• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    灰樹花多糖的分離純化及其體外抗腫瘤活性

    2018-07-11 06:41:18陳沛劉會平孫娜新劉子天李委紅劉旭輝劉少娟
    現(xiàn)代食品科技 2018年6期
    關(guān)鍵詞:樹花單糖膜電位

    陳沛,劉會平,孫娜新,劉子天,李委紅,劉旭輝,劉少娟

    (天津科技大學食品工程與生物技術(shù)學院,天津 300457)

    灰樹花(Grifola frondosa),學名為“貝葉多孔菌”,俗稱“舞菇”[1],是一種珍貴的食、藥兼用真菌,夏、秋間常野生于栗樹周圍?;覙浠▽儆趽泳鷣嗛T、多孔菌科、樹花菌屬,也是世界上最主要的食用菌之一[2]。灰樹花不僅口感鮮美,含有豐富的蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素、多種微量元素,更具免疫活性和抗癌作用[3,4]。據(jù)報道,現(xiàn)已從灰樹花的子實體和液體培養(yǎng)的菌絲體中分離出多種有效的抗腫瘤多糖[5]。目前對灰樹花多糖的提取方法多為高溫提?。?0 ℃以上),以保證理想的提取率。但是提取工藝在優(yōu)化多糖提取條件的同時,應(yīng)綜合考慮多糖提取率和多糖活性兩個方面[6]。而多糖除來源外,提取溫度、提取時間和提取溶劑對提取多糖的理化性質(zhì)影響非常大[7,8],這表明不同提取條件下提取的多糖具有不同的生物活性。高溫還可能造成大分子活性物質(zhì)高級結(jié)構(gòu)發(fā)生不可逆的改變,從而影響其生物活性[9]。已有研究表明較低溫提取香菇多糖在增強巨噬細胞吞噬能力、刺激T淋巴細胞和B淋巴細胞增殖作用方面優(yōu)于高溫[6]?;覙浠ǘ嗵窃谄渲麈溄Y(jié)構(gòu)、單糖組成、分子量、支化度、溶解性、聚合物電荷和構(gòu)象上是多樣化的,這都可能影響多糖的活性。研究表明,來自赤芝的高分子量多糖(1086 ku)和(1→3)-β-D-葡聚糖(>788 ku)顯示出比其它較低分子量組分更好的抗腫瘤活性[10,11]。而已有研究表明,長期熱處理降低了灰樹花多糖β-D-葡聚糖的分子量,高分子量的β-D-葡聚糖(800 ku)顯示出比較低分子量的β-D-葡聚糖具有更強的免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤活性[7,8]。劉安軍[12]從黃芪中提取出新型冷水可溶性多糖,該多糖對腫瘤生長有明顯的抑制作用且能有效保護免疫器官,促進巨噬細胞吞噬功能,提高荷瘤小鼠外周血淋巴細胞亞群百分比。然而至今灰樹花多糖的提取主要采用傳統(tǒng)的熱水浸提法,也有研究發(fā)現(xiàn)以灰樹花菌絲體為原料,在不同培養(yǎng)基上浸提培養(yǎng)的五組多糖,4 ℃提取的多糖比100 ℃提取的多糖抗氧化活性更優(yōu)[13]。本文旨在研究低溫(4 ℃)條件下,灰樹花多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)表征及其抗腫瘤活性,為探索灰樹花的綜合利用提供科學依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    灰樹花子實體購自天津濱海新區(qū)超市;人肝癌HepG2細胞購自北京協(xié)和醫(yī)院細胞庫;人肝HL-7702細胞中國科學院上海細胞庫;無水乙醇、MTT、戊二醛等試劑均為國產(chǎn)分析純;線粒體膜電位檢測(JC-1)試劑盒Solarbio。

    1.2 儀器與設(shè)備

    紫外可見分光光度計,日本島津;二氧化碳培養(yǎng)箱、真空冷干燥機、冷凍離心機、離子色譜儀,美國Thermo;傅立葉變換紅外光譜儀,德國布魯克儀器公司;高效液相色譜儀,日本島津;掃描電鏡:日本日立;ECLIPSE TS100倒置熒光顯微鏡,日本Nikon。

    1.3 灰樹花多糖的提取和純化

    灰樹花經(jīng)過冷凍干燥機干燥后,粉碎,過80目篩子,稱重后置燒杯中,加20倍(m/V)超純水浸泡,密封后置于4 ℃浸提,12 h后浸提液6500 r/min離心10 min,重復(fù)離心兩次收集上清;將上清經(jīng)過反復(fù)凍融至原體積的 1/3,加無水乙醇置終濃度為 60%的乙醇中進行沉淀多糖。再將所得醇溶液在6500 r/min,10 min條件下離心,棄上清后得到灰樹花粗多糖。然后將該粗多糖充分溶解于超純水中,加入 1/4體積Sevage溶液(氯仿:正丁醇=4:1(V:V))用于去除蛋白,重復(fù)操作4~6次。將收集到的上清液氮吹除去正丁醇。再將該多糖溶液裝入 12~14 ku的截留分子量的透析袋中透析,透析于4 ℃持續(xù)3 d,每天換三次水。之后將透析袋內(nèi)溶液冷凍干燥,產(chǎn)物命名為GFP。

    1.4 單糖組成分析

    本試驗是在經(jīng)典的離子交換色譜法的基礎(chǔ)上改進的[14],采用離子色譜分離柱,以離子交換樹脂做固定相與流動相中的離子進行交換,利用待測離子對交換劑具有不同親和力這一原理實現(xiàn)分離[15]。在 10.0 mmol/L NaOH溶液為流動相的條件下,通過脈沖安培檢測器,分離檢測八種單糖。

    1.5 GFP的分子量測定及純度鑒定

    采用凝膠滲透高效液相色譜法鑒定灰樹花多糖的純度,并測定其分子量[16]。

    1.6 GFP的全波長掃描

    將GFP溶于水配成1 mg/mL的溶液,蒸餾水作參比,在200 nm~400 nm范圍內(nèi)進行紫外光譜掃描。

    1.7 GFP的糖含量測定

    本實驗以分析純葡萄糖為標準品,苯酚-硫酸法測定經(jīng)純化后的多糖樣品中糖的含量。

    1.8 GFP的紅外光譜鑒定

    將7 mg GFP和150 mg干燥的溴化鉀顆粒充分混合、研磨后在室溫下測定GFP的紅外光譜[16]。

    1.9 微觀形態(tài)觀察

    1.9.1 掃描電鏡觀察

    取適量的GFP粉末鋪在導(dǎo)電膠上,用洗耳球吹去表面浮樣。在離子濺射儀中噴金處理15 s左右,即可進行樣品掃描。觀察多糖樣品電鏡圖像,確定掃描視野,選定放大倍數(shù)為1000和2000,分別拍照記錄。

    1.9.2 原子力顯微鏡觀察

    將GFP凍干后,配制成0.1 μg/mL的溶液,之后取5 μL滴加到5 mm×5 mm的云母片上。經(jīng)過24 h烘箱 40 ℃晾干后,在室溫條件下,用掃描探針顯微鏡(SPI3800-SPA-400,Seiko Instruments Inc)在原子力顯微分析模式下以非接觸模式對樣品進行掃描和拍攝,掃描速率0.5 Hz,用的是金涂層Si3N4探針,橫向分辨率為0.2 nm,垂直分辨率為0.01 nm,最大掃描范圍為100 μm×100 μm。

    1.10 細胞增殖活性的測定

    通過MTT[17,18]測定法測定不同濃度GFP處理的HepG2細胞與HL-7702細胞的活力,根據(jù)吸光度值計算出GFP對細胞生長的抑制率。分別取對數(shù)期的細胞進行計數(shù),在96孔板中接種細胞,其密度大約5×104個/mL,體積為100 μL。16 h后棄去培養(yǎng)液,分別加入不同濃度(0、50、100、200、400 μg/mL)的GFP在96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。之后在每孔中加入等量的20 μL MTT溶液(5 mg/mL)。將96孔板在培養(yǎng)箱放置4 h并離心,然后棄去培養(yǎng)基,每孔加入150 μL DMSO并振蕩15 min以溶解形成的不溶性甲瓚。用酶標儀于570 nm處測量吸光度。

    其中A是GFP處理的細胞的平均光密度;B是對照孔的平均光密度。

    1.11 線粒體膜電位檢測

    本試驗采用JC-1染色[19],細胞培養(yǎng)如下:按大約2×105個/mL的細胞密度將細胞接種于六孔板中進行細胞培養(yǎng),16 h后棄培養(yǎng)基,用PBS洗3遍,加入含不同濃度的GFP(0、200、400 μg/mL)的DMEM培養(yǎng)基,以空白樣品組為對照組,每組設(shè)置3個平行復(fù)孔,37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。結(jié)束之后將培養(yǎng)基棄掉,用PBS緩沖液清洗三次。試驗方法按照試劑盒說明書進行。

    1.12 細胞形態(tài)學觀察

    將HepG2細胞(1×106個/mL)接種在6孔板內(nèi)蓋玻片(滅菌)上生長,16 h后用不同濃度GFP(0、200、400 μg/mL)處理,24 h后棄去培養(yǎng)基,加入4%戊二醛固定細胞4 h,30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%無水乙醇逐級脫水,掃描電子顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學變化。

    1.13 數(shù)據(jù)處理

    數(shù)據(jù)處理采用SPSS 20.0軟件和Sigma Plot10.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理。結(jié)果以平均值±標準差所表示。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 灰樹花多糖的單糖組成

    下圖1為2 mmol/L的標品的離子色譜圖,圖2為相同條件下GFP的離子色譜圖。

    圖1 八種單糖的離子色譜圖Fig.1 Ion chromatogram of eight monosaccharides

    圖2 GFP的單糖組分Fig.2 The monosaccharide component of GFP

    由離子色譜結(jié)果可知,GFP主要單糖為葡萄糖、半乳糖甘露糖。葡萄糖(40.51%~42.11%)和半乳糖(29.35%~30.35%)是主要的單糖,相對少量的是甘露糖(19.88%~20.72%),葡萄糖醛酸(1.43%~1.85%)也被發(fā)現(xiàn)在樣品中。這些結(jié)果表明,GFP主要由三種不同類型的單糖組成的雜多糖。之前也有研究發(fā)現(xiàn)不同提取溫度得到的三組灰樹花多糖樣品中葡萄糖是主要單糖(77.60%~80.90%),還有相對少量的半乳糖(7.10%~8.20%)、甘露糖(4.30%~5.80%)、巖藻糖(4.50%~5.40%)和核糖(1.70%~1.90%)[20],這與本試驗研究基本一致,均為不同單糖組成的雜多糖。

    2.2 GFP的分子量測定及純度鑒定

    本試驗采用分子排阻(凝膠滲透)高效液相色譜,以標準葡聚糖分子量對保留時間作多糖分子量標準曲線,根據(jù)多糖樣品色譜圖的保留時間計算多糖樣品平均相對分子量。

    根據(jù)試驗結(jié)果,本試驗低溫所提灰樹花多糖為混合物,因為它含有兩個主要的大分子群體。絕大部分為分子量為1700.00 ku大分子量,峰面積為66.57%。另外一部分的分子量為34.12 ku,其相應(yīng)的峰面積為28.23%。多糖分子的結(jié)構(gòu)和生物活性與多糖分子量大小直接相關(guān)。據(jù)報道,在提取過程中,高提取溫度可能導(dǎo)致高分子量群體的降解[20]。通常,小分子量多糖可能無法形成活性聚合體,表現(xiàn)出較低的生物活性[21]。

    圖3 GFP高效液相色譜圖Fig.3 High performance liquid chromatography of GFP

    2.3 GFP的紫外光譜掃描(UV)

    圖4 GFP全波長掃描Fig.4 The UV spectra of GFP

    圖4為GFP的紫外光譜圖,顯示其在200 nm有最大吸收峰,在260 nm和280 nm均無明顯的光吸收,說明GFP不含或含少量游離結(jié)合的蛋白質(zhì)、核酸類物質(zhì)。

    2.4 GFP的糖含量測定

    圖5 葡萄糖標準曲線Fig.5 Standard curve of glucose

    不同濃度分析純葡萄糖溶液為參照,用苯酚-硫酸比色法在 490 nm處測定各吸光度,以葡萄糖含量(μg/mL)為橫坐標,以吸光度值為縱坐標,繪制標準曲線,回歸方程為y=0.0019x-0.0035,R2=0.9996,測得GFP中糖含量為86.12%。

    2.5 GFP的紅外光譜鑒定

    采用傅立葉紅外光譜(FT-IR)分析GFP的官能團,從圖6中可推測GFP的結(jié)構(gòu)特征、糖殘基及其構(gòu)型。

    圖6 GFP紅外分析圖譜Fig.6 Infrared spectrum of GFP

    圖譜中寬峰3415 cm-1波段代表了O-H拉伸振動。2918 cm-1左右的帶是由C-H伸縮振動導(dǎo)出的,在2919 cm-1和2000 cm-1處的弱吸收峰為C-H拉伸振動的特征峰,這一區(qū)域的吸收峰是糖類的特征吸收峰;1420 cm-1和1250 cm-1左右的寬帶可歸屬于C-H鍵的彎曲。在1175~1000 cm-1的范圍內(nèi),是由C-O、C-C、C-O-C和C-O-H的拉伸和彎曲振動造成的,其強信號大約為1076 cm-1處[22]。

    這些結(jié)果都是蘑菇多糖的典型紅外信號。1050 cm-1左右的特征帶也表明GFP中存在一個吡喃環(huán),這說明GFP糖環(huán)構(gòu)型為吡喃型;β型糖苷鍵的吸收峰在890 cm-1左右處,圖譜中804 cm-1的吸收峰表明糖苷鍵可能為α型,這些結(jié)果表明灰樹花多糖GFP可能為α-吡喃多糖。這進一步證實了低溫浸提的灰樹花粗多糖水與高溫相比理化性質(zhì)相似,而其差別在于其分子量大小[20]。

    2.6 微觀形態(tài)分析

    GFP的掃描電鏡圖片(×1000倍和×2000倍)如圖 7(a、b)所示。GFP的原子力顯微鏡圖片如圖7(c、d)所示。

    掃描電鏡能夠直觀的分析研究多糖微觀形態(tài)及空間構(gòu)象[23],能快速有效地獲得待測物的三維立體圖像,還能細微的觀察測定被測樣品的每一個角度,不受待測樣品狀態(tài)影響[24]。

    圖7 GFP微觀形態(tài)Fig.7 GFP Microscopic morphology

    通過圖7a、b中可以看出,多糖呈片層狀或碎屑狀,表面質(zhì)地光滑,多糖分子間具有較強的相互作用力,聚集程度大。因為原子力顯微鏡成像的高度不可能“擴大效應(yīng)”的影響,而將不同長度和寬度卻會受到測量位置不同的影響,高度可以作為一個分子直徑的參考。通常來說,多糖分子鏈一般為0.1~1.0 nm。圖7c、d所顯示的最大累積高度約為20 nm,這說明每股并非為單個糖鏈,這可能是由于此多糖分子含有少量糖醛酸照成的,糖鏈上糖醛酸羧基或羧基負離子上的強電負性氧原子與另一糖鏈上的羥基氫易于形成分子間氫鍵這是由多糖分子末端羥基之間氫鍵。由于濃度低,沒有形成復(fù)雜的鏈狀或網(wǎng)狀與多個糖鏈纏繞成股的結(jié)構(gòu)。

    2.7 GFP對HepG2細胞增殖活性的影響

    多糖及其衍生物不僅作為能量的儲存和結(jié)構(gòu)成分,還參與信號識別和細胞間通訊,并在免疫系統(tǒng)、受精、發(fā)病機制、血液凝固和系統(tǒng)發(fā)育等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[25]。多糖還可以識別并結(jié)合一系列的細胞黏附分子進而發(fā)揮活性[26]。

    從圖8(b)可看出,GFP對人肝HL-7702細胞的增殖幾乎沒有抑制作用,當其濃度為50 μg/mL~400μg/mL時,對HL-7702細胞的增殖抑制作用與不添加多糖樣品的沒有明顯的差異,說明GFP對正常細胞沒有增殖抑制作用。如圖8(a)所示,不同濃度的GFP作用24 h后,可明顯抑制HepG2細胞的增殖,且隨著濃度的增加,抑制率不斷增加,并呈現(xiàn)出濃度依賴關(guān)系。當GFP濃度為200 μg/mL時,其抑制率達到49.12%,當GFP濃度增加為400 μg/mL時,抑制率達到 76.45%。所以,低溫提取的灰樹花多糖 GFP對HepG2細胞增殖有顯著的抑制作用,其抑制效果優(yōu)于灰樹花深層發(fā)酵菌絲體多糖抗腫瘤活性[27]。

    圖8 GFP不同濃度對hepG2細胞(a)和HL-7702(b)細胞增殖的影響Fig.8 Effects of different concentrations of GFP on the proliferation of hepG2 cells

    2.8 線粒體膜電位檢測

    圖9 GFP作用于HepG2細胞的JC-1染色圖Fig.9 JC-1 staining of HepG2 cells treated with GFP

    細胞凋亡早期的標志性變化之一就是線粒體膜電位的下降。本試驗中線粒體膜電位檢測是以JC-1為熒光探針來檢測線粒體膜電位的變化,在線粒體膜電位較高時,JC-1以聚合物形式聚集在線粒體的基質(zhì)中,產(chǎn)生紅色熒光;在線粒體膜電位較低時,JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中,此時JC-1為單體,可以產(chǎn)生綠色熒光。通過熒光顏色的轉(zhuǎn)變來檢測線粒體膜電位的變化。由圖9可知,對照組A中JC-1表現(xiàn)為紅色熒光,與之相比,在有GFP處理的情況下,HepG2細胞綠色熒光明顯增多,并且伴隨著GFP濃度的增加細胞中的綠色熒光所占的比例越來越多,說明線粒體膜電位降低。線粒體膜電位的降低作為線粒體膜去極化的結(jié)果,是線粒體損傷的一個指標[28],是凋亡的初始和不可逆步驟[29]。由此可以說明GFP對HepG2細胞有促凋亡的作用,并且GFP誘導(dǎo)的細胞凋亡伴隨著膜電位的改變。

    2.9 GFP誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡的形態(tài)學觀察

    圖10 掃描電鏡觀察GFP誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡圖Fig.10 Observation of HepG2 cell apoptosis induced by GFP under scanning electron microscope

    上圖10為GFP處理HepG2細胞24 h的掃描電鏡觀察的細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)。由圖10可以看出,經(jīng)過不同濃度GFP處理24 h的細胞形態(tài)發(fā)生顯著變化。不經(jīng)GFP處理的對照組HepG2細胞,細胞膜完整,表面微絨毛豐富且完整、規(guī)則排列、長絲突起分布均勻,細胞間鑲嵌連接[30]。經(jīng)GFP作用24 h后,試驗組細胞呈現(xiàn)細胞調(diào)亡形態(tài),胞體體積縮小,表面微絨毛卷曲、崎變、小球結(jié)構(gòu)逐漸增多,細胞質(zhì)形成空泡,細胞間緊密連接結(jié)構(gòu)消失,微核形成。這些結(jié)果與其他類型的細胞中觀察到的細胞凋亡趨勢一致[31],可以看出GFP誘導(dǎo)人肝癌HepG2細胞凋亡。

    3 結(jié)論

    本研究利用低溫(4 ℃)提取灰樹花多糖,得到了有較好的抗腫瘤作用的功能性多糖GFP。結(jié)構(gòu)鑒定其主要單糖為葡萄糖、半乳糖和甘露糖,含有兩個主要的大分子群體,可能為α-吡喃多糖。細胞體外增殖抑制實驗(MTT)表明GFP在一定濃度范圍內(nèi)能夠抑制肝癌細胞株HepG2的生長。通過JC-1試驗檢測到線粒體膜電位降低,說明GFP誘導(dǎo)的細胞凋亡伴隨著膜電位的改變。對HepG2細胞形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn),經(jīng)過GFP處理的HepG2細胞出現(xiàn)了凋亡形態(tài)。這說明低溫提取的灰樹花多糖有一定的抗腫瘤作用。Wang[32]等研究結(jié)果表明,含有甘露糖并伴隨有葡萄糖和半乳糖存在的多糖組分具有較高的抑瘤活性,單糖組成不同,其結(jié)構(gòu)和功能也有所不同。另外分子質(zhì)量也是影響多糖活性的一個重要因素,這可能與多糖分子能否形成高級結(jié)構(gòu)有關(guān),GFP分子質(zhì)量相對較大可能有三股螺旋結(jié)構(gòu)存在,可以產(chǎn)生能形成活性的聚合結(jié)構(gòu)。而多糖分子的立體構(gòu)型發(fā)生改變,活性也會隨之消失。這在理論研究和產(chǎn)品開發(fā)上都具有非常重要的意義。

    猜你喜歡
    樹花單糖膜電位
    感恩生活,給生命一樹花開——讀《花田半畝》有感
    井岡教育(2022年2期)2022-10-14 03:11:40
    有關(guān)動作電位的“4坐標2比較”
    參芪復(fù)方對GK大鼠骨骼肌線粒體膜電位及相關(guān)促凋亡蛋白的影響研究
    送你一樹花
    陌上花開文學社:播撒文學之種,靜待一樹花開
    學生天地(2019年36期)2019-08-25 08:59:44
    海藻多糖的單糖組成對體外抗氧化活性的影響
    蹄葉槖吾葉多糖提取工藝優(yōu)化及單糖組成研究
    HPLC-ELSD法測定煙草中單糖含量
    魚藤酮誘導(dǎo)PC12細胞凋亡及線粒體膜電位變化
    灰樹花中鋅的存在形態(tài)分析
    久久精品国产亚洲av高清一级| 少妇熟女aⅴ在线视频| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 深夜精品福利| 久久精品91无色码中文字幕| 老司机福利观看| 国产激情欧美一区二区| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 色综合亚洲欧美另类图片| 久久中文字幕一级| 人人妻人人澡人人看| 精品久久久久久久久久免费视频| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 啦啦啦 在线观看视频| 久久久久九九精品影院| 亚洲精品国产色婷婷电影| 757午夜福利合集在线观看| 婷婷精品国产亚洲av在线| 欧美日本中文国产一区发布| 日韩有码中文字幕| 丝袜美足系列| 最好的美女福利视频网| 制服丝袜大香蕉在线| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 久久久久精品国产欧美久久久| 亚洲国产精品合色在线| 国产主播在线观看一区二区| 中国美女看黄片| 国产激情久久老熟女| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 久久久久亚洲av毛片大全| 久久香蕉国产精品| 青草久久国产| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 国产一区二区在线av高清观看| 男人操女人黄网站| 黄色毛片三级朝国网站| 男人舔女人的私密视频| 亚洲人成77777在线视频| 午夜精品久久久久久毛片777| 91老司机精品| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 天天添夜夜摸| 久久草成人影院| av电影中文网址| 亚洲伊人色综图| 色综合站精品国产| 精品无人区乱码1区二区| 99精品在免费线老司机午夜| 波多野结衣高清无吗| 国产精品日韩av在线免费观看 | 欧美av亚洲av综合av国产av| 18禁美女被吸乳视频| 亚洲一区高清亚洲精品| 日韩精品中文字幕看吧| 黄色女人牲交| 真人一进一出gif抽搐免费| 久久热在线av| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 丝袜美腿诱惑在线| 老司机午夜福利在线观看视频| 午夜福利影视在线免费观看| 国产成人系列免费观看| 日本 欧美在线| 久久久久精品国产欧美久久久| 亚洲五月色婷婷综合| 黄色女人牲交| 久久午夜亚洲精品久久| 亚洲欧美精品综合久久99| xxx96com| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 麻豆一二三区av精品| 欧美日韩黄片免| 韩国精品一区二区三区| 久久人人精品亚洲av| 一区福利在线观看| 最近最新免费中文字幕在线| 中文字幕最新亚洲高清| 老司机靠b影院| АⅤ资源中文在线天堂| 精品国产一区二区久久| 午夜日韩欧美国产| 久久久国产欧美日韩av| 久久久久久久久久久久大奶| 亚洲在线自拍视频| 欧美日韩黄片免| 日韩三级视频一区二区三区| 国产97色在线日韩免费| 一级a爱视频在线免费观看| 少妇被粗大的猛进出69影院| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 久久青草综合色| 午夜精品国产一区二区电影| 制服丝袜大香蕉在线| 91麻豆av在线| 日韩中文字幕欧美一区二区| 老汉色av国产亚洲站长工具| 国产单亲对白刺激| 又黄又爽又免费观看的视频| 深夜精品福利| 国产97色在线日韩免费| 欧美成人午夜精品| 亚洲av电影在线进入| 桃色一区二区三区在线观看| 国产精品1区2区在线观看.| 他把我摸到了高潮在线观看| 久99久视频精品免费| 99国产精品99久久久久| 久久狼人影院| 后天国语完整版免费观看| 国产激情欧美一区二区| 99re在线观看精品视频| 成年人黄色毛片网站| 国产精品野战在线观看| 欧美在线黄色| 中亚洲国语对白在线视频| 九色国产91popny在线| 悠悠久久av| 午夜福利免费观看在线| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 在线天堂中文资源库| 无人区码免费观看不卡| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 中国美女看黄片| 精品国产乱子伦一区二区三区| 亚洲专区中文字幕在线| cao死你这个sao货| 久久午夜综合久久蜜桃| 少妇粗大呻吟视频| 日日干狠狠操夜夜爽| 在线播放国产精品三级| 欧美一区二区精品小视频在线| 国产精品精品国产色婷婷| 精品日产1卡2卡| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| x7x7x7水蜜桃| 国产亚洲av高清不卡| 深夜精品福利| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 宅男免费午夜| 成人国语在线视频| 午夜两性在线视频| 亚洲九九香蕉| svipshipincom国产片| 老汉色∧v一级毛片| 一个人免费在线观看的高清视频| or卡值多少钱| 人妻久久中文字幕网| 国产亚洲av高清不卡| 欧美激情极品国产一区二区三区| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 久久香蕉精品热| 女性生殖器流出的白浆| 日本三级黄在线观看| 麻豆久久精品国产亚洲av| 极品教师在线免费播放| 国产在线精品亚洲第一网站| 国产精品久久久av美女十八| 69精品国产乱码久久久| 国产1区2区3区精品| 亚洲成人精品中文字幕电影| 后天国语完整版免费观看| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 满18在线观看网站| 国产精品野战在线观看| 午夜福利欧美成人| 一进一出抽搐动态| 亚洲五月色婷婷综合| 变态另类丝袜制服| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 亚洲精华国产精华精| 免费观看精品视频网站| 久久狼人影院| 日本vs欧美在线观看视频| 国产乱人伦免费视频| 国产黄a三级三级三级人| 老司机午夜福利在线观看视频| 亚洲三区欧美一区| 久久久久久久午夜电影| 久久伊人香网站| 午夜视频精品福利| 最近最新中文字幕大全免费视频| 国产精品野战在线观看| 国产欧美日韩一区二区三| 国产国语露脸激情在线看| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 亚洲人成77777在线视频| 日本三级黄在线观看| 日韩免费av在线播放| 亚洲一码二码三码区别大吗| 精品久久久久久久人妻蜜臀av | 女人精品久久久久毛片| 欧美日韩黄片免| 亚洲精品国产色婷婷电影| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 日日爽夜夜爽网站| 久热这里只有精品99| 女警被强在线播放| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 亚洲一区中文字幕在线| 国产成人精品在线电影| 亚洲在线自拍视频| 久久亚洲精品不卡| x7x7x7水蜜桃| 丝袜在线中文字幕| 视频在线观看一区二区三区| 国产免费男女视频| 亚洲中文av在线| 欧美中文综合在线视频| 精品人妻1区二区| 免费看十八禁软件| 欧美乱码精品一区二区三区| 欧美午夜高清在线| 欧美一级毛片孕妇| 日韩欧美国产一区二区入口| 男人操女人黄网站| 久久香蕉精品热| 国产精品av久久久久免费| 久久午夜综合久久蜜桃| 一区福利在线观看| 热99re8久久精品国产| 国产精品一区二区精品视频观看| 性色av乱码一区二区三区2| 淫妇啪啪啪对白视频| 97人妻精品一区二区三区麻豆 | 成年女人毛片免费观看观看9| 999精品在线视频| 黄频高清免费视频| 丝袜美足系列| 啦啦啦 在线观看视频| www.精华液| 97碰自拍视频| 久久久久九九精品影院| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 90打野战视频偷拍视频| 黑人欧美特级aaaaaa片| 国产精品久久久人人做人人爽| 亚洲成a人片在线一区二区| 亚洲三区欧美一区| 最近最新中文字幕大全免费视频| 国产亚洲精品一区二区www| 亚洲av美国av| 欧美中文综合在线视频| 国产又爽黄色视频| 在线av久久热| 日韩欧美国产一区二区入口| 亚洲人成电影免费在线| 中文亚洲av片在线观看爽| 一个人免费在线观看的高清视频| 国产激情欧美一区二区| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 国产片内射在线| 亚洲国产精品999在线| 欧美日韩一级在线毛片| 精品国产亚洲在线| www.www免费av| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 黄色视频,在线免费观看| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 国产91精品成人一区二区三区| 国产成人欧美在线观看| 99国产极品粉嫩在线观看| 大香蕉久久成人网| 久热爱精品视频在线9| 国产精品av久久久久免费| 欧美最黄视频在线播放免费| 黄片小视频在线播放| 亚洲欧美精品综合久久99| 大型黄色视频在线免费观看| 一级作爱视频免费观看| 国产成人欧美| 成人手机av| 成人国产综合亚洲| av视频在线观看入口| 久久精品国产综合久久久| 国产精品一区二区三区四区久久 | 国产1区2区3区精品| 国产私拍福利视频在线观看| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲自拍偷在线| 欧美日韩福利视频一区二区| 国产一区二区三区视频了| 性色av乱码一区二区三区2| 精品高清国产在线一区| 欧美日本中文国产一区发布| 日韩大尺度精品在线看网址 | 热re99久久国产66热| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 精品第一国产精品| 精品人妻在线不人妻| 成年女人毛片免费观看观看9| 成人国产一区最新在线观看| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 亚洲欧美激情在线| 午夜福利在线观看吧| 欧美性长视频在线观看| 一夜夜www| 91在线观看av| 天天添夜夜摸| 久久精品国产综合久久久| 亚洲精品粉嫩美女一区| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 国产精品免费一区二区三区在线| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 黄色成人免费大全| 满18在线观看网站| 亚洲一区中文字幕在线| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 91在线观看av| 亚洲性夜色夜夜综合| 日韩大尺度精品在线看网址 | 黑人操中国人逼视频| 99在线人妻在线中文字幕| 9色porny在线观看| 欧美黑人欧美精品刺激| 我的亚洲天堂| 午夜免费观看网址| 99久久综合精品五月天人人| 成人三级黄色视频| 成年女人毛片免费观看观看9| 午夜免费成人在线视频| 极品人妻少妇av视频| 大型黄色视频在线免费观看| 后天国语完整版免费观看| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 亚洲一码二码三码区别大吗| 手机成人av网站| 搡老妇女老女人老熟妇| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 两人在一起打扑克的视频| 精品电影一区二区在线| 日韩有码中文字幕| 日韩欧美国产一区二区入口| 亚洲人成电影免费在线| 欧美+亚洲+日韩+国产| 日韩有码中文字幕| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 国产成人av教育| 黄色 视频免费看| 男人的好看免费观看在线视频 | 亚洲自偷自拍图片 自拍| 99国产综合亚洲精品| 9191精品国产免费久久| 90打野战视频偷拍视频| 精品久久久精品久久久| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 精品高清国产在线一区| 极品教师在线免费播放| 国产免费男女视频| 欧美在线一区亚洲| 欧美精品亚洲一区二区| 1024视频免费在线观看| 亚洲电影在线观看av| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 日本一区二区免费在线视频| 好男人电影高清在线观看| 日韩有码中文字幕| 亚洲伊人色综图| 精品一区二区三区四区五区乱码| 最好的美女福利视频网| 欧美一级毛片孕妇| 日韩欧美一区视频在线观看| 久久午夜综合久久蜜桃| 99国产精品免费福利视频| 国产精品一区二区免费欧美| 在线天堂中文资源库| 中文字幕av电影在线播放| av有码第一页| 黑人操中国人逼视频| 极品教师在线免费播放| 天天一区二区日本电影三级 | 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 淫秽高清视频在线观看| 一本大道久久a久久精品| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 欧美乱色亚洲激情| 高清黄色对白视频在线免费看| 又黄又爽又免费观看的视频| 久久精品91无色码中文字幕| 精品国产亚洲在线| 久99久视频精品免费| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 精品一区二区三区四区五区乱码| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 色av中文字幕| 亚洲激情在线av| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 亚洲成人国产一区在线观看| 看免费av毛片| 黄色视频不卡| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 国产亚洲欧美在线一区二区| 欧美日本视频| 狠狠狠狠99中文字幕| 手机成人av网站| 午夜福利在线观看吧| 亚洲成人免费电影在线观看| 国产欧美日韩一区二区精品| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 亚洲人成伊人成综合网2020| 搡老岳熟女国产| 色av中文字幕| 亚洲,欧美精品.| 啦啦啦观看免费观看视频高清 | 在线十欧美十亚洲十日本专区| 亚洲黑人精品在线| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 亚洲五月婷婷丁香| 一区二区三区高清视频在线| 国产麻豆69| 国产男靠女视频免费网站| 亚洲免费av在线视频| 搡老岳熟女国产| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 亚洲av美国av| 色综合婷婷激情| 久久中文字幕人妻熟女| 女性被躁到高潮视频| 免费搜索国产男女视频| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 男男h啪啪无遮挡| 天堂动漫精品| 国产在线精品亚洲第一网站| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 丰满的人妻完整版| 国产一区二区在线av高清观看| 中文字幕久久专区| 一二三四社区在线视频社区8| 欧美久久黑人一区二区| 宅男免费午夜| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 亚洲国产精品sss在线观看| 很黄的视频免费| 精品电影一区二区在线| 成年人黄色毛片网站| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 最近最新中文字幕大全免费视频| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 中文字幕精品免费在线观看视频| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 久久国产精品人妻蜜桃| 精品国产一区二区三区四区第35| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 一级,二级,三级黄色视频| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 黄色视频,在线免费观看| 色播在线永久视频| 成人免费观看视频高清| 精品国产乱子伦一区二区三区| 欧美激情 高清一区二区三区| 欧美国产日韩亚洲一区| 在线观看一区二区三区| 亚洲人成伊人成综合网2020| 大型黄色视频在线免费观看| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 日本黄色视频三级网站网址| 麻豆av在线久日| 午夜激情av网站| 亚洲七黄色美女视频| 在线观看舔阴道视频| 露出奶头的视频| netflix在线观看网站| 亚洲九九香蕉| 精品不卡国产一区二区三区| 无人区码免费观看不卡| 在线观看一区二区三区| 精品国内亚洲2022精品成人| 免费看美女性在线毛片视频| 一边摸一边做爽爽视频免费| 亚洲人成伊人成综合网2020| 精品人妻在线不人妻| 国产99久久九九免费精品| 国产精品精品国产色婷婷| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 黄片播放在线免费| 天天添夜夜摸| 在线观看66精品国产| 可以在线观看的亚洲视频| 无遮挡黄片免费观看| 国产人伦9x9x在线观看| 精品久久久久久久毛片微露脸| 手机成人av网站| 麻豆国产av国片精品| 亚洲欧美日韩无卡精品| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产av精品麻豆| 国产精品免费视频内射| 热99re8久久精品国产| 日韩精品免费视频一区二区三区| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 91av网站免费观看| 激情视频va一区二区三区| 精品一区二区三区四区五区乱码| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 可以在线观看毛片的网站| 国产亚洲精品久久久久5区| 亚洲熟女毛片儿| 美女 人体艺术 gogo| 国产主播在线观看一区二区| 麻豆一二三区av精品| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 亚洲成人久久性| 亚洲一区高清亚洲精品| 日韩欧美三级三区| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 丝袜人妻中文字幕| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 在线播放国产精品三级| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 国产精品1区2区在线观看.| 黄色片一级片一级黄色片| 午夜福利欧美成人| 日日爽夜夜爽网站| 老鸭窝网址在线观看| 一进一出抽搐gif免费好疼| 午夜福利成人在线免费观看| 亚洲精品国产精品久久久不卡| www日本在线高清视频| 国产欧美日韩一区二区精品| 啦啦啦免费观看视频1| 怎么达到女性高潮| 国产av精品麻豆| 亚洲欧美激情在线| 性欧美人与动物交配| 岛国视频午夜一区免费看| 中文字幕精品免费在线观看视频| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 国产亚洲精品第一综合不卡| 久久影院123| 成在线人永久免费视频| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 狂野欧美激情性xxxx| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 99国产精品一区二区三区| 波多野结衣一区麻豆| 99re在线观看精品视频| 久久 成人 亚洲| 亚洲精华国产精华精| 亚洲伊人色综图| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 午夜亚洲福利在线播放| 老汉色∧v一级毛片| 成熟少妇高潮喷水视频| 国产精品日韩av在线免费观看 | 69精品国产乱码久久久| 一区福利在线观看| 亚洲国产欧美网| 午夜免费激情av| 午夜影院日韩av| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 日日干狠狠操夜夜爽| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 欧美国产日韩亚洲一区| 成在线人永久免费视频| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 国产一卡二卡三卡精品| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 男人操女人黄网站| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 亚洲国产欧美网| 男人的好看免费观看在线视频 | 精品人妻1区二区| 精品国产美女av久久久久小说| 9191精品国产免费久久| 国产亚洲av嫩草精品影院| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 亚洲色图综合在线观看| 母亲3免费完整高清在线观看| 亚洲精品在线观看二区| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产高清有码在线观看视频 | 国产熟女xx| 十八禁人妻一区二区| 日本欧美视频一区| 男男h啪啪无遮挡| 男人的好看免费观看在线视频 | 免费看a级黄色片| 黄色a级毛片大全视频| 久久久久久久精品吃奶| 亚洲伊人色综图| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 夜夜爽天天搞| 男女午夜视频在线观看| 欧美最黄视频在线播放免费| 国产精品久久视频播放| 亚洲国产精品sss在线观看| 国产成人免费无遮挡视频| 久久精品91无色码中文字幕| 在线视频色国产色| 亚洲 欧美一区二区三区| 视频在线观看一区二区三区| 国产成人系列免费观看| 99国产精品99久久久久| 久久性视频一级片| 久久亚洲精品不卡| 午夜福利影视在线免费观看| 99精品久久久久人妻精品| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 又黄又粗又硬又大视频| 在线观看日韩欧美| 免费av毛片视频| 欧美日韩瑟瑟在线播放|