知母多糖對鏈脲佐菌素 誘導(dǎo)糖尿病大鼠的降血糖作用

侯紅瑞,陳 玲,孫國勇,李炳輝

(1.茂名職業(yè)技術(shù)學(xué)院,廣東茂名 525000;2.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,廣東廣州 510640)

糖尿病是一組以慢性血糖水平增高為特征的代謝性疾病群,高血糖由于胰島素分泌缺陷和胰島素抵抗引起,長期慢性高血糖誘發(fā)脂肪和蛋白代謝紊亂,繼而引起一系列視網(wǎng)膜、腎臟、神經(jīng)、心血管系統(tǒng)的并發(fā)癥,對人類健康、壽命和生活質(zhì)量構(gòu)成嚴(yán)重威脅[1]。雖然臨床治療藥物種類不少,但大多為化學(xué)藥物(西藥)[2]。西藥在控制血糖方面療效值得肯定,但長期使用存在許多副作用,如惡心、厭食、肝腎損傷等,且價格昂貴。中醫(yī)治療糖尿病也有相當(dāng)長的歷史,傳統(tǒng)中醫(yī)把糖尿病稱作“消渴癥”,《黃帝內(nèi)經(jīng)》及《金匱要略》就有關(guān)于糖尿病發(fā)病癥狀及機(jī)理的記載[3]。中藥對于改善機(jī)體狀況,減輕發(fā)病癥狀,尤其在治療糖尿病并發(fā)癥方面有著穩(wěn)定的療效,并且與西藥相比,作用溫和持久,毒性和不良反應(yīng)少[4]。因此研究和開發(fā)具有良好療效的中藥降血糖產(chǎn)品具有廣闊的發(fā)展前景。

知母為百合科植物知母[AnemarrhenaasphodeloidesBge.(AA)]的干燥根莖,具有清熱瀉火、生津潤燥,止渴除煩等功效[5],有悠久的降血糖應(yīng)用歷史,從傳統(tǒng)治療糖尿病的中藥方劑“玉液湯”到現(xiàn)代中成藥人知降糖膠囊、降糖舒膠囊等均含有知母。知母化學(xué)成分多樣而復(fù)雜,目前發(fā)現(xiàn)的有皂昔、雙苯吡酮類、多糖類、有機(jī)酸類等[6-9]。研究表明知母中的皂昔、多糖均具有抗糖尿病的作用[10-11],尤其是知母多糖在降血糖和抗氧化性方面效果顯著。目前已有相關(guān)文獻(xiàn)報道,但是目前文獻(xiàn)研究知母多糖降血糖的報道中知母多糖均是水提、醇提或醇沉法制備而得,所得知母多糖成分復(fù)雜、純度低,其抗氧化及降血糖的有效部位較模糊[12-14]。

本文對知母根莖水提、醇沉,得到知母粗多糖后,除去蛋白質(zhì),再利用無機(jī)陶瓷膜進(jìn)行膜分離得到分子量為30～100 kDa的知母多糖。本課題組前期對該知母多糖進(jìn)行生物活性研究中發(fā)現(xiàn),其具有良好的體外抗氧化性尤其在清除·OH方面效果突出,并對胰島素受體和底物磷酸化水平起負(fù)調(diào)控作用的蛋白絡(luò)氨酸磷酸酶1B(PTP-1B)活性有很高抑制率(達(dá)69.39%)[15]。為進(jìn)一步深入探討分子量為30～100 kDa知母多糖的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及降血糖作用機(jī)制,本文用鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)建立實驗性SD大鼠糖尿病模型[16],研究該知母多糖對STZ型糖尿病SD大鼠降血糖、降血脂效果,為知母深層次藥用開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

知母 購自廣州致信中藥飲片廠,產(chǎn)地河北,批號081101,為知母根莖切片;鏈脲佐菌素(AR) 美國Sigma公司;二甲雙胍片 河北天成藥業(yè)有限公司;總膽固醇試劑盒、甘油三酯試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇試劑盒 中生北控生物科技有限公司;胰島素測定試劑盒 美國ADL公司。

ALPHA2-4真空冷凍干燥機(jī) 德國Christ公司;Labscale超濾系統(tǒng) 美國Milipore公司;3K30超速冷凍離心機(jī) 德國Sigma公司;BX51TRF熒光顯微鏡 日本Olympus公司;血糖測定儀(穩(wěn)豪倍易型) 美國強(qiáng)生公司。

SPF級SD大鼠 40只,雄性,體重130±3克/只,由廣東省醫(yī)學(xué)動物實驗中心提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 知母多糖的提取分離 知母根莖切片后在沸水中提取4 h,提取3 次,收集提取液,減壓濃縮至適當(dāng)體積后加4 倍體積無水乙醇放置過夜,4000 r/min離心,真空冷凍干燥得知母多糖粗提物,4 ℃密封干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

配制5%的知母多糖粗提液置于-20 ℃冰箱中冷凍過夜后室溫緩慢融化,高速離心(8000 r/min)重復(fù)4次,直至沒有殘渣,用Sevage法去除蛋白至無游離蛋白為止,Sevage法去除蛋白后的知母多糖在室溫,0.2 MPa壓力下經(jīng)0.3 μm孔徑的無機(jī)陶瓷膜微濾[17]。所得濾液在0.35 MPa壓力下用30、100 kDa的膜包進(jìn)行膜分離,收集分子量為30～100 kDa知母多糖組分,采用苯酚-硫酸法[18]測得分子量介于3～100 kDa的組分中知母多糖含量占總組分質(zhì)量的75%。

1.2.2 STZ型糖尿病SD大鼠動物模型的建立 將40只SD大鼠分成4 組,10 只/組,在動物房內(nèi)溫度為22 ℃和相對濕度為60%的條件下飼養(yǎng)。大鼠適應(yīng)環(huán)境3 d后對大鼠進(jìn)行糖尿病造模。STZ用0.1 mol/L,pH4.5的檸檬酸鈉緩沖液新鮮配制。大鼠禁食不禁水12 h之后,STZ 90 mg/kg給大鼠尾靜脈一次注射造模?；謴?fù)進(jìn)食72 h后尾靜脈取血測血糖,以血糖值在16～24 mmol/L的大鼠為成模動物[19]。根據(jù)成模的血糖值將大鼠隨機(jī)分成三組,每組10 只,分別為高血糖模型組、二甲雙胍組、知母多糖組。隨機(jī)取10 只未造模正常大鼠作為正常對照組。正常對照組及模型組均灌胃給予等量生理鹽水,二甲雙胍組灌胃給予二甲雙胍300 mg/kg,知母多糖組灌胃給予知母多糖300 mg/kg,每天給藥1次,連續(xù)給藥4周。

1.2.3 實驗指標(biāo)測定 連續(xù)給藥4周,每周末禁食不禁水12 h,稱重后,取尾部靜脈血測量空腹血糖,并根據(jù)公式(1)計算血糖抑制率。給藥4周后,禁食不禁水12 h,頸椎脫臼處死大鼠采血2 mL,3000 r/min離心分離血清,用試劑盒測定血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C),低密度脂蛋白膽固醇(LDC-C)。采用放射性免疫法測定血清胰島素(FINS),根據(jù)公式(2)計算胰島素抵抗指數(shù)(IRI)[20],用以評價外周胰島素的抵抗程度。

血糖抑制率(%)=(給藥前空腹血糖值-給藥后空腹)/給藥前空腹血糖值

式(1)

式(2)

1.2.4 糖尿病SD大鼠胰腺病理組織學(xué)觀察 頸椎脫臼處死大鼠后,迅速摘取完整的胰腺組織,置于冰冷的生理鹽水中漂洗,除去血液并仔細(xì)分離多余的脂肪組織。取相同部位的胰腺組織,放入10%的中性福爾馬林溶液固定,每例均進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色和石蠟包埋,切片在光學(xué)顯微鏡下觀察[21]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 知母多糖對糖尿病SD大鼠體重的影響

由表1可知,給藥前各組SD大鼠體重?zé)o顯著差異(p>0.05);給藥第4周,與正常對照組比較,模型組的SD大鼠體重極顯著下降(p<0.01),表現(xiàn)出糖尿病的明顯特征。二甲雙胍組在給藥后的前2周體重出現(xiàn)持續(xù)下降,給藥3周之后體重開始恢復(fù),與模型組比較有極顯著差異(p<0.01),說明降血糖藥物有減輕糖尿病SD大鼠消瘦癥狀的作用。知母多糖組的SD大鼠體重在前3周也出現(xiàn)逐漸下降的趨勢,與模型組比較,下降趨勢緩慢,給藥3周后有顯著差異(p<0.05),經(jīng)4周治療后,體重恢復(fù)至造模開始時體重。表明,知母多糖能減緩糖尿病SD大鼠體重負(fù)增長趨勢,促進(jìn)SD大鼠體重正增長,對糖尿病SD大鼠體重下降有一定的緩解作用。

表1 各實驗組SD大鼠體重的變化Table 1 The body weight change of SD rats from each

2.2 知母多糖對糖尿病SD大鼠空腹血糖的影響

造模成功后的SD大鼠空腹血糖值與正常組相比,極顯著高于正常值(p<0.01),4 周給藥期間,模型組的血糖值較為穩(wěn)定,沒有出現(xiàn)自我恢復(fù)的現(xiàn)象,二甲雙胍組和知母多糖組SD大鼠的空腹血糖值均顯著下降,與模型組比較差異極顯著(p<0.01),結(jié)果見表2。4周給藥后,二甲雙胍組血糖值逐漸降低至大鼠正常水平(<7.5 mmol/L),血糖抑制率達(dá)到69.3%,說明二甲雙胍處理對糖尿病SD大鼠血糖有很好的控制作用;知母多糖組SD大鼠的血糖值呈逐漸下降趨勢,降低程度較二甲雙胍組有所減緩,至4周后降低至接近大鼠正常血糖水平,與模型組相比有極顯著差異(p<0.01),血糖抑制率達(dá)到62.4%,略低于二甲雙胍組。說明知母多糖對STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠具有較好的降血糖效果。

表2 知母多糖對STZ致糖尿病SD大鼠空腹血糖的影響Table 2 Effects of AM on FBG of streptozotocin-induced diabetic

2.3 知母多糖對糖尿病SD大鼠血脂的影響

灌胃4周后,取血清測總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。結(jié)果見表3。

表3 知母多糖對STZ致糖尿病SD大鼠血脂的影響Table 3 Effects of AM on blood-lipid of streptozotocin-induced diabetic

由表3可看出,與正常對照組比較,模型組的TC、TG、LDL-C含量均高于正常對照組,HDL-C低于正常對照組,且存在極顯著性差異(p<0.01),血清TG、TC含量是判定高血脂癥的重要指標(biāo),說明STZ致糖尿病SD大鼠出現(xiàn)脂代謝紊亂,有高血脂表現(xiàn)。給藥4周后,知母多糖組SD大鼠血清中的TC水平與模型組相比極顯著降低(p<0.01),TG水平顯著降低(p<0.05),說明知母多糖具有降低血清TC、TG水平的作用。有研究表明,HDL-C含量越低,則冠心病的發(fā)病率越高,是冠心病的負(fù)危險因素[22]。與模型組比較,知母多糖組SD大鼠血清中的HDL-C水平極顯著升高(p<0.01),LDL-C水平極顯著降低(p<0.01),說明知母多糖具有升高HDL-C水平,降低LDL-C水平的作用。二甲雙胍組與模型組比較,SD大鼠血清中的TG水平未降低反而極顯著升高(p<0.01),TC、HDL-C、LDL-C指標(biāo)無顯著差異(p>0.05)。表明知母多糖可降低糖尿病SD大鼠的總膽固醇(TC)和甘油三脂(TG),升高高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C),降低低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C),對STZ致糖尿病引起的高血脂癥有預(yù)防及治療作用。

2.4 知母多糖對糖尿病SD大鼠空腹胰島素的影響

胰島素是人體胰腺β細(xì)胞分泌的調(diào)節(jié)體內(nèi)糖代謝的內(nèi)分泌激素,也是身體內(nèi)主要的降血糖激素。胰島素抵抗是胰島素作用的器官、組織,如肝臟、肌肉、脂肪等體內(nèi)周圍組織對胰島素的敏感性降低,對胰島素不敏感,反應(yīng)性降低或消失,外周組織如肌肉、脂肪對胰島素促進(jìn)葡萄糖攝取的作用發(fā)生了抵抗,從而引起一系列病理變化與臨床疾病。降低患者的胰島素抵抗,改善胰島素敏感性,可延緩糖尿病發(fā)展。

從表4可以看出,STZ致糖尿病SD大鼠模型組與正常對照組相比胰島素水平顯著升高(p<0.05),且胰島素抵抗指數(shù)(IRI)極顯著升高(p<0.01),出現(xiàn)明顯胰島素抵抗。給藥4周后,與模型組比較,二甲雙胍組和知母多糖組SD大鼠血清胰島素顯著降低(p<0.05),IRI極顯著降低(p<0.01),胰島素抵抗明顯改善。說明知母多糖能有效改善STZ致糖尿病SD大鼠的胰島素抵抗,且效果與二甲雙胍相當(dāng),通過改善胰島素抵抗,實現(xiàn)對胰腺β細(xì)胞功能的保護(hù)來治療糖尿病。

表4 知母多糖對STZ致糖尿病SD 大鼠胰島素的影響Table 4 Effects of AM on FINs of streptozotocin-induced diabetic

2.5 知母多糖對糖尿病SD大鼠胰腺組織學(xué)的影響

如圖1所示,對胰腺組織形態(tài)的觀察結(jié)果表明,正常對照組胰島為圓形或橢圓形的細(xì)胞團(tuán),細(xì)胞核大小均勻,分散于胰腺腺泡之間,胰島中細(xì)胞數(shù)量較多,細(xì)胞分布均勻,排列規(guī)整,結(jié)構(gòu)清晰,與周圍胰腺組織邊界清晰可辨。模型組胰島結(jié)構(gòu)紊亂,形態(tài)不規(guī)則,組織疏松,外分泌腺邊界不太清晰,胰島內(nèi)分泌細(xì)胞分布不均,細(xì)胞數(shù)目減少。知母多糖組胰島結(jié)構(gòu)較清晰,邊緣整齊,細(xì)胞分布比較均勻,組織緊湊,胰島細(xì)胞數(shù)目相對于模型組增多但仍顯著少于正常對照組。說明知母多糖可改善糖尿病大鼠胰腺萎縮情況,減輕STZ對SD大鼠胰島細(xì)胞的選擇性損傷,對糖尿病大鼠胰腺有較好的保護(hù),并能增加胰島細(xì)胞數(shù)量、提高胰島細(xì)胞功能。

圖1 知母多糖對STZ致糖尿病SD 大鼠胰島組織形態(tài)影響(×50)Fig.1 Effect of AM on the islet morphology of streptozotocin-induced diabetic rats (hematoxylin-eosin stain,×50)注:a.正常對照組;b.高血糖模型組;c.知母多糖組。

3 結(jié)論

本文采用鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)建立實驗性SD大鼠糖尿病模型,探究分子量30～100 kDa知母多糖組分的降血糖機(jī)制。結(jié)果表明,給藥治療4周后,與模型組相比,分子量30～100 kDa知母多糖可有效地降低糖尿病SD大鼠血糖值,血糖抑制率達(dá)到62.4%,且SD大鼠體重呈現(xiàn)升高趨勢;糖尿病SD大鼠血清中的TC、TG、LDL-C含量降低,HDL-C含量升高,改善了糖尿病SD大鼠脂代謝紊亂;可顯著降低SD大鼠血清胰島素和IRI,對胰島素抵抗改善明顯;HE染色觀察后發(fā)現(xiàn)知母多糖可減輕STZ對SD大鼠胰島細(xì)胞的選擇性損傷,對被特異性破壞后胰島細(xì)胞有修復(fù)作用。結(jié)合本課題組前期對分子量30～100 kDa知母多糖組分在體外抗氧化和抑制PTP-1B活性的能力研究[15]可知,知母多糖的降血糖作用主要是通過提高抗氧化能力、改善胰島素抵抗和修復(fù)受損胰島細(xì)胞組織,實現(xiàn)對胰腺β細(xì)胞功能保護(hù),刺激胰島細(xì)胞增加胰島素的分泌,提高外周組織對胰島素的敏感性,從而起到降低血糖的作用。