
1.2.2.2 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)GFF提取量的影響 料液比1∶10,在微波時(shí)間30 s和微波功率為800 W的條件下,乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為40%、50%、60%、70%、80%,制備出提取液,比較該變量對(duì)其提取量的影響。
1.2.2.3 料液比對(duì)GFF提取量的影響 在50%的乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù),微波功率800 W,時(shí)間30 s的條件下,分別取料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30制備出提取液,比較此變量對(duì)其提取量的影響。
1.2.2.4 微波時(shí)間對(duì)GFF提取量的影響 在50%乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù),800 W微波功率,1∶20料液比的條件下,分別取微波時(shí)間20、30、40、50、60 s,比較該變量對(duì)其提取量的影響。
1.2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化GFF最優(yōu)提取工藝條件 使用Design-Expert.V8.0.6軟件中Box-Behnken組合設(shè)計(jì)來確定實(shí)驗(yàn)最優(yōu)工藝,從單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,選擇液料比、乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、微波時(shí)間作為3因素,每個(gè)因素選擇三個(gè)對(duì)GFF提取量影響較大的水平,進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),并以GFF提取量作為響應(yīng)值,各因素的三個(gè)水平分別采取-1、0、1作為編碼,如表1。
表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)分析因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface methodology
1.2.4 GFF對(duì)DPPH自由基的清除能力測(cè)定 依據(jù)Brandwilliams[17-19]等人的實(shí)驗(yàn)步驟,制定實(shí)驗(yàn)方案。配制0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液備用。精確吸取0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.0 mL經(jīng)D101大孔樹脂純化過的提取液,精確吸取2.0、1.6、1.2、0.8、0.4、0.6、0 mL和6.0 mL新配制的DPPH溶液于試劑中,避光靜待30 min后,再用分光光度法在517 nm處測(cè)定吸光度值,并用VC做陽性對(duì)照。GFF提取液對(duì)DPPH自由基的清除能力依據(jù)公式計(jì)算:
式中,I1表示對(duì)DPPH自由基的清除率(%);Ai表示GFF和DPPH溶液混合液吸光度;Aj表示無DPPH溶液吸光度;A0表示無樣品時(shí)DPPH溶液的吸光度。
1.2.5 GFF對(duì)羥自由基的清除能力測(cè)定 采用Fenton反應(yīng)來測(cè)定GFF的羥自由基清除率[20-22]。于比色管中分別加入1 mL的9 mol/L FeSO4溶液、1 mL的9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液,不同濃度用D101樹脂純化過的待測(cè)GFF提取液1 mL(空白對(duì)照以蒸餾水代替GFF提取液),最后加1 mL的8.8 mol/L H2O2溶液,水浴35 min,溫度恒定35 ℃,測(cè)其吸光度的波長(zhǎng)為510 nm,檢測(cè)液本身有吸光度,因此測(cè)其本底值需用蒸餾水代替H2O2,并用VC做陽性對(duì)照。并根據(jù)此公式計(jì)算其清除率:
式中,I2表示對(duì)羥自由基的清除率(%):A0是空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)(蒸餾水代替GFF提取液)的吸光度;AX是加入提取液后的吸光度;AX0是檢測(cè)液本底的吸光度(蒸餾水代替過氧化氫)。
1.2.6 GFF對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力測(cè)定 采用鄰苯三酚自氧化法[22-25]進(jìn)行測(cè)定超氧陰離子自由基清除能力,分別取4.5 mL pH8.2的Tris-HCl緩沖液于若干比色管中,20 ℃水浴25 min。每管中分別加入不同濃度經(jīng)D101樹脂純化過的待測(cè)GFF樣品溶液0.1 mL及0.3 mL 在30 ℃預(yù)熱條件下3 mmol/L的鄰苯三酚(用10 mmol/L的HCl配制),振蕩后恒溫20 ℃水浴6 min,隨滴2滴8 mol/LHCl反應(yīng)終止,空白對(duì)照選用蒸餾水,測(cè)吸光度波長(zhǎng)為320 nm,并用VC做陽性對(duì)照。提取液對(duì)超氧自由基的清除率按公式計(jì)算。
式中,I3表示對(duì)超氧自由基的清除率(%),A0為空白對(duì)照的吸光度;An為加入GFF后的吸光度。
使用Microsoft office excel 2013、Originpro 2017和Design-Expert.V8.0.6進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、圖表制作及數(shù)據(jù)分析。
經(jīng)測(cè)定,由圖1得其回歸方程為Y=16.43412X+0.06882,其系數(shù)R2=0.99938,在0~0.08 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of Rutin
2.2.1 微波功率對(duì)GFF提取量的影響 結(jié)果如圖2所示:微波功率在80~240 W之間,隨著功率的增大,GFF提取量呈上升趨勢(shì);在240~400 W范圍內(nèi),隨著功率的增大,GFF提取量呈下降趨勢(shì);在400~800W范圍內(nèi),隨著功率的增大,GFF提取量呈上升趨勢(shì)。GFF的提取量在800 W時(shí)最大。而在240~400 W之間下降,可能是在微波的交變電磁場(chǎng)作用下,引發(fā)黃酮強(qiáng)烈振蕩,導(dǎo)致分子間氫鍵斷裂,使得有少量黃酮受熱分解[26],加速了乙醇溶液的熱運(yùn)動(dòng),使得一些醇溶性雜質(zhì),脂溶性成分溶出量增加,使溶液黏度變大,增大了傳質(zhì)過程中溶劑的阻力,減慢了GFF向溶劑擴(kuò)散,減少了粉末表面與溶劑之間GFF濃度差,從而導(dǎo)致GFF的提取量減少[27]。微波功率在小于800 W時(shí),分子熱運(yùn)動(dòng)較慢,微波對(duì)細(xì)胞膜破壞作用較小,因此提取量不高。最高值為3.604 mg/g。
圖2 微波功率對(duì)GFF提取量的影響Fig.2 Effect of microwave power on extraction yield of GFF
2.2.2 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)GFF提取量的影響 結(jié)果如圖3所示:乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)在50%時(shí)GFF的提取量最大,而在40%~50%時(shí),GFF的提取量呈上升趨勢(shì),當(dāng)50%~80%時(shí),GFF的提取量呈下降趨勢(shì)。許輝[28],劉俊[29]等人在研究中發(fā)現(xiàn)黃酮提取量隨著乙醇濃度的增加而呈現(xiàn)與本文同樣的趨勢(shì),推測(cè)是加入乙醇溶液之后引入了羥基,乙醇分子與水分子間和其自身間均相互結(jié)合形成氫鍵,體系極性降低,故黃酮的提取量在升高,但隨著乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加,其極性下降,導(dǎo)致了黃酮的溶解能力減弱,因此最佳乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%。此時(shí)提取量最高,提取量為3.628 mg/g。
圖3 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)GFF提取量的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on extraction yield of GFF
2.1.3 料液比對(duì)GFF提取量的影響 結(jié)果如圖4所示:GFF的提取量先高后低,此時(shí)料液比在不斷增加,料液比1∶20時(shí)人參花黃酮的提取量最大。料液比1∶20,當(dāng)料液比大于1∶20時(shí),人參花黃酮的提取量下降。大體積的溶劑量減小了黃酮吸收的能力導(dǎo)致其溶解量減小。GFF提取量隨著料液比的升高而升高,但當(dāng)料液比達(dá)到1∶20后,提取量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。因?yàn)榱弦罕鹊脑黾涌梢允贵w系的溶解度升高,促進(jìn)人參花細(xì)胞破壁,使內(nèi)容物溢出率增加,但當(dāng)溶解度大到一定程度時(shí),可能會(huì)發(fā)生飽和的現(xiàn)象,導(dǎo)致部分黃酮無法溶解。因此最佳料液比為1∶20。提取量為5.313 mg/g。
圖4 料液比對(duì)GFF提取量的影響Fig.4 Effect of liquid-material ration on extraction yield of GFF
2.2.4 微波時(shí)間對(duì)GFF提取量的影響 結(jié)果如圖5所示:在20~30 s時(shí)提取量呈上升趨勢(shì),此時(shí)黃酮的溶出主要受溫度控制,因此提取量隨著溫度升高而提高。但在30~60 s時(shí)反而呈下降趨勢(shì),可能是微波加熱有升溫過程。但在30~60 s階段溫度已經(jīng)穩(wěn)定,大部分細(xì)胞膜已經(jīng)破壞,黃酮的溶出速度受分子擴(kuò)散速度,因此提取量隨著時(shí)間增加而降低,最大條件為30 s。此時(shí)提取量最高為5.359 mg/g。
圖5 微波時(shí)間對(duì)GFF提取量的影響Fig.5 Effect of extraction time on extraction yield of GFF
2.3.1 響應(yīng)模型的建立與分析 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果:根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素為A料液比、B乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)、C微波時(shí)間(s),GFF為響應(yīng)值(Y),采用Design-expert軟件按照Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了15組實(shí)驗(yàn),12組為析因點(diǎn)實(shí)驗(yàn),3組為重復(fù)零點(diǎn)實(shí)驗(yàn),結(jié)果見表2對(duì)人參花黃酮提取量的影響進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化需對(duì)3個(gè)自變量進(jìn)行編碼,以GFF提取量作為響應(yīng)值。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及響應(yīng)面數(shù)據(jù)結(jié)果分析見表2,方差與誤差統(tǒng)計(jì)分析見表3。
表2 響應(yīng)面Box-Benhnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of the response surface methodology(RSM)and Box-Behnken
在表2中進(jìn)行分析并建立如下二次回歸方程(編碼方程):Y(黃酮提取量)=4.83+0.12A-(1.250E-003)B+0.055C-0.046AB-0.069AC-0.010BC-0.62A2-0.12B2-0.40C2
表3的數(shù)據(jù)可知:模型的p值為0.0037,模型顯著(p<0.05);失擬項(xiàng)p值為0.1260,結(jié)果不顯著(p>0.05),表明擬合狀況良好。方程決定系數(shù)R2=0.9656,CV為6.64%<10%,能真實(shí)的反映本模型,可用此模型分析響應(yīng)面的變化。信噪比(Adeq Precision)為11.396大于4,表示模型合理[30]。
由方差F值可知,各因素對(duì)GFF提取量影響為:B(乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù))>C(微波時(shí)間)>A(料液比)。由表3還可知,因素中B的影響顯著,而A,C,AB,AC,BC的影響不顯著,該方程可適用。
表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model
2.3.2 響應(yīng)面交互作用分析與優(yōu)化 各因素間交互作用得到響應(yīng)面曲線圖。圖6~圖8分別顯示3個(gè)結(jié)果分析,并繪制響應(yīng)面曲線圖。當(dāng)黃酮的提取量相同時(shí)等高線圖在同一曲線上[31-32]。在密閉區(qū)域內(nèi),GFF值從中心向四周下降。當(dāng)?shù)雀呔€排列緊密,表明操作條件與響應(yīng)值改變較為明顯。等高線圖直觀表示2變量之間交互作用,此時(shí)橢圓形則為顯著[30]。
圖6 料液比與乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)響應(yīng)面圖Fig.6 Response Surface of Y=f(A,B)
圖7 微波時(shí)間與料液比響應(yīng)面圖Fig.7 Response Surface of Y=f(A,C)
圖8 微波時(shí)間與乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)響應(yīng)面圖Fig.8 Response Surface of Y=f(B,C)
分析圖6三維曲面圖可以看出,料液比曲面比乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)曲面坡度陡峭,固定另一因素不變,即表明料液比對(duì)人參花黃酮提取量的影響比乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響大。同理再分析圖7三維曲面圖可以得出料液比比微波時(shí)間對(duì)人參花黃酮提取量的影響大,這與二元回歸方程系數(shù)相符合,圖8中微波時(shí)間與乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的曲面坡度均陡峭,交互作用明顯,這與方差分析表一致。
可從各響應(yīng)面立體圖觀測(cè)出響應(yīng)面有最值。通過軟件得出理論最佳提取工藝:微波功率800 W,微波時(shí)間29.69 s,乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為54.21%,料液比1∶21.43,理論黃酮提取量為5.6502 mg/g,結(jié)合實(shí)驗(yàn)室條件修正為800 W,微波時(shí)間30 s,54%的乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù),料液比1∶21,最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果為5.624 mg/g,與理論值相差0.03%,說明模型與實(shí)際情況擬合較好,驗(yàn)證了所預(yù)測(cè)模型的正確性。因此,響應(yīng)面法對(duì)微波輔助人參花黃酮提取的參數(shù)優(yōu)化是可行的,得到的工藝條件具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
2.4.1 GFF對(duì)DPPH自由基的清除能力結(jié)果分析 不同濃度的人參花黃酮提取液與VC溶液對(duì)DPPH自由基清除能力如圖9所示。從圖中可以看出,VC在1 mg/g左右達(dá)到最大值,且在之后基本不變。GFF對(duì)DPPH自由基的清除能力比VC差。DPPH自由基清除率隨著GFF提取量的增加,也在不斷升高,當(dāng)人參花黃酮濃度是0.24 mg/mL時(shí),清除率最大為71.47%,人參花黃酮和VC的IC50值分別為0.17 mg/mL和0.09 mg/mL。
圖9 GFF對(duì)DPPH自由基清除能力Fig.9 Scavenging effect of GFF on DPPH radical
2.4.2 人參花黃酮對(duì)羥自由基的清除能力結(jié)果分析 不同濃度的人參花黃酮提取液與VC溶液對(duì)羥自由基清除能力如圖10所示,從圖中可以看出,GFF對(duì)羥自由基具有一定的抑制能力但不如VC顯著,羥自由基與GFF提取量有量效關(guān)系,呈正相關(guān),當(dāng)人參花黃酮濃度在0.24 mg/mL時(shí),清除率最大為49.91%,人參花黃酮和VC溶液的IC50為0.24 mg/mL和0.30 mg/mL。
圖10 GFF對(duì)羥自由基清除能力Fig.10 Scavenging effect of GFF on hydroxyl free radicals
2.4.3 GFF對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力結(jié)果分析 不同濃度的人參花黃酮提取液與VC溶液對(duì)超氧陰離子自由基清除能力如圖11所示。從圖11中可以明顯看出GFF和VC溶液對(duì)超氧自由基都有一定的抑制能力,抑制率與濃度呈良好的量效關(guān)系,且GFF比VC溶液對(duì)超氧自由基的抑制能力要好,當(dāng)人參花黃酮濃度是0.24 mg/mL時(shí),有最大清除率72.32%,人參花黃酮和VC溶液的IC50分別為1.73 mg/mL和0.14 mg/mL。
圖11 GFF對(duì)超氧自由基的清除能力Fig.11 Scavenging effect of GFF on superoxide anion free radical
2.4.4 GFF對(duì)3種自由基清除率的比較 通過實(shí)驗(yàn)比較發(fā)現(xiàn),GFF對(duì)3種自由基均具有清除能力,且抑制率與GFF提取量成正比,72.32%(超氧自由基清除率)>71.47%(DPPH自由基清除率)>49.91%(羥自由基清除率),且超氧自由基和DPPH自由基的活性相似。羥自由基是已知最活潑的氧化劑且反應(yīng)范圍廣[33],因此GFF對(duì)其清除率最低。
通過單因素實(shí)驗(yàn)得出響應(yīng)面優(yōu)化條件,在使用Design-Expert軟件中的設(shè)計(jì)方法上建立數(shù)學(xué)模型。方差分析結(jié)果表明人參花黃酮提取量與乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈正相關(guān),與微波時(shí)間,液料比有一定影響,結(jié)合響應(yīng)面交互作用分析結(jié)果和實(shí)際情況預(yù)測(cè)最佳條件,并驗(yàn)證后得出人參花黃酮提取最佳條件為微波功率為800 W,微波時(shí)間30 s,54%的乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù),料液比1∶21。
人參花中黃酮的研究鮮有報(bào)道,這不僅不利于對(duì)中國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)藥領(lǐng)域的研究,還不利于對(duì)中國(guó)自然資源的再利用。通過對(duì)人參花黃酮的研究,測(cè)量人參花黃酮的活性,有助于了解其成分功效,開發(fā)其潛在價(jià)值,研發(fā)出新的產(chǎn)品,將其工業(yè)化,擴(kuò)大人參花這一潛在市場(chǎng),并以此帶動(dòng)傳統(tǒng)農(nóng)產(chǎn)品和中藥材的附加價(jià)值再利用。