XC-72/GCE修飾電極測定芹菜總黃酮的含量

曹宏梅，薛夢蝶，劉榮蘭，舒適，李玲，蘭月嬌，劉宇博，廉國乾，袁園，賴紅偉

（吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，吉林吉林 132013）

總黃酮（total flavonoids）是一類具有2-苯基色原酮（2-phenyl-chromones）結(jié)構(gòu)的植物次級代謝產(chǎn)物，其在蔬菜中（尤其是綠葉蔬菜）含量豐富，因具有較高的藥用價值和生產(chǎn)價值而受到國內(nèi)外研究者的重點關(guān)注[1,2]。研究表明，總黃酮抗氧化活性的強弱與其含量的高低具有較高的相關(guān)性[3～6]。因此，總黃酮含量的快速檢測成為熱點研究課題[7～9]。

在眾多的綠葉蔬菜中，芹菜（celery）是一種公認的降壓食品，這與其富含的總黃酮密切相關(guān)[10]。芹菜總黃酮含量的測定目前主要以光度法和色譜法為主[10～13]。如，趙剛等采用 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 法測定了芹菜中總黃酮的含量[10]；韓麗等采用HPLC法同時測定了新疆維藥芹菜根提取物中3種黃酮類成分的含量[11]；李琨等采用高效液相色譜法研究了不同芹菜品種中黃酮的含量和分布[12]；何書美等采用紅外光譜法測定了芹菜葉提取物中總黃酮的含量[13]。雖然芹菜總黃酮含量的測定取得了較大的研究進展，但以上方法仍存在著許多難以克服的弊端，為此亟待發(fā)展出一種低成本、耗時短和易操作的新方法來高靈敏地測定芹菜總黃酮。

近年來，電化學(xué)方法由于具有設(shè)備簡單、快速、靈敏度高等優(yōu)點而在化學(xué)分析中得到廣泛應(yīng)用，因而備受分析工作者的關(guān)注。與裸電極相比，諸多碳納米材料（如單/多碳納米管、（氧化）石墨烯、介孔碳等）修飾電極具有更好的選擇性和更高的靈敏度，被成功用于多種黃酮類化合物的檢測分析。如蘆丁[14]、槲皮素[15]、木犀草素[16,17]、α(γ)-山竹黃酮[18]、燈盞花素[19]、金銀花總黃酮[20]和毛蕊異黃酮[21]等。目前，有關(guān)XC-72導(dǎo)電碳黑在電分析檢測中的應(yīng)用鮮有報道，尤其是在天然產(chǎn)物分析檢測領(lǐng)域。因此，本文制備了XC-72導(dǎo)電碳黑修飾玻碳電極（XC-72/GCE），應(yīng)用循環(huán)伏安法和微分脈沖伏安法研究了蘆丁在該修飾電極的電化學(xué)行為，成功實現(xiàn)了對芹菜總黃酮的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 原料

新鮮整株芹菜購于吉林市多客源超市，由吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院賴紅偉副教授鑒定為傘形科植物旱芹（Apium graveolens var.dulcedc）的全草。

蘆丁標準品，上海源葉生物科技有限公司，批號153-18-4，純度≥95%。

水為二次蒸餾水，其余試劑均為分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

T6新世紀型紫外-可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；R-205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海申順生物科技有限公司；SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵，鞏義市英峪予華儀器廠；FA1104N型電子分析天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；KDM 型控溫加熱套，鄄城華魯電熱儀器有限公司；索氏提取器，建湖縣康達玻璃儀器有限公司；法國Bio-Logic VMP3多通道電化學(xué)工作站，大連華洋分析儀器有限公司；CHI104型3 mm直徑玻碳盤電極、CHI150型飽和甘汞電極、CHI115型鉑絲對電極，上海辰華儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 芹菜總黃酮的提取

提取芹菜總黃酮的方法及詳細步驟見我們之前的工作[22]。

1.3.2 芹菜總黃酮含量的電化學(xué)測定

1.3.2.1 玻碳電極預(yù)處理

將純玻碳電極依次用 1.0，0.3和 0.05 μm 的α-Al2O3粉末拋光，用去離子水和乙醇交替超聲清洗3次，然后用氮氣吹干，備用。

1.3.2.2 XC-72/GCE修飾電極的制備

精確稱量2 mg XC-72導(dǎo)電碳黑，用1 mL 80Vol%乙醇水溶液在超聲條件下分散30 min，使XC-72導(dǎo)電碳黑在溶液中形成黑色懸浮液。然后用微量進樣器吸取10 μL上述黑色懸浮液小心滴涂在玻碳電極表面，在空氣中自然晾干備用即得修飾電極。

1.3.2.3 電化學(xué)測試

采用三電極體系，其中，XC-72/GCE電極為工作電極（working electrode，WE），鉑絲電極為對電極（counter electrode，CE），飽和甘汞電極（saturated calomel electrode，SCE）為參比電極（reference electrode，RE），室溫下以不同 pH 值磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）為底液進行循環(huán)伏安（CV）或差分脈沖伏安（DPV）掃描。

為了作比較，本文中同時采用硝酸鋁顯色法測定了芹菜中總黃酮的含量。

1.3.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

本文中涉及的數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析均采用Origin Pro 8.5軟件來完成，所有樣品進行3次重復(fù)，結(jié)果以平均值表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 電化學(xué)反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.1.1 富集時間的影響

圖1 富集時間對蘆丁氧化峰電流的影響Fig.1 Effects of accumulation time on the oxidation peak current of 8.2×10-4 mol/L of rutin at XC-72/GCE electrode

采用循環(huán)伏安法探究了富集時間對 8.2×10-4mol/L蘆丁標準溶液氧化峰電流的影響。如圖1所示，在開路條件下，隨著富集時間的增加，蘆丁在XC-72/GCE修飾電極上的氧化峰電流隨之增大。當富集時間達到60 s時，其氧化峰電流達到最大值，其相對標準偏差（RSD）為 0.60%；繼續(xù)延長富集時間，蘆丁的氧化峰電流反而下降，這表明蘆丁在經(jīng)過60 s富集后在電極表面達到飽和。因此選擇開路富集1 min作為最佳的富集時間對蘆丁及芹菜總黃酮含量進行測定。

2.1.2 掃速的影響

圖2 掃速對蘆丁氧化還原峰電流及電位的影響Fig.2 Effects of scan rate (ν) on the redox current/potential at 8.2×10-4 mol/L of rutin

在pH值為2.0的條件下，采用循環(huán)伏安法探究了掃速對蘆丁標準溶液（8.2×10-4mol/L）氧化還原峰電流及電位的影響。由圖2a可知，隨著掃速逐漸增加，蘆丁氧化/還原峰電流隨著掃速的增大而增大，與掃速（ν）呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（圖2b），線性回歸方程為：Ipa(μA)=7.62 ν1/2(mV/s)-26.6(R2=0.9988) 和Ipc(μA)=-7.20 ν1/2(mV/s)+25.2（R2=0.9967），表明蘆丁在 XC-72/GCE修飾電極上的電化學(xué)過程屬于擴散控制。蘆丁的式量電位Ef（≈0.53 V）基本不隨掃速變化，而 ΔEp隨著掃速的增加而增大，表明蘆丁在XC-72/GCE修飾電極上發(fā)生的氧化還原反應(yīng)為一準可逆過程。由圖2c可知，在較高的掃速下蘆丁的氧化/還原峰電位（Ep）與掃速（ν）成對數(shù)關(guān)系，線性回歸方程為：Epa(V)=5.2×10-2lnν+0.316（R2=0.9878）和Epc(V)=-5.0×10-2lnν+0.730（R2=0.9880）。根據(jù) Laviron方程可計算出電子轉(zhuǎn)移數(shù)（n）約為1，電子傳遞系數(shù)（α）約為0.51，表明蘆丁在XC-72/GCE修飾電極上的電化學(xué)反應(yīng)是單電子過程。

2.1.3 pH值的影響

采用循環(huán)伏安法進一步探究了 XC-72/GCE修飾電極在不同pH值下對蘆丁標準溶液（8.2×10-4mol/L）的影響。

從圖3a中可知，PBS緩沖溶液的pH值對蘆丁的氧化還原峰電位和峰電流均有較大影響，這表明蘆丁的電化學(xué)反應(yīng)過程有質(zhì)子參與。隨著pH值的增加，氧化/還原峰電位負向移動并呈良好的線性關(guān)系（圖3b），線性回歸方程為 Epa(V)=-6.9×10-2pH+0.798(R2=0.9907) 和 Epc(V)=9.1×10-2pH-0.810（R2=0.9962）。從圖 3c可知，蘆丁氧化/還原峰電流隨pH值增大而減小，這說明H+參與了化學(xué)反應(yīng)。隨著pH值升高，氧化/還原峰電流負向移動，線性回歸方程為 Ipa(μA)=-1.7 pH+133（R2=0.9944）和 Ipc(μA)=1.5 pH-121（R2=0.9915）。當緩沖液的pH值為2.0時，測定蘆丁的氧化/還原峰電流達到最大，因此選擇pH值為2.0的PBS緩沖液作為底液。

圖3 pH值對蘆丁氧化還原峰電位及電流的影響Fig.3 Effects of pH value on the redox potential/current at 8.2×10-4 mol/L of rutin

2.2 差分脈沖伏安法測定芹菜總黃酮的含量

2.2.1 蘆丁標準曲線的建立

圖4 不同濃度蘆丁在XC-72/GCE修飾電極上的響應(yīng)Fig.4 Response of various concentrations of rutin on XC-72/GCE

采用 DPV法對一系列不同濃度的蘆丁標準溶液進行測量。在最優(yōu)測定條件下，測得蘆丁氧化峰電流與其濃度在 4.1×10-8～1.3×10-5mol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（圖 4），線性回歸方程為：Ip(μA)=2.87c(μmol/L)-0.934（n=17，R2=0.9971），檢出限（S/N=3）為 4.×10-14mol/L。

2.2.2 芹菜總黃酮含量的電化學(xué)測定

將 XC-72/GCE修飾電極用于芹菜總黃酮的含量測定，以標準曲線法進行測定。用加標法進行回收率實驗，回收率在97.6%～100.5%之間。

為了比較，同樣采用紫外-可見分光光度法測定了總黃酮含量。電化學(xué)法所測結(jié)果相當于 UV-Vis法的95.1%，這表明該法是一種新的測定芹菜總黃酮含量的有效方法。

表1 芹菜總黃酮的檢測結(jié)果和回收率Table 1 Determination results and recovery of total flavonoids in celery

2.2.3 重復(fù)性、穩(wěn)定性實驗

采用10支XC-72/GCE修飾電極對蘆?。?.2×10-4mol/L）標準溶液測定10次，DPV峰電流相對標準偏差（RSD）為 2.35%，表明修飾電極具有良好的重復(fù)性。將該修飾電極于4 ℃的冰箱中放置4 d，測定同一濃度的蘆丁標準溶液，其DPV峰電流保持在97.3%以上，表明XC-72/GCE修飾電極具有較好的穩(wěn)定性。

2.2.4 干擾實驗

在最佳測定條件下，采用DPV法對8.2×10-4mol/L的蘆丁及芹菜總黃酮進行干擾實驗，500倍的 Ag+、Fe3+、Br-、Na+、H2PO4-、K+、Mn2+、Cl-、Zn2+、SO42-、CO32-和檸檬酸對測定不干擾。50倍的麥芽糖、維生素C，維生素B1、十六烷基三甲基溴化銨、L-半胱氨酸、DL-丙氨酸、苯甲酸、蔗糖、葡萄糖和巴比妥干擾蘆丁及芹菜總黃酮的測定。

3 結(jié)論

本文以廉價的XC-72導(dǎo)電炭黑為電極修飾材料，采用簡單的滴涂法在純玻碳電極上成功制備了XC-72/GCE修飾電極。以蘆丁純品為對照品，分別采用循環(huán)伏安法和差分脈沖伏安法研究了蘆丁及芹菜總黃酮在該修飾電極上的電化學(xué)行為。實驗表明，XC-72/GCE修飾電極對蘆丁有明顯的電催化氧化作用，其氧化反應(yīng)為單電子單質(zhì)子過程。在最佳測定條件下，蘆丁的 DPV氧化峰電流與濃度在4.1×10-8～1.3×10-5mol/L范圍內(nèi)呈良好線性，其線性回歸方程為 Ip(μA)=2.87 c (μmol/L)-0.93（R2=0.9971），檢出限為4.1×10-14mol/L；電子傳遞系數(shù)為0.51。該修飾電極具有制備簡單，響應(yīng)迅速、重復(fù)性及穩(wěn)定性好、抗干擾能力強等優(yōu)點，可用于芹菜總黃酮含量的電化學(xué)測定，結(jié)果令人滿意。此外，本文中所建立的高靈敏電化學(xué)新方法對其他蔬菜總黃酮含量的測定具有重要的參考價值。