響應(yīng)面法優(yōu)化咖啡葉中 芒果苷提取工藝的研究

黃麗卿

(1.漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院,福建漳州 363000;2.農(nóng)產(chǎn)品深加工及安全福建省高校應(yīng)用技術(shù)工程中心,福建漳州 363000)

芒果苷具有抗糖尿病及其并發(fā)癥、抗腫瘤、抗高尿酸血癥、調(diào)節(jié)脂代謝異常、保護(hù)心血管和神經(jīng)、保護(hù)肝臟、促進(jìn)骨骼發(fā)育、抗過(guò)敏和調(diào)節(jié)免疫力等廣泛的藥理作用[1]。

芒果苷不僅存在于芒果樹(shù)葉片中及其枝條中[2-3],還存在于其它的植物中,如周榮光等[4]報(bào)道了芒果苷存在于漆樹(shù)科扁桃葉中,李開(kāi)通等[5]通過(guò)高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定不同產(chǎn)地和品種石韋中芒果苷的含量,帥歐等[6]報(bào)道了從瑞香科沉香葉中提取芒果苷的工藝,袁葉飛等[7]也研究了川西獐牙菜中芒果苷的提取分離,楊瀟等[8]報(bào)道了利用超聲波提取百合科知母中的芒果苷。

盡管上述文獻(xiàn)均提到了以上各植物中芒果苷的提取方法,但值得指出的是,由于咖啡樹(shù)在我國(guó)的云南、海南、廣西、廣東、福建均有種植[9-10],它作為一種已規(guī)?；N植的作物,不僅可以收獲高價(jià)值的咖啡豆,還可以制作咖啡葉茶[11],與此同時(shí),從本研究的分析發(fā)現(xiàn)咖啡葉子中含有豐富的芒果苷(mangiferin),可以用于提取功能成分。由于咖啡葉中芒果苷的提取方法尚未見(jiàn)報(bào)道,本研究利用響應(yīng)面法優(yōu)化咖啡葉中芒果苷的提取工藝,以期為咖啡葉功能成分分析和深加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

咖啡葉 “阿拉比卡”品種,采摘于福建省漳州天綠咖啡(南坑)示范基地,選用咖啡樹(shù)上墨綠色的葉子,采摘后8 ℃冷藏保存;芒果苷標(biāo)準(zhǔn)品(HPLC≥98%) 上海純優(yōu)生物科技有限公司;水 高純水,實(shí)驗(yàn)室自制;甲醇 國(guó)產(chǎn)色譜純;磷酸 國(guó)產(chǎn)分析純。

Waters2998高效液相色譜儀 美國(guó)Waters公司;ZB-5斬拌機(jī) 華映食品機(jī)械有限公司;HH-2恒溫水浴鍋 金壇市新航儀器廠(chǎng);AL204型電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 咖啡葉中芒果苷的提取工藝 工藝流程:咖啡葉→斬拌機(jī)快速斬拌→提取→過(guò)濾→測(cè)量濾液體積→HPLC法測(cè)定濾液中芒果苷的含量。

操作要點(diǎn):取新鮮的咖啡葉,置于斬拌機(jī)內(nèi)快速斬拌,斬拌成約0.2 cm×40 cm大小的葉片備用。準(zhǔn)確稱(chēng)取斬拌后的咖啡葉10 g,置于具塞的三角瓶中,加入乙醇溶液,在恒溫水浴鍋中加熱提取,用300目濾布過(guò)濾,測(cè)量濾液體積,最后采用HPLC法測(cè)定濾液中芒果苷的含量。

1.2.2 芒果苷含量測(cè)定

1.2.2.1 芒果苷高效液相色譜的測(cè)定條件 色譜柱:Dimaonsil C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),檢測(cè)波長(zhǎng)240 nm,柱溫30 ℃,流速1 mL/min,進(jìn)樣量10 μL,以甲醇-0.2%磷酸水溶液(30∶70)為流動(dòng)相等度洗脫25 min[12]。

1.2.2.2 芒果苷標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立 稱(chēng)取芒果苷對(duì)照品分別配制0.049、0.098、0.147、0.196、0.245、0.294、0.343 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照1.2.2.1方法操作,以峰面積(A)為縱坐標(biāo),進(jìn)樣溶液中芒果苷含量(C,mg/mL)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為A=21676882C+397632(相關(guān)系數(shù)r=0.9992),結(jié)果表明,芒果苷進(jìn)樣量在0.049～0.343 mg/mL范圍內(nèi),峰面積與溶液中芒果苷含量呈良好線(xiàn)性關(guān)系。

式中:C:濾液中芒果苷含量(mg/mL);V:濾液體積(mL);m:咖啡葉的質(zhì)量(mg),本實(shí)驗(yàn)咖啡葉用量為10 g,即為m=10000 mg。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 料液比 在提取溫度65 ℃,提取時(shí)間60 min和乙醇濃度60%的條件下,考察不同的料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 g/mL對(duì)咖啡葉中芒果苷提取率的影響。

1.2.4.2 乙醇濃度 在提取溫度65 ℃,提取時(shí)間60 min和料液比1∶15 g/mL的條件下,考察不同的乙醇濃度55%、60%、65%、70%、75%對(duì)咖啡葉中芒果苷提取率的影響。

1.2.4.3 提取溫度 在乙醇濃度70%,料液比1∶15 g/mL和提取時(shí)間60 min條件下,考察不同的提取溫度50、55、60、65、70 ℃對(duì)咖啡葉中芒果苷提取率的影響。

1.2.4.4 提取時(shí)間 在乙醇濃度70%,料液比1∶15 g/mL和提取溫度55 ℃條件下,考察不同提取時(shí)間40、50、60、70、80 min對(duì)咖啡葉中芒果苷提取率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為依據(jù),采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面法分析,探索咖啡葉中芒果苷提取的最佳工藝參數(shù)[13-14]。以芒果苷提取率為響應(yīng)值,具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素和水平見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素和水平Table 1 factors and levels of experiment design

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.5軟件繪制單因素影響芒果苷提取率的趨勢(shì)圖,采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 芒果苷對(duì)照品和測(cè)試品色譜圖

芒果苷對(duì)照品和測(cè)試品色譜圖如圖1所示。

圖1 對(duì)照品(A)與測(cè)試品(B)色譜圖Fig.1 chromatography of the standard substance A and the test products B

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 料液比對(duì)芒果苷提取率的影響 由圖2可知,隨著乙醇溶液用量增加,芒果苷提取率也隨著迅速提升,當(dāng)料液比達(dá)到1∶15 g/mL時(shí),提取率為0.275%。隨著乙醇溶液用量繼續(xù)增加,芒果苷提取率小幅上升,變化不大。當(dāng)咖啡葉與乙醇溶液充分接觸后,再增加溶劑用量對(duì)芒果苷提取率的影響不顯著(p>0.05),從提高提取率和降低成本兩方面綜合考慮,料液比1∶15 g/mL較合適。

圖2 料液比對(duì)芒果苷提取率的影響Fig.2 Effect of material-liquid ratio on the extraction rate of mangiferin

2.2.2 乙醇濃度對(duì)芒果苷提取率的影響 由圖3可知,芒果苷的提取率隨乙醇濃度的增加而升高,乙醇濃度為70%時(shí),芒果苷的提取率達(dá)到峰值,為0.311%。此后,隨著乙醇濃度的增加,芒果苷的提取率降低。有學(xué)者指出芒果苷易溶于熱的稀乙醇溶液,而當(dāng)乙醇濃度太高時(shí)反而降低其溶解度[6]。因此,乙醇濃度選擇70%為宜。

圖3 乙醇濃度對(duì)芒果苷提取率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of mangiferin

2.2.3 提取溫度對(duì)芒果苷提取率的影響 由圖4可知,芒果苷的提取率隨提取溫度的上升而升高,加熱溫度為55 ℃時(shí),芒果苷的提取率達(dá)到峰值,為0.374%。此后,隨著溫度升高,芒果苷的提取率反而降低。提取溫度升高,芒果苷擴(kuò)散速度加快,溶出增多,提取率升高,但是咖啡葉中成分較為復(fù)雜,此外葉片類(lèi)含有一定量的Mg2+、Ca2+、Cu2+等金屬離子,有文獻(xiàn)指出芒果苷屬于黃酮類(lèi)化合物,長(zhǎng)時(shí)間的高溫加熱容易與溶液中的金屬離子形成化合物從而誘導(dǎo)芒果苷的氧化,使芒果苷提取率下降[15]。因此,提取溫度選擇55 ℃比較合適。

圖4 提取溫度對(duì)芒果苷提取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the extraction rate of mangiferin

2.2.4 提取時(shí)間對(duì)芒果苷提取率的影響 由圖5可知,芒果苷的提取率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而快速增加,提取時(shí)間為70 min時(shí),芒果苷的提取率達(dá)到峰值,為0.428%。此后,隨著提取時(shí)間延長(zhǎng),芒果苷的提取率平緩下降。原因可能是長(zhǎng)時(shí)間的浸提使芒果苷易被共存的酶分解而導(dǎo)致提取率降低[16]。因此,提取時(shí)間選擇70 min為宜。

圖5 提取時(shí)間對(duì)芒果苷提取率的影響Fig.5 Effect of extraction time on the extraction rate of mangiferin

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化咖啡葉中芒果苷的提取工藝

表2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results

為檢驗(yàn)方程有效性,利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表2中實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步分析,多元回歸模型的方差分析及顯著性結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 回歸模型及方差分析Table 3 Analysis of variance of quadratic regression model

2.3.2 響應(yīng)面分析與優(yōu)化 利用Design-Expert 8.0.6軟件,繪制乙醇濃度、提取溫度和提取時(shí)間中任何兩因素的交互作用對(duì)咖啡葉中芒果苷提取率影響的響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖[14],結(jié)果如圖3所示。

從圖6(a、b)可以明顯看出,在提取時(shí)間為75.76 min的條件下,隨著提取溫度和乙醇濃度增加,咖啡葉中芒果苷提取率先升高后降低,最高值出現(xiàn)在響應(yīng)面圖6(b)的穹頂位置,在乙醇濃度69%～72%、提取溫度55～57 ℃的范圍內(nèi)。

從圖6(c、d)可以看出,在提取溫度為55.95 ℃的條件下,隨著乙醇濃度和提取時(shí)間的增加,咖啡葉中芒果苷提取率先升高后降低,最高值出現(xiàn)在響應(yīng)面圖6(d)的穹頂位置,在乙醇濃度68%～72%、提取時(shí)間73～78 min的范圍內(nèi)。

從圖6(e、f)可以看出,在乙醇濃度為70.15%的條件下,隨著提取溫度的升高,咖啡葉中芒果苷提取率先升高后降低,但是,提取時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)提取率的影響有限。芒果苷提取率的最高值出現(xiàn)在溫度55～57 ℃、提取時(shí)間73～78 min的范圍內(nèi)。

圖6 等高線(xiàn)(a、c、e)及響應(yīng)面(b、d、f)Fig.6 Contour plot(ace)and response surface(bdf)

2.3.3 最佳提取工藝參數(shù)的預(yù)測(cè) 通過(guò)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ头治?得出咖啡葉中芒果苷最佳提取工藝為乙醇濃度70.15%,提取溫度55.95 ℃,提取時(shí)間75.76 min,在預(yù)測(cè)的最佳工藝條件下,咖啡葉中芒果苷的提取率為0.438%。盡管該數(shù)值低于表2中的第14組數(shù)據(jù)0.4417%,但是由于第14組數(shù)據(jù)的工藝條件在表2實(shí)驗(yàn)中一共重復(fù)出現(xiàn)了5次,取其平均值得0.430%,低于預(yù)測(cè)值,故取預(yù)測(cè)值的工藝條件作為最優(yōu)條件。

2.3.4 模型的驗(yàn)證 為便于實(shí)際操作,模型驗(yàn)證時(shí)工藝條件采用乙醇濃度70%,提取溫度56 ℃,提取時(shí)間76 min,進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果是芒果苷提取率的平均值為0.432%,變異系數(shù)為 1.39%,實(shí)際測(cè)定值與理論值(0.438%)相對(duì)誤差<0.05,說(shuō)明響應(yīng)面設(shè)計(jì)的結(jié)果可靠合理。

3 討論

從植物中提取芒果苷,楊瀟[8]等采用超聲波輔助提取法從知母中提取芒果苷,提取率可達(dá)1.85%;帥歐[6]等以沉香葉為原料,采用回流提取,芒果苷得率達(dá)3.31%;鄧家剛[3]采用超聲波輔助提取法從芒果葉中提取芒果苷,廣西不同品種芒果葉和枝條中芒果苷提取率1.51%～8.71%。李開(kāi)通[6]等采用超聲波輔助提取法從石韋中提取芒果苷,產(chǎn)地湖南的光石韋藥材芒果苷提取率最高,達(dá)3.759%,而有柄石韋和石韋不含芒果苷或含量極低。以上研究所用的原料均為干品,本研究所用原料是新鮮的咖啡葉,水份含量經(jīng)測(cè)定為75.3%,芒果苷的提取率是0.432%,折算成干品,芒果苷的提取率約為1.75%,因此,咖咖葉中芒果苷的含量是相當(dāng)豐富的?？紤]到后續(xù)工業(yè)化生產(chǎn)的需要,本研究采用醇提方法,可為咖啡葉中芒果苷的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)研究提供了理論依據(jù)。但不同產(chǎn)地、品種及不同成熟度的咖啡葉的芒果苷含量不同及不同提取方法對(duì)芒果苷提取率的影響等方面有待進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

針對(duì)咖啡葉資源,以確定咖啡葉中芒果苷的最佳提取工藝為目的,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取工藝。確定最佳提取工藝為:料液比1∶15 g/mL、乙醇濃度70%、提取溫度56 ℃、提取時(shí)間76 min,在此條件下,咖啡葉中芒果苷的提取率為0.432%。