蘋果腐敗霉菌的拮抗酵母菌 篩選鑒定及拮抗機(jī)理初探

劉程惠,吳祎男,胡文忠,*,王艷穎,田密霞

(1.大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,遼寧大連 116600;2.遼寧省大連海洋漁業(yè)集團(tuán)公司,遼寧大連 116113)

蘋果顏色鮮艷、甜脆多汁且營養(yǎng)豐富,深受廣大消費(fèi)者的喜愛。2011年以來,我國的蘋果產(chǎn)量持續(xù)增加,穩(wěn)居世界第一,2016年總產(chǎn)量高達(dá)4350萬噸[1]。但是蘋果在采收和運(yùn)輸過程中,不可避免會受到機(jī)械損傷,且果實(shí)的水分和營養(yǎng)物質(zhì)含量較高,腐敗霉菌很容易通過傷口侵染果實(shí),在貯藏過程中會發(fā)病,造成腐爛變質(zhì),嚴(yán)重降低了蘋果的食用品質(zhì)和商品價(jià)值,已成為妨礙我國蘋果產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要障礙之一。蘋果的常見采后侵染性病害有青霉病、鏈格孢爛果病、霉心病、黑星病等[2-3],引起這些病害的主要微生物為青霉菌(Penicilliumsp.)、鏈格孢菌(Alternariasp.)、灰霉(Botrytiscinerea)和曲霉(Aspergillussp.)、黑星菌(Venturiasp.)等,它們都是從碰、壓、磕、刺傷或病蟲害的部位侵入果實(shí),引起蘋果發(fā)病[4-7]。

利用拮抗酵母菌來防治果蔬采后病害屬于生物防治范疇,與其它生防微生物相比,具有能有效利用貧乏營養(yǎng)快速增殖,能適應(yīng)果蔬貯藏條件,可與化學(xué)物質(zhì)配合使用,不產(chǎn)生抗菌素且遺傳穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)[8-9]。最早應(yīng)用的拮抗酵母菌“Aspire”(Candidaoleophilastrain I-812)和“Yield Plus”(Cryptococcusalbidus)在美國已經(jīng)商品化多年,主要用于控制蘋果、梨等果實(shí)的青霉病和灰霉病[10],但是由于商業(yè)化條件下低效、市場滲透率低和公司維持和發(fā)展其商業(yè)化的財(cái)力不足等原因已經(jīng)被撤回[11]。目前,雖然仍有一些拮抗酵母菌如Metschnikowiafructicola和Candidasake等在以色列、西班牙和德國等國家已經(jīng)被商品化,然而在實(shí)踐中,接受和廣泛使用拮抗酵母菌作為生物防治產(chǎn)品仍然是有限的[11-12]。我國研究者從上世紀(jì)90年代開始研究拮抗菌防治果蔬采后病害,到目前為止雖然獲得了一些對水果采后病害有明顯抑制效果的拮抗酵母菌[13-15],但是在生防菌商業(yè)化生產(chǎn)方面卻是一片空白,迄今為止還未見能替代化學(xué)殺菌劑的拮抗酵母菌產(chǎn)品問世。

本文主要研究從蘋果表皮分離、純化并篩選出對引起蘋果腐敗的P.expansum、A.alternata和A.niger有拮抗作用的酵母菌,并對可能涉及到的機(jī)理進(jìn)行初步探索,旨在為蘋果采后病害的生物防治技術(shù)發(fā)展和推動拮抗酵母菌的商業(yè)化應(yīng)用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

富士蘋果 產(chǎn)自于大連瓦房店,取大小均一、無病蟲害、無損傷、完全成熟的果實(shí);腐敗霉菌:擴(kuò)展青霉(P.expansum)、互隔交鏈格孢霉(A.alternata)和黑曲霉(A.niger) 保存在大連民族大學(xué)菌種保藏庫中,用前進(jìn)行活化并確定它們具有感染能力[16];含抗生素馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(YPD)和酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基(YEPD)等生物試劑、吐溫-80、明膠等試劑均為化學(xué)純(CP) 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;葡萄糖、無水乙醇等試劑 均為分析純(AR),天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;溴甲酚紫、苯酚紅等指示劑 北京化學(xué)試劑公司。

VS-1300 超凈工作臺 蘇州市蘇信凈化設(shè)備廠;OLYMPUS BX51偏光顯微鏡 日本Olympus公司;S-4800掃描電子顯微鏡 日本Hitachi公司;E-1010噴金儀 日本Hitachi公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酵母菌的分離、純化 蘋果用無菌刀削皮,將全部蘋果皮切碎并混勻,稱取25 g蘋果皮樣品,加入到225 mL無菌生理鹽水中,無菌均質(zhì)器拍打2 min,再梯度稀釋為10-1～10-5菌稀釋液。分別取0.1 mL各濃度的菌稀釋液涂布于PDA平板上,28 ℃下培養(yǎng)48 h,挑取培養(yǎng)特征各異的單菌落進(jìn)行平皿劃線分離,重復(fù)接種3代后轉(zhuǎn)接斜面。在轉(zhuǎn)接斜面的同時(shí)制片做純度檢查,若不純應(yīng)進(jìn)一步純化。4 ℃保存純化菌種,并為不同顏色和形態(tài)的菌編號。

1.2.2 拮抗酵母菌的篩選 將酵母菌接種在YPD固體培養(yǎng)基上劃線活化,挑取單菌落于YEPD培養(yǎng)基中,28 ℃ 180 r/min-1振蕩培養(yǎng)24 h,作種子液備用。參照Hao等人的方法[17],配制濃度為1×109CFU/mL的酵母菌懸液備用。將腐敗霉菌制備成濃度為105個(gè)/mL的孢子懸浮液。參照Qin等人[18]的方法,將蘋果用200 mg/kg的安替富民溶液浸泡10 min清洗消毒。無菌條件下,在其腰部刺4 mm深×4 mm寬的傷口。每個(gè)蘋果4個(gè)傷口,空白(不接任何菌)、20 μL無菌水接種1個(gè)傷口,20 μL酵母菌接種2個(gè)傷口。2 h后,除空白外的其他3個(gè)傷口均接入20 μL腐敗霉菌孢子懸浮液。將蘋果分裝到無菌保鮮盒中,用保鮮袋密封,28 ℃下,培養(yǎng)5 d。每天測病斑直徑。每種酵母菌對于每種腐敗霉菌重復(fù)10個(gè)蘋果。

1.2.3 拮抗酵母菌的鑒定 參照《酵母菌的特征與鑒定手冊》觀察拮抗酵母菌的生長和形態(tài)特征,分別做糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)(測試糖類為葡萄糖、蔗糖和乳糖)、硝酸鹽利用、類淀粉生成、重氮基蘭和脲酶實(shí)驗(yàn)[19]。

拮抗酵母菌ITS通用引物由寶生物工程(大連)有限公司合成,進(jìn)行序列測試,之后通過GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)進(jìn)行同源性搜索,與已報(bào)道真菌菌株的ITS 區(qū)序列進(jìn)行同源性比較,最后通過MEGA6.0,Neighbor-joining法建立進(jìn)化樹。

1.2.4 拮抗酵母菌最佳拮抗?jié)舛鹊暮Y選 將篩選出的拮抗酵母菌配制成濃度為107、108、109和1010CFU/mL的菌懸液,按照上述步驟1.2.2進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 拮抗酵母菌生防機(jī)理的初步探究

1.2.5.1 牛津杯平板抑菌實(shí)驗(yàn) 參照劉佳等人的方法[20],略有改進(jìn),在PDA培養(yǎng)基平板一端的牛津杯中加入酵母菌懸液100 μL(對照用無菌水),另一端放置直徑6 mm的腐敗霉菌菌餅,25 ℃培養(yǎng)3～5 d,檢測酵母菌周圍產(chǎn)生的抑菌圈。

1.2.5.2 拮抗酵母菌對蘋果腐敗霉菌孢子萌發(fā)率和芽管長度的影響 參照閆巖[14]等人的方法觀察測定蘋果腐敗霉菌的萌發(fā)數(shù)和萌發(fā)孢子的芽管長度。

1.2.5.3 拮抗酵母菌與腐敗霉菌在蘋果傷口處的相互作用 將按1.2.2接種過拮抗酵母菌和腐敗霉菌的蘋果傷口組織用刀片切取3 mm×5 mm×1 mm小塊,樣品在2.5%的戊二醛溶液中4 ℃固定過夜。連續(xù)7 d,每天取樣。

固定的樣品→蒸餾水清洗三次→乙醇梯度脫水處理→100%的乙醇處理兩次→乙酸異戊酯處理→真空冷凍干燥→樣品用導(dǎo)電硅膠固定在樣品臺上→噴金30 s→掃描電鏡下進(jìn)行觀察、拍照[20]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS Statistics 18軟件進(jìn)行差異顯著性分析,利用Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果腐敗霉菌的拮抗酵母菌篩選結(jié)果

從蘋果中分離純化得到13株酵母菌,編號為Y1～Y13。在第5 d,濃度為109CFU/mL的13種酵母菌拮抗腐敗霉菌的結(jié)果如圖1,其中Y0為無菌水代替酵母菌。接入拮抗酵母菌的蘋果的病斑直徑越小,說明抑制腐敗霉菌的效果越好。對于擴(kuò)展青霉,酵母菌Y1、Y4、Y9、Y12的防效較好;對于互隔交鏈格孢霉,酵母菌Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y8、Y9、Y12和Y13的防效較好;對于黑曲霉,拮抗酵母菌Y1、Y2、Y4、Y5、Y6、Y8、Y9和Y13的防效較好。綜合比較,Y4和Y9對三種腐敗霉菌都有較好的防效。

圖1 濃度為109 CFU/mL的13種 酵母菌對腐敗霉菌的拮抗效果Fig.1 Antagonistic effects of 13 kinds of yeast(109 CFU/mL)on spoilage molds of apples

2.2 酵母菌的鑒定結(jié)果

2.2.1 拮抗酵母菌的菌落形態(tài) 兩種酵母菌的菌落形態(tài)如圖2,酵母菌Y4菌落呈白色,大而濕潤,表面有光澤,容易挑起,邊緣光滑;酵母菌Y9菌落呈黑灰色,大而濕潤,容易挑起,邊緣光滑。通過鏡檢和生理生化實(shí)驗(yàn)初步鑒定酵母菌結(jié)果如表1。根據(jù)《酵母菌的特征與鑒定手冊》,初步鑒定Y4為假絲酵母屬(Candidaspp.);Y9為短梗霉屬(Aureobasidiumspp.)。

表1 酵母菌的鏡檢和生理生化結(jié)果Table 1 Microscopy and physiological and biochemical results of yeast

圖2 Y4和Y9在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of Y4 and Y9 on PDA

2.2.2 拮抗酵母菌Y4和Y9的ITS序列分析鑒定結(jié)果 對Y4和Y9的ITS基因片段進(jìn)行擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,Y4和Y9的ITS基因序列的特異性擴(kuò)增條帶分別為514 bp和576 bp。將測得的ITS 區(qū)序列通過GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)進(jìn)行同源性分析比較得出,Y4和Candidarailenensis的相似度為100%;Y9與Metschnikowiasp.和Aureobasidiumpullulans的相似度均為100%。用MEGA6.0進(jìn)行序列比對,比對結(jié)果用 Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,結(jié)果見圖3。由系統(tǒng)發(fā)育樹顯示,Y4與C.railenensis位于同一分支,且進(jìn)化距離最短;Y9與A.pullulans位于同一分支,且進(jìn)化距離最短。結(jié)合Y4和Y9的菌落形態(tài)特征、生理生化和分子鑒定結(jié)果,確定Y4為C.railenensis,Y9為A.pullulans,其中A.pullulans是一種類酵母真菌,最終得到一種拮抗酵母菌C.railenensis。

圖3 酵母菌Y4(a)和Y9(b)的ITS系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of yeast based on ITS sequence of Y4(a)and Y9(b)

2.3 酵母菌拮抗蘋果的腐敗霉菌最佳濃度篩選

圖4可見,C.railenensis的濃度為108、109、1010CFU/mL時(shí)對擴(kuò)展青霉、互格交鏈格孢霉和黑曲霉都有明顯的拮抗作用,且菌液濃度為109、1010CFU/mL時(shí)防效較好。綜上可見,C.railenensis的最佳濃度為109CFU/mL,對擴(kuò)展青霉、互隔交鏈格孢霉和黑曲霉的抑制作用較好。

圖4 不同濃度C. railenensis對蘋果腐敗霉菌的拮抗結(jié)果Fig.4 Antagonistic effects of different concentrations of C. railenensis on spoilage molds of apples注:a.擴(kuò)展青霉,b.互隔交鏈格孢霉,c.黑曲霉;Y4(7)、Y4(8)、Y4(9)和Y4(10)分別代表酵母菌Y4的 濃度為107、108、109和1010 CFU/mL。

2.4 C. railenensis牛津杯平板抑制效果

牛津杯平板抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,對照組對三種腐敗霉菌均無抑菌圈,而濃度109CFU/mL的C.railenensis對擴(kuò)展青霉、互隔交鏈格孢霉和黑曲霉的抑菌圈分別達(dá)到(10.3±1.3)、(13.5±2.1)和(10.1±1.2) mm,均有顯著的抑制作用(p<0.05)。

2.5 拮抗酵母菌對蘋果腐敗霉菌孢子萌發(fā)和管芽生長的影響

由表2可知,對于擴(kuò)展青霉,對照組24 h后的孢子萌發(fā)率和芽管長度分別為97.4%和60.0 μm,在有C.railenensis拮抗處理的情況下,24 h后P.expansum的孢子萌發(fā)率為5.0%,芽管長度為12.6 μm,顯著低于對照組(p<0.05);對于互隔交鏈格孢霉,對照組24 h后的孢子萌發(fā)率和芽管長度分別為95.1%和53.4 μm,在有C.railenensis拮抗處理的情況下,24 h后A.alternata的孢子萌發(fā)率為5.9%,芽管長度為13.0 μm,顯著低于對照組(p<0.05);對于黑曲霉,對照組24 h后的孢子萌發(fā)率和芽管長度分別為97.5%和73.5 μm,在有C.railenensis拮抗處理的情況下,24 h后A.niger的孢子萌發(fā)率為7.7%,芽管長度為17.1 μm,顯著低于對照組(p<0.05)。

表2 C. railenensis對腐敗霉菌孢子萌發(fā)率和芽管生長的影響Table 2 Effect of C. railenensis on the spore germination rate and germ tube growth of spoilage molds

2.6 拮抗酵母菌與腐敗霉菌在蘋果傷口處的相互作用

由圖5a和5b,接種后第1 d,C.railenensis孢子利用蘋果的營養(yǎng)多處出芽繁殖;接種后第3 d,在蘋果傷口上大量繁殖,孢子的表面分泌產(chǎn)生一層絲網(wǎng)狀物質(zhì),并且可觀察到假菌絲。由圖5c～5e,C.railenensis大量繁殖,包圍并吸附擴(kuò)展青霉、互隔交鏈格孢霉和黑曲霉的孢子。由圖5f,接種第6 d后,擴(kuò)展青霉長出菌絲體、分生孢子梗及大量分生孢子,但仍有大量C.railenensis可附著在菌絲體和分生孢子梗上。C.railenensis對互隔交鏈格孢霉和黑曲霉的拮抗效果較好,接種后第7 d,C.railenensis拮抗互隔交鏈格孢霉和黑曲霉的蘋果表面仍未觀察到互隔交鏈格孢霉和黑曲霉菌絲體。

圖5 C. railenensis與蘋果腐敗霉菌的相互作用Fig.5 Interaction of C. railenensis and spoilage molds on apples注:圖中所指為C. railenensis;圖中所指為腐敗霉菌;(a)為接種后第1 d;(b)為接種后第3 d;(c)～(e)C. railenensis 分別包圍和附著擴(kuò)展青霉、互隔交鏈格孢霉和黑曲霉的孢子;(f)接種后第6 d,C. railenensis吸附擴(kuò)展青霉菌絲體。

3 討論

近幾年,已經(jīng)證實(shí)一些拮抗酵母菌能夠生物控制蘋果采后在貯藏期間由霉菌侵染引起的病害。范青等發(fā)現(xiàn)Triehosporonsp.能夠抑制蘋果采后的灰霉和青霉病[22]。Ha?ssam綜合分析比較Pichiaanomala在生產(chǎn)、活性機(jī)理、生態(tài)特性和實(shí)驗(yàn)效果等方面的優(yōu)勢,認(rèn)定Pichiaanomalastrain K能夠高效可靠地拮抗蘋果采前和采后灰霉病和青霉病[23]。Calvo發(fā)現(xiàn)通過使用酵母混合物拮抗,增加拮抗菌用量也能提高生物防控蘋果采后灰霉和青霉病的效果[24]。近幾年,還有一些研究者用茉莉酸甲酯、甜菜堿等生物保鮮劑來增強(qiáng)拮抗酵母菌對蘋果采后霉腐病的效果[25-26]。本研究從蘋果中分離出對引起蘋果病害的P.expansum、A.alternata和A.niger均具拮抗作用的拮抗酵母菌C.railenensis。有研究報(bào)道從橘葉中分離到的C.railenensis對導(dǎo)致橘子青霉病的主要腐敗霉菌Penicilliumdigitatum有拮抗作用[27],并未對其拮抗機(jī)理進(jìn)行進(jìn)一步研究。目前還未見從蘋果中分離得到C.railennsis的報(bào)道,本文首次對C.railennsis用于生物防控蘋果多種采后病害和拮抗作用機(jī)理進(jìn)行了研究報(bào)道。

通常認(rèn)為營養(yǎng)與空間競爭是拮抗酵母菌的主要抑病機(jī)理,此外還可以通過與病原菌發(fā)生直接作用、分泌抑菌物質(zhì)和誘導(dǎo)寄主對病原菌的抗性來抑制病原菌。本研究中C.railenensis的抑菌濃度較高,使其在與腐敗霉菌的營養(yǎng)與空間競爭上具有群體優(yōu)勢,C.railenensis能夠顯著抑制三種腐敗霉菌生長、孢子萌發(fā)和管芽生長。通過掃描電鏡觀察到C.railenensis通過包圍和吸附擴(kuò)展青霉、互隔交鏈格孢霉和黑曲霉的孢子,占據(jù)腐敗霉菌的入侵位點(diǎn),成為所處環(huán)境下的優(yōu)勢菌株,進(jìn)而與它們競爭營養(yǎng)和空間,使得腐敗霉菌因營養(yǎng)和空間不足而生長繁殖延緩,從而抑制腐敗霉菌孢子的萌發(fā)及生長繁殖。C.railenensis還能夠吸附P.expansum菌絲體與其直接作用。此外,C.railenensis孢子表面分泌產(chǎn)生一層絲網(wǎng)狀粘狀物質(zhì)為生物膜,該生物膜有助于拮抗酵母菌孢子附著于與蘋果組織、腐敗霉菌孢子的接觸面,推測其含有水解酶對蘋果組織和腐敗霉菌具有消解作用,并且孢子表面分泌的物質(zhì)覆蓋了聚集在一起的分生孢子表面,該物質(zhì)還可能有助于它們之間生物信號的傳導(dǎo)和營養(yǎng)物質(zhì)的傳輸。C.railenensis表面分泌的物質(zhì)含何種水解酶,以及它誘導(dǎo)蘋果產(chǎn)生抗性的能力還有待進(jìn)一步研究。可見C.railenensis生防效果的發(fā)揮是多種方式共同作用的綜合結(jié)果。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)分離鑒定得到一種拮抗酵母菌C.railenensis,它能夠同時(shí)對引起蘋果采后病害的P.expansum、A.alternata和A.niger具有拮抗作用。C.railenensis的最佳拮抗?jié)舛葹?09CFU/mL,能夠顯著抑制(p<0.05)P.expansum、A.alternata和A.niger的菌絲生長、孢子萌發(fā)和芽管生長。

通過掃描電鏡觀察到C.railenensis接種后能夠在蘋果傷口處快速大量繁殖,孢子的表面分泌產(chǎn)生一層生物膜;C.railenensis的孢子能夠包圍和吸附P.expansum、A.alternata和A.niger的孢子,并且它還能夠吸附P.expansum菌絲體與其直接作用。綜合可見,C.railenensis主要是通過營養(yǎng)與空間競爭對三種腐敗霉菌發(fā)揮拮抗作用,并且通過多種作用方式共同發(fā)揮生防效果。