白曲酸性蛋白酶在無孢黑曲SH-2中的克隆表達及酶學(xué)性質(zhì)分析

董文超，王斌，潘力

（華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510006）

白曲作為一種重要的麩曲，酸性蛋白酶對糧食原料顆粒的溶解作用，促進了糖化作用，提高了淀粉的利用率，在一定程度上提高了出酒率，在酸性條件下，將植物蛋白分解為各類氨基酸，為堆積過程中的美拉德反應(yīng)提供前提物質(zhì)[1]。并且白曲酸性蛋白酶影響著芝麻香酒中雜環(huán)化合物的數(shù)量和種類，對芝麻香酒的風(fēng)味有極其重要的影響。提高白曲酸性蛋白酶含量，對提高芝麻香酒的生產(chǎn)效率及穩(wěn)定和提高質(zhì)量都有重要的意義[2]。因此構(gòu)造一株能高效表達酸性蛋白酶，而不引入其他無關(guān)蛋白的菌株對白酒生產(chǎn)工藝的改進具有很好的應(yīng)用價值。

目前國內(nèi)生產(chǎn)的酸性蛋白酶基因來源主要是黑曲霉、宇佐美曲霉和米曲霉。費笛波[3]等對黑曲霉變異菌株6042進行液體深層發(fā)酵，經(jīng)4批次2300 L發(fā)酵罐擴大，使得酸性蛋白酶酶活達到了2535 U/mg，方春玉等[4]采用固體發(fā)酵技術(shù)，以黑曲霉為菌種，全面優(yōu)化發(fā)酵條件，使發(fā)酵產(chǎn)物酸性蛋白酶酶活達 24350 U/g，平均酶活提高64.6%，楊琥等[5]以畢赤酵母為宿主，表達宇佐美曲霉酸性蛋白酶基因（GenBankTM accession number XM_001401056），產(chǎn)物經(jīng)純化后比活性為4127.3 U/mg。胡穩(wěn)奇等[6]從土壤中分離出一株米曲霉菌株，在實驗室最適產(chǎn)酶條件下酶活達 6789.6 U/g。

運用誘變、基因重組及發(fā)酵優(yōu)化手段來提高黑曲霉、宇佐美曲霉和米曲霉源的酸性蛋白酶的報道，比較常見，但白曲霉源的酸性蛋白酶相關(guān)的報道很少見。其中，李杰等[7]構(gòu)建了黑曲霉表達載體pSZHG-pepB，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化黑曲霉 CICC2462，其發(fā)酵產(chǎn)物酸性蛋白酶酶活達5543 U/mL。楊猛等[8]白曲是以麩皮為原料，通過單因素試驗和正交試驗確定白曲的最佳配方，用此配方培養(yǎng)白曲36 h，酸性蛋白酶活力為l173 U/g。

本研究采用絲狀真菌表達系統(tǒng)，以經(jīng)基因工程改造的低內(nèi)源蛋白背景的無孢黑曲霉 SH-2為宿主，表達白曲霉酸性蛋白酶基因pepB，并且研究了表達產(chǎn)物的酶學(xué)性質(zhì)及酶活隨發(fā)酵pH的變化情況，為在釀酒工業(yè)中提高白曲酸性蛋白酶活力找到一個具有參考意義的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

黑曲酶SH-2和pMD18表達載體由本實驗室改造并保存，pepB目的片段由廣州艾基生物技術(shù)有限公司合成。

1.1.2 工具酶、試劑盒和試劑

PCR反應(yīng)預(yù)混酶 Prime STAR HS(premix)購自TaKaRa公司；抗生素Amp購自北京普博欣生物科技有限公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒和質(zhì)粒大量提取試劑盒購自廣州捷倍斯生物科技有限公司；膠回收試劑盒購自美國Omega公司；福林酚試劑購自北京普博生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

CD培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20，NaNO33，KCl2，MgSO4·7H2O 0.5，KH2PO40.01，pH 5.5（固體含 1.7%瓊脂，液體含0.05%瓊脂）。

蔗糖高滲培養(yǎng)基（g/L）：蔗糖 400，NaNO33，KCl2，MgSO4·7H2O 0.5，KH2PO40.01，pH 5.5（軟瓊脂含0.5%瓊脂，固體含1.7%瓊脂）。

淀粉發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：玉米淀粉50，玉米漿30，豆粕粉20。

淀粉培養(yǎng)基（g/L）：牛肉膏3，蛋白胨10，酵母粉2，NaCl 2，可溶性淀粉5，pH 5.5。

1.1.4 引物

實驗所用的引物如表1所示。

表1 引物Table 1 Primer

1.2 方法

1.2.1 pMD18-pepB表達載體構(gòu)建

表達載體圖譜如圖 1。以黑曲霉基因組為模板PCR擴增糖化酶啟動子PglaA，以廣州艾基生物技術(shù)有限公司合成的pepB質(zhì)粒為模板擴增 pepB片段。PCR反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性10 min；98 ℃變性30 s，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30個循環(huán)；第30個循環(huán)72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%凝膠電泳鑒定，將鑒定正確的PCR產(chǎn)物凝膠回收。PglaA、pepB、線性化后帶有表達元件的pMD18-T三片段在Infusion酶作用下進行連接，55 ℃反應(yīng)，15 min后得到連接液。用熱激法將連接液轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)Match1 T1，涂板于含有Amp抗生素的LB平板上，過夜培養(yǎng)后將陽性轉(zhuǎn)化子液體LB培養(yǎng)12 h。然后進行菌液PCR鑒定，挑取條帶正確的轉(zhuǎn)化子，送到廣州艾基生物技術(shù)有限公司測序。

圖1 pMD18-pepB表達載體圖譜Fig.1 Map of pMD18-pepB expression vector

1.2.2 PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化

黑曲霉常用的遺傳轉(zhuǎn)化方法包括孢子電轉(zhuǎn)化法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法、原生質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法等[9]。Meyer[10]對這些轉(zhuǎn)化方法的利弊進行了系統(tǒng)的分析，認為孢子電轉(zhuǎn)化法操作簡單，但轉(zhuǎn)化效率低。農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化雖具有轉(zhuǎn)化受體形式多樣、轉(zhuǎn)化效率較高、轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定、可轉(zhuǎn)移大片段、單拷貝比例高等優(yōu)點，但其操作復(fù)雜，周期長，轉(zhuǎn)化過程受多種因素影響。Michielse等[11]明確指出了農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法在黑曲霉中的轉(zhuǎn)化效率較低。原生質(zhì)體PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化具有操作簡單，轉(zhuǎn)化效率高的特點，對黑曲霉菌株而言是較為有效的遺傳操作方法。李秀鵬[18]、許曉紅[12]用PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法在無孢黑曲SH-2中都得到了成功實踐。

原生質(zhì)體的制備及轉(zhuǎn)化步驟詳見參考文獻[9,13]。轉(zhuǎn)化實驗設(shè)置如下：實驗組：將制得的原生質(zhì)體、pMD18-pepB質(zhì)粒和PEG緩沖液的轉(zhuǎn)化液加入到CD高滲軟瓊脂培養(yǎng)基中，混合均勻后，鋪在CD高滲培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)觀察。再生組：同實驗組，唯一不同的是將CD高滲軟瓊脂培養(yǎng)基中預(yù)先加入尿嘧啶核苷，該實驗組是檢驗原生質(zhì)體的制備效果，30 ℃培養(yǎng)觀察。陰性組：同實驗組，唯一不同的是將上述pMD18-pepB質(zhì)粒用無菌水代替，30 ℃培養(yǎng)觀察，記錄生長情況。

1.2.3 轉(zhuǎn)化子鑒定

隨機實驗組CD高滲培養(yǎng)基上至普通固體CD板進行擴大培養(yǎng)，5 d后挑取菌落，提取基因組，進行PCR鑒定。鑒定引物設(shè)置三對：gyrG-F/gyrG-R、pepA-F/pepA-R、PglaA-F/PglaA-R之后將定位都正確的轉(zhuǎn)化子保種。

1.2.4 轉(zhuǎn)化子發(fā)酵

發(fā)酵罐投料（30 L）：玉米漿3%、豆餅粉2%、玉米淀粉2%、麥芽糖漿（分消）3%、消泡劑 30 mL。除玉米漿和分消外，將原料投入發(fā)酵罐，調(diào)pH 6.0～6.2，加中溫淀粉酶和高溫淀粉酶，70 ℃保溫 20min，90 ℃保溫30 min，加入玉米漿，121 ℃～123 ℃，滅菌35 min。

發(fā)酵罐發(fā)酵相關(guān)參數(shù)：罐壓：0.05～0.06 MPa；罐溫：初始 34 ℃；轉(zhuǎn)速：200～800 r/min（根據(jù)溶氧可調(diào)）；溶氧：前期控制50%以上，中后期按最大轉(zhuǎn)速、風(fēng)量運轉(zhuǎn)；pH：初始pH 5.5，當(dāng)pH降至4.5時，補氨控制在4.8。在發(fā)酵48 h、72 h、96 h、120 h、144 h、168 h、192 h、216 h、240 h發(fā)酵上清液5 mL，-20 ℃保存。

1.2.5 發(fā)酵初始pH對產(chǎn)酶的影響

淀粉發(fā)酵培養(yǎng)基100 mL，分裝于500 mL錐形瓶中，用磷酸緩沖液調(diào)節(jié)pH分別至4.5、5.5、6.5，115 ℃滅菌。分別接種液體CD培養(yǎng)的重組菌株菌液1 mL于淀粉發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30 ℃、250 r/min條件下培養(yǎng)，分別在搖瓶24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h、168 h取發(fā)酵上清液5 mL，-20 ℃保存。

1.2.6 酶活測定與SDS-PAGE分析

采用Folin法測定蛋白酶酶活，以酪蛋白為底物，將其用乳酸緩沖液溶解，終濃度為10.0 g/L。反應(yīng)體系為4 mL，將1 mL酪蛋白溶液加入1 mL酶液中42 ℃條件下反應(yīng)10 min，加2 mL三氯乙酸終止反應(yīng)，對照組先向酶液中加入三氯乙酸以使酶失活。取過濾液1 mL加碳酸鈉溶液5.0 mL，再加福林試劑1 mL，42 ℃顯色20 min，于680 nm波長測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算酶活。酶活定義：溫度42 ℃條件下，1 min水解酪素，產(chǎn)生1 μmol酪氨酸所需要的酶量為一個酶活力單位。

重組轉(zhuǎn)化子發(fā)酵上清液清液40 μL，加入10 μL SDS loading，加熱煮沸5 min，取10 μL點樣，進行4～20% SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍R 250染色，脫色后檢測目的蛋白條帶，分析重組蛋白分子量。SDS-PAGE電泳方法參考《分子克隆手冊》。

2 結(jié)果與分析

2.1 pMD18-pepB表達質(zhì)粒構(gòu)建

分別以黑曲霉基因組和含有pepB的質(zhì)粒為模板，PCR得到PglaA片段和pepB片段。PCR產(chǎn)物凝膠電泳如圖2所示，分別在1500 bp附近和1000 bp～1200 bp處擴增出特異性條帶，與預(yù)期的PglaA片段（1500 bp）、pepB片段（1185 bp）大小相符。PglaA片段和pepB片段進行重疊PCR，產(chǎn)物片段回收。PglaA、pepB和pMD18連接后轉(zhuǎn)入大腸感受態(tài)細胞，挑取陽性轉(zhuǎn)化子，液體LB培養(yǎng)后，進行菌液PCR，電泳結(jié)果如圖3，2號泳道菌液在10000 bp附近出現(xiàn)特異性條帶，與pMD18-pepB質(zhì)粒（9380 bp）大小相符。將該菌液送廣州艾基生物技術(shù)有限公司測序，比對測序結(jié)果無基因突變，表明pMD18-pepB表達質(zhì)粒構(gòu)建成功，可以用于轉(zhuǎn)化曲霉。

圖2 PglaA片段和pepB片段PCR擴增Fig.2 PCR amplification of PglaA fragment and pepB fragment

圖3 菌液電泳Fig.3 Escherichia coli electrophoresis

2.2 轉(zhuǎn)化子鑒定

在絲狀真菌遺傳操作中，pyrG是常用的選擇性標(biāo)記，其編碼的乳清苷-5-磷酸脫羧酶（OMP）尿嘧啶核苷酸合成途徑中的關(guān)鍵酶，pyrG缺失菌株不具備尿嘧啶核苷酸合成能力。宿主無孢黑曲SH-2是gyrG缺陷菌株，pMD18-pepB表達載體帶有pyrG，因此陽性轉(zhuǎn)化子可以在不含尿嘧啶核苷的普通CD板上生長。轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)10 d，從實驗組轉(zhuǎn)化板上隨機挑陽性轉(zhuǎn)化子，至普通 CD板。提取基因組，用三對引物pepB-F/pepB-R、PglaA-F/PglaA-R、gyrG-F/gyrG-R進行PCR鑒定。PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果如圖4，對應(yīng)的pepB、PglaA、gyrG泳道分別在1000 bp～1200 bp、1400 bp～1600 bp、1000 bp～1200 bp處擴增出了明亮的特異性條帶，這與預(yù)期的 pepB（1185 bp）、PglaA（1500 bp）gyrG（1100 bp）條帶大小相符，說明目的基因表達框整合到了黑曲霉 SH-2基因組上。鑒定正確的轉(zhuǎn)化子用于發(fā)酵培養(yǎng)，以檢測目的蛋白。

圖4 轉(zhuǎn)化子PCR鑒定Fig.4 PCR identification of transformant

2.3 表達產(chǎn)物檢測

將定位正確的陽性轉(zhuǎn)化子在 30 L發(fā)酵罐中進行發(fā)酵，取48 h、72 h、96 h、120 h、144 h、168 h、192 h、216 h、240 h發(fā)酵上清液，稀釋 10倍后，進行SDS-PAGE檢測及酶活測定。如圖5，SDS-PAGE分析，47 ku附近處均有條帶，與已知報道的酸性蛋白酶條帶相符[14,15]，這說明白曲霉酸性蛋白酶與黑曲霉和宇佐美曲霉來源的酸性蛋白酶在分子量上沒有明顯差別。隨著發(fā)酵時間的增加，酸性蛋白酶條帶逐漸加深，并且酶活逐漸增加。在48 h～96 h內(nèi)，酶活增加較緩慢，96 h后酶活呈直線趨勢增加，在發(fā)酵240 h后，發(fā)酵粗酶液酶活達9972 U/mL。這與楊猛等[8]對白曲原始菌株進行優(yōu)化培養(yǎng)所得酸性蛋白酶酶活數(shù)據(jù)相比，酶活顯著提高，是原始菌株的 8.5倍。李杰等[7]用基因工程技術(shù)，使白曲酸性蛋白酶基因在黑曲CICC2462中得到了表達，重組菌株酶活為 5543 U/mL，與之相比，本實驗所得的重組菌株酶活提高了79.9%，與文獻報道[5,6,16,17]的其他來源的酸性蛋白酶酶活數(shù)據(jù)相比，也存在一定的優(yōu)勢，這主要與本研究中采用的宿主有關(guān)。黑曲酶具有很強的糖化酶分泌能力，使得其內(nèi)源表達自身的糖化酶過程中，消耗掉很多中間代謝物和能量，同時過量表達的糖化酶會對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等蛋白分泌途徑產(chǎn)生一定的壓力，若不能正確及時加工修飾成成熟蛋白分泌到胞外，將嚴(yán)重影響到其他蛋白的生成和分泌，限制外源蛋白的表達[18]。本研究中采用的宿主菌無孢黑曲SH-2，已敲除多拷貝糖化酶基因，為外源蛋白的表達提供了有力條件。同時，從重組菌株發(fā)酵液SDS-PAGE圖譜可以看出，其他分泌蛋白表達量很少，這為其作為添加菌用于釀酒工業(yè)提高白曲酸性蛋白酶酶活提供了可能。

圖5 白曲酸性蛋白酶SDS-PAGE分析及酶活測定Fig.5 Analysis of SDS-PAGE and enzymatic activity determination of acid protease

2.4 酶學(xué)性質(zhì)分析

2.4.1 最適溫度

圖6 溫度對酶活的影響Fig.6 Effect of temperature on enzyme activity

水浴鍋設(shè)置 25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃ 7個溫度梯度。在pH恒定條件下，測定在不同催化溫度下的酶活。結(jié)果如圖6所示，最適反應(yīng)溫度為35 ℃，在25 ℃～55 ℃范圍內(nèi)，酶活都保持在60%以上。酸性蛋白酶的活性一般在50 ℃以下可以保持穩(wěn)定，但也隨產(chǎn)酶的微生物菌源不同而有所差異[19]。黑曲霉SL22-111所產(chǎn)酸性蛋白酶最佳反應(yīng)溫度為 50 ℃。低于 45 ℃或高于 60 ℃，酶活急劇下降，70 ℃時酶活性完全喪失[14]，米曲霉MTCC5341所產(chǎn)酸性蛋白酶最適溫度為55 ℃，在30 ℃～60 ℃時酶活力較穩(wěn)定[20]，宇佐美曲霉L336酸性蛋白酶最適溫度較高，在 60 ℃以上[21]。因此白曲酸性蛋白酶與其他來源酸性蛋白酶相比，最適反應(yīng)溫度偏低。

圖7 pH對酶活的影響Fig.7 Effect of pH on enzyme activity

2.4.2 最適pH

用K2HPO4和KH2PO4不同配比得到pH為2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5的磷酸緩沖液，然后用其稀釋酶液，并配成不同pH的1%酪蛋白底物，在恒定溫度下，測定酶活。結(jié)果如圖7，可以看出當(dāng)pH為4時，酶的活性最高，pH低于或高于4，酶活都會降低。pH值對白曲酸性蛋白酶活力影響非常顯著，pH值小幅下降會引起酶活迅速下降，當(dāng)pH值為2.5時，酶基本失活，這均與酶結(jié)構(gòu)改變有關(guān)。與叢毛紅曲霉M.pilosus胞外酸性蛋白酶規(guī)律相似[22]，pH值改變導(dǎo)致酶蛋白空間構(gòu)象改變，甚至引起酶變性失活。在最適pH值時，酶的解離狀態(tài)往往是最有利于該酶與底物結(jié)合并發(fā)生催化反應(yīng)，使酶活力達到最大。袁康培等[23]對黑曲霉HU53酸性蛋白酶進行研究，得出其最適反應(yīng)pH為3.0、曾黎明等[24]報道的米曲霉酸性蛋白酶最適pH為6.0，楊琥[5]對宇佐美曲霉酸性蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)研究，表明其最適反應(yīng)pH為2.5。不同來源的酸性蛋白酶最適反應(yīng)pH不同，可能與其酶活性中心含有的羧基有關(guān)[25]。

2.4.3 金屬離子的影響

探究 Mn2+、Zn2+、Mg2+、Cd2+、Cu2+對酶活的影響，使以上各離子分別溶解于酶液中，終離子濃度為5 mmol/L。如圖 8，CK為空白對照組，可以看出，Mn2+、Cu2+對酶活有顯著的激活作用，酶活分別是對照組的3倍和2.5倍，Zn2+、Mg2+對酶活的影響作用不明顯，而Cd2+則對酶有明顯的抑制作用，使酶活低于對照組的 50%。戚淑威[15]研究的結(jié)果表明，Mn2+對該酶有明顯的激活作用，可使原始酶活提高2倍以上，張秀江[17]研究表明，在 5.0 mmol/L的濃度下，Mn2+對黑曲霉所產(chǎn)酸性蛋白酶有強烈的激活作用，達到對照酶活力的 150%?？梢姡鳛槟茱@著提高酸性蛋白酶酶活的金屬離子，Mn2+具有很大的應(yīng)用潛力。

圖8 金屬離子對酶活的影響Fig.8 Effect of ion types on enzyme activity

2.4.4 發(fā)酵初始pH對產(chǎn)酶的影響

用磷酸緩沖液調(diào)節(jié)淀粉發(fā)酵培養(yǎng)基的pH，來研究pH對產(chǎn)酶的影響。

圖9 不同發(fā)酵初始pH下的酶活測定Fig.9 Determination of enzyme activity under different initial pH of fermentation

設(shè)置pH 4.5、pH 5.5、pH 6.5三個梯度，取24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h、168 h發(fā)酵上清液樣品。SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖9，a、b、c對應(yīng)的發(fā)酵初始pH條件分別為pH 4.5、pH 5.5、pH 6.5，d相應(yīng)的酶活測定?？梢钥闯觯跁r間維度上，隨著發(fā)酵時間的增加，酸性蛋白酶表達量及酶活性逐漸增加。在初始pH 4.5～6.5范圍內(nèi)，提高發(fā)酵液初始pH，表達量及酶活性會有所增加。與方春玉等[4]、袁康培等[23]的報道相比偏高，這可能與宿主菌的生長最適條件有關(guān)。本研究采用的宿主無孢黑曲SH-2最適生長pH為5.5[18]，在其發(fā)酵過程中酸度會積累，從而解釋了發(fā)酵初始pH為6.5酶活會更高的情況。在酸性范圍內(nèi)，適當(dāng)?shù)卦黾又亟M菌株發(fā)酵液初始pH有利于酶活的提高。

3 結(jié)論

3.1 有關(guān)白曲酸性蛋白酶表達研究的報道比較少，本研究利用基因工程技術(shù)，使白曲霉酸性蛋白酶基因，在無孢黑曲SH-2中得到了表達。經(jīng)30 L發(fā)酵罐發(fā)酵240 h后，重組菌株發(fā)酵粗酶液酶活為9972 U/mL。酶活性質(zhì)研究表明，該酶的最適溫度為35 ℃，最適pH為 4，Mn2+、Cu2+對酶活有顯著的激活作用。在 pH 4.5～6.5范圍內(nèi)，適當(dāng)增大pH可以提高重組菌株在搖瓶發(fā)酵條件下酸性蛋白酶酶活。

3.2 本研究所用的宿主無孢黑曲SH-2經(jīng)過了糖化酶基因多拷貝的敲出，具有高表達、背景干凈的特點。重組菌株粗發(fā)酵液酶活是出發(fā)菌株酶活的8.5倍，與李杰等報道相比，酶活提高了 79.9%，與報道的其他來源的酸性蛋白酶表達也存在一定的優(yōu)勢，并且重組菌株背景單一，其他分泌蛋白表達量較少。因此，本研究所得的重組菌株有望用于白酒生產(chǎn)中調(diào)節(jié)糖化力和酸性蛋白酶活力的比例，來提高芝麻香酒的風(fēng)味。