經(jīng)培養(yǎng)基優(yōu)化所得牛樟芝及其功能飲料的護(hù)肝和降血糖作用

吳黌坦，吳曉露，陳煜沛，龐海月，黃立森，王貴弘，郭鐘達(dá)

（1.廈門醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)系，福建廈門 361023）（2.天然化妝品福建省高校應(yīng)用技術(shù)工程中心，福建廈門 361023）（3.中華科技大學(xué)生物科技系，臺(tái)灣臺(tái)北 11581）

酒精性肝病是由于長期大量飲酒所導(dǎo)致的肝臟損傷性疾病。研究表明，過度飲酒會(huì)增加高血壓、高血脂癥和冠狀動(dòng)脈硬化的風(fēng)險(xiǎn)，還會(huì)引起心臟、肝臟和腸胃等人體重要臟器損傷，造成心臟負(fù)擔(dān)加劇、肝硬化以及胃潰瘍等疾患。其中酒精代謝失調(diào)所導(dǎo)致的脂毒性、氧化應(yīng)激和炎癥等是酒精性肝病發(fā)生的重要原因[1,2]。調(diào)查顯示，我國酒精消費(fèi)人群中過量飲酒的比例高達(dá)49.1%，男性、女性分別為51.5%和32.1%，近年來酒精性肝病發(fā)病率逐年升高，已成為我國常見的肝臟疾病之一，嚴(yán)重危害人民的健康[3,4]。

糖尿病是一種以持續(xù)高血糖為主要特征，由遺傳和環(huán)境等多種因素造成的內(nèi)分泌代謝性疾病，且并發(fā)癥多，可以造成各種組織、臟器（如眼、腎、心臟、血管和神經(jīng)等）的長期損害、功能紊亂或衰竭。糖尿病治療時(shí)間長，費(fèi)用大，已成為世界上繼腫瘤和心腦血管疾病后第三位的慢性疾病[5,6]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國是全球糖尿病患者第一大國，2015年病患人數(shù)高達(dá)1.096億人，且約有130萬人死于糖尿病及其并發(fā)癥。同時(shí)據(jù)IDF預(yù)測，如果不加干預(yù)，2040年全球糖尿病患者將達(dá)6.42億，糖尿病前期人群4.81億，我國患者數(shù)量將上升至1.54億。

牛樟芝（Antrodia camphorata）又名牛樟菇，是一種原產(chǎn)于我國臺(tái)灣的珍稀藥用真菌。牛樟芝僅生長在臺(tái)灣特有百年以上的牛樟樹樹干腐朽的內(nèi)壁，或枯死倒伏的牛樟樹木材潮濕表面，因其異常珍貴，素有“臺(tái)灣森林中的紅寶石”、“靈芝之王”的美譽(yù)。現(xiàn)代研究表明，牛樟芝含有三萜類、多糖類和不飽和脂肪酸等多種生理活性物質(zhì)，具有抗氧化、抗炎、抑制腫瘤、降糖、護(hù)肝和增強(qiáng)免疫力等多種功效[7～11]。鑒于牛樟木這一宿主的稀缺性，再加上野生牛樟芝生長極其緩慢，造成目前市場上牛樟芝資源嚴(yán)重短缺且價(jià)格昂貴，制約了其藥用價(jià)值的開發(fā)和應(yīng)用，因此急需建立一種高質(zhì)、量產(chǎn)且培養(yǎng)周期較短的牛樟芝培養(yǎng)方法。目前，較為成功的牛樟芝人工培養(yǎng)方法有椴木栽培和液態(tài)發(fā)酵，前者以牛樟樹椴木為培養(yǎng)基，培養(yǎng)周期長（1～2年），成本高，生產(chǎn)效率低，難以大規(guī)模推廣；后者以液體發(fā)酵槽進(jìn)行菌種液體發(fā)酵，生產(chǎn)效率高，周期短，易于擴(kuò)大化培養(yǎng)，但難以取得野生牛樟芝特有的麥角甾烷型三萜類化合物[12]。針對(duì)以上兩種方法的不足，本文以MEA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，建立了一種經(jīng)培養(yǎng)基優(yōu)化的牛樟芝固態(tài)發(fā)酵法，并已取得較好的研究結(jié)果。本文對(duì)經(jīng)培養(yǎng)基優(yōu)化所得牛樟芝微粉的主要功效性成分進(jìn)行含量分析，以評(píng)估其品質(zhì)；同時(shí)通過乙醇誘導(dǎo)的急性酒精肝損傷小鼠模型和鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型，評(píng)價(jià)該牛樟芝微粉及其功能飲料護(hù)肝、降血糖及改善血脂代謝的功效，論證該牛樟芝固態(tài)發(fā)酵法的可行性，也為其進(jìn)一步的研究、應(yīng)用和推廣奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛樟芝微粉及其功能飲料，由臺(tái)灣中華科技大學(xué)生物科技系郭鐘達(dá)副教授提供；C57BL/6雄性小鼠，體重（20±2）g，SPF級(jí)，由廈門大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（閩）-2013-0001；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、過氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）、膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL）和高密度脂蛋白（HDL）試劑盒均購買自南京建成生物工程研究所；AMPKα、p-AMPKα(T172)、AKT、p-AKT(S473)和 GAPDH抗體均購自美國 Cell Signaling Technology公司；血糖測定試紙和血糖測定儀，德國Roche公司；鏈脲佐菌素（STZ）購自美國Sigma-Aldrich公司。其余試劑均為國產(chǎn)化學(xué)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

5417R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司；SpectraMax? I3多功能酶標(biāo)儀，美國 Molecular Devices公司；GZX-DH.500-BS-II電熱恒溫干燥箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；GNP-9080隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；TS-200脫色搖床，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；VE186轉(zhuǎn)移電泳槽、VE180微型垂直電泳槽和EPS600電泳儀，上海天能科技有限公司；ChemiDoc? XRS+化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 牛樟芝微粉的制備

本實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基以MEA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，經(jīng)優(yōu)化后確定為：葡萄糖40 g/L，麥芽浸膏20 g/L，大豆蛋白胨5 g/L，紫米粉1 g/L和瓊脂20 g/L。固態(tài)發(fā)酵牛樟芝2 m后，干燥、粉碎制成牛樟芝微粉。

1.3.2 牛樟芝微粉中多糖含量的測定

采用熱水浸提法制備多糖：溫度80 ℃，時(shí)間4 h，料液比40（mL:g）。離心（8000 r/min，10 min）后取上清，采用苯酚-硫酸法測定多糖含量[13]。

1.3.3 牛樟芝微粉中三萜類化合物含量的測定

采用醇提法制備三萜類化合物：75%乙醇，溫度80 ℃，時(shí)間 1.5 h，料液比 40（mL:g）。離心（4000 r/min，10 min）后取上清，采用香草醛-高氯酸法測定三萜類化合物含量[13]。

1.3.4 牛樟芝功能飲料的配方

本實(shí)驗(yàn)以經(jīng)培養(yǎng)基優(yōu)化所得牛樟芝微粉為基本原料，調(diào)配了一款牛樟芝功能飲料，其配方為：牛樟芝微粉10%，靈芝萃取物5%，綠茶萃取物3%，綜合蔬果酵素22%，其余部分為水。

1.3.5 急性酒精肝損傷小鼠模型的建立及分組給藥方案

選取50只C57BL/6雄性小鼠，體重（20±2）g，隨機(jī)分為5組：空白對(duì)照組、模型組、牛樟芝微粉低、中和高劑量組，每組10只。牛樟芝微粉低、中和高劑量組每天分別灌胃給予0.2、1和2 g/kg·bw牛樟芝微粉懸液，空白對(duì)照組和模型組以等體積生理鹽水代替，連續(xù)灌胃30 d。末次給藥后1 h，模型組和牛樟芝微粉各劑量組按12 mL/kg·bw劑量一次性灌胃給予60%乙醇，空白對(duì)照組以等體積生理鹽水代替，禁食12 h后處死小鼠并取樣：對(duì)小鼠進(jìn)行心臟穿刺取血，離心（13500 r/min，10 min）制備血清；同時(shí)收集小鼠肝臟組織，并凍于-80 ℃冰箱用后續(xù)各項(xiàng)指標(biāo)檢測分析。

1.3.6 糖尿病小鼠模型的建立及分組給藥方案

選取若干C57BL/6雄性小鼠，體重（20±2）g，禁食12 h后按照80 mg/kg·bw劑量一次性腹腔注射STZ，繼續(xù)喂養(yǎng)3 d后，禁食12 h，取小鼠尾靜脈血測定其空腹血糖值，當(dāng)血糖值≥11.1 mmol/L時(shí)判定建模成功。選取未經(jīng)處理的小鼠作為空白對(duì)照組，建模成功的小鼠隨機(jī)分為4組：模型組、牛樟芝微粉低、中和高劑量組，每組10只。牛樟芝微粉低、中和高劑量組每天分別灌胃給予0.2、1和2 g/kg·bw牛樟芝微粉懸液或其功能飲料，空白對(duì)照組和模型組以等體積生理鹽水代替，連續(xù)灌胃35 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死小鼠并取樣：對(duì)小鼠進(jìn)行心臟穿刺取血，離心（13500 r/min，10 min）制備血清；同時(shí)收集小鼠肝臟組織，并凍于-80 ℃冰箱用于后續(xù)各項(xiàng)指標(biāo)的檢測分析。

1.3.7 糖尿病小鼠降低空腹血糖值實(shí)驗(yàn)

給藥后第1、7、14、21、28和35 d，取小鼠尾靜脈血測定其空腹血糖值，每次測定前禁食12 h，比較各組小鼠空腹血糖值的變化情況并根據(jù)以下公式計(jì)算末次血糖下降率：

注：式中，A和B分別代表實(shí)驗(yàn)前和實(shí)驗(yàn)后血糖值。

1.3.8 糖尿病小鼠糖耐量實(shí)驗(yàn)

牛樟芝微粉低、中和高劑量組每天分別灌胃給予0.2、1和2 g/kg·bw牛樟芝微粉懸液或其功能飲料，空白對(duì)照組和模型組以等體積生理鹽水代替，連續(xù)灌胃35 d。灌胃35 d后，各組禁食12 h，進(jìn)行末次給藥。在給藥30 min后按2 g/kg·bw劑量灌胃給予葡萄糖，并測定給予葡萄糖后0、0.5、1和2 h的血糖值，觀察各組在給予葡萄糖后不同時(shí)間點(diǎn)血糖值的變化情況。血糖曲線下面積（AUC）根據(jù)以下公式計(jì)算：

注：式中，A、B、C和D分別代表給予葡萄糖后0、0.5、1和2 h的血糖值。

1.3.9 血清及肝臟相關(guān)指標(biāo)測定

參照試劑盒操作說明檢測ALT、AST、SOD、CAT、GSH-Px、MDA、TC、TG、LDL和HDL活性或含量。

1.3.10 免疫印跡法分析蛋白質(zhì)表達(dá)

從-80 ℃冰箱中取出小鼠肝臟組織，按比例加入預(yù)冷的裂解液后在冰上充分研磨，離心（13500 r/min，10 min）收集上清，測定蛋白質(zhì)濃度。蛋白質(zhì)經(jīng)變形后，按30 μg/well的上樣量進(jìn)行SDS-PAGE電泳。用濕轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至PVDF膜后，5%BSA室溫封閉1 h，加入一抗（稀釋比例為1:1000）4 ℃孵育過夜。TBST緩沖液洗滌5次，每次3 min，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（稀釋比例為1:5000）室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗滌5次，每次3 min。加入適量ECL試劑后，PVDF膜用ChemiDoc? XRS+化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)采集圖像，分析結(jié)果。

1.3.11 數(shù)據(jù)分析

采用Graph Pad Prism 6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以ˉx±s表示；顯著性檢測采用單因素方差分析，p＜0.05說明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；采用 PhotoshopCS6軟件進(jìn)行圖片處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 經(jīng)培養(yǎng)基優(yōu)化所得牛樟芝功效性成分的含量分析

三萜類和多糖類等化合物是牛樟芝的主要功效性成分[7]。由表1可知，經(jīng)2 m固態(tài)發(fā)酵所得牛樟芝中麥角甾烷型和羊毛甾烷型三萜類化合物及多糖類化合物含量均超過臺(tái)灣牛樟芝產(chǎn)業(yè)協(xié)會(huì)給出的參考標(biāo)準(zhǔn)，分別提高了6.1%、24%和40%，表明該經(jīng)培養(yǎng)基優(yōu)化后的牛樟芝固態(tài)發(fā)酵法能產(chǎn)出高質(zhì)且培養(yǎng)周期較短的牛樟芝。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，牛樟芝經(jīng)干燥、粉碎后制成牛樟芝微粉，并通過乙醇誘導(dǎo)的急性酒精肝損傷小鼠模型和 STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型對(duì)其功效進(jìn)行評(píng) 估，以論證該固態(tài)發(fā)酵法的可行性。

表1 經(jīng)培養(yǎng)基優(yōu)化所得牛樟芝功效性成分的含量分析Table 1 Analysis of the functional components of Antrodia camphorata obtained by medium optimization

2.2 牛樟芝微粉對(duì)急性酒精肝損傷小鼠血清中ALT和AST活性的影響

ALT和AST作為肝細(xì)胞標(biāo)志性酶類，是診斷肝臟受損傷程度最敏感指標(biāo)。當(dāng)肝臟損傷后，血清中這兩種酶的活性會(huì)顯著升高，進(jìn)而反映肝臟受損程度[2]。

表2 牛樟芝微粉對(duì)急性酒精肝損傷小鼠血清中ALT和AST活性的影響Table 2 Effects of Antrodia camphorata powder on serum activities of ALT and AST in mice with alcohol-induced acute liver injury（ˉx±s，n=10）

由表2可知，與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠血清中ALT和AST活性分別提高了90.92%（p＜0.01）和 99.83%（p＜0.01），說明急性酒精肝損傷小鼠模型構(gòu)建成功。與模型組相比，牛樟芝微粉中劑量組小鼠血清中ALT和AST活性分別降低了21.64%（p＜0.01）和 23.07%（p＜0.01），牛樟芝微粉高劑量組小鼠血清中ALT和AST活性則分別降低33.91%（p＜0.01）和36.79%（p＜0.01），呈一定量效關(guān)系。結(jié)果表明，牛樟芝微粉能改善過量酒精攝入導(dǎo)致小鼠急性肝損傷。

2.3 牛樟芝微粉對(duì)急性酒精肝損傷小鼠SOD、CAT、GSH-Px和MDA水平的影響

人體攝入的酒精絕大部分會(huì)在肝臟被分解代謝，并產(chǎn)生大量的自由基。長期或大量飲酒會(huì)導(dǎo)致自由基過量生成，并對(duì)肝臟組織造成氧化性損傷[1,14]。SOD、CAT和GSH-Px是機(jī)體清除自由基，抵御氧化應(yīng)激的關(guān)鍵酶類，其活性大小直接反映了機(jī)體清除自由基的能力[15,16]。而MDA則是自由基作用于脂質(zhì)所生成的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其含量高低也間接反映了機(jī)體受自由基攻擊的嚴(yán)重程度[17]。由表3可知，與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠SOD、CAT和GSH-Px活性分別降低了35%（p＜0.01）、30.99%（p＜0.01）和35.23（p＜0.01），MDA含量提高了121.43%（p＜0.01），說明過量攝入酒精使小鼠肝臟處于嚴(yán)重的氧化應(yīng)激狀態(tài)，細(xì)胞抵御氧化性損傷的能力大幅降低。而與模型組相比，牛樟芝微粉中劑量組小鼠SOD、CAT和GSH-Px活性分別提高了27.48%（p＜0.01）、24.91%（p＜0.01）和29.91%（p＜0.05），MDA 含量降低了 28.67%（p＜0.01），牛樟芝微粉高劑量組小鼠SOD、CAT和GSH-Px活性則分別提高 31.25%（p＜0.01）、33.32%（p＜0.01）和 30.51%（p＜0.05），MDA 含量降低37.87%（p＜0.01），說明，該牛樟芝微粉能增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力并改善其氧化應(yīng)激機(jī)制，而發(fā)揮對(duì)急性酒精肝損傷小鼠保護(hù)作用。

表3 牛樟芝微粉對(duì)急性酒精肝損傷小鼠SOD、CAT、GSH-Px和MDA水平的影響Table 3 Effects of Antrodia camphorata powder on the levels of SOD, CAT, GSH-Px, and MDA in mice with alcohol-induced acute liver injury（ˉx±s，n=10）

2.4 牛樟芝微粉對(duì)糖尿病小鼠空腹血糖值的影響

由表4可知，35 d給藥期間，模型組小鼠的空腹血糖值較為穩(wěn)定，且顯著高于空白對(duì)照組（p＜0.01）。中、高劑量牛樟芝微粉灌胃均可明顯降低糖尿病小鼠的空腹血糖值，第14 d時(shí)兩組小鼠的空腹血糖值與給藥前相比已顯著減?。╬＜0.05或p＜0.01），且從第14 d開始，與模型組相比存在顯著差異（p＜0.05或p＜0.01），但牛樟芝微粉低劑量組小鼠的空腹血糖值卻無明顯變化。此外，牛樟芝微粉中、高劑量組小鼠末次測定的血糖下降率分別為25.03%和38.24%。以上結(jié)果說明，該牛樟芝微粉具有較好的降血糖作用。

表4 牛樟芝微粉對(duì)糖尿病小鼠空腹血糖值的影響Table 4 Effects of Antrodia camphorata powder on fasting glucose in diabetic mice (ˉx±s，n=10）

2.5 牛樟芝微粉對(duì)糖尿病小鼠糖耐量的影響

AUC值的大小可反映機(jī)體血糖水平的恢復(fù)能力，AUC值越小則恢復(fù)能力越強(qiáng)，表明治療藥物具有較好的降血糖作用。

由表5可知，35 d給藥后，與模型組相比，牛樟芝微粉中、高劑量組小鼠的AUC值分別降低了14.4%（p＜0.05）和27.67%（p＜0.01），但牛樟芝微粉低劑量組小鼠的AUC值并無明顯改變。

糖耐量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該牛樟芝微粉能有效控制糖尿病小鼠的餐后血糖，改善其糖耐量，提高其對(duì)葡萄糖的耐受力。

表5 牛樟芝微粉對(duì)糖尿病小鼠糖耐量的影響Table 5 Effects of Antrodia camphorata powder on glucose tolerance in diabetic mice （ˉx±s，n=10）

2.6 牛樟芝微粉對(duì)糖尿病小鼠血清中TG、TC、LDL和HDL水平的影響

血脂代謝紊亂是糖尿病并發(fā)癥的一種，其變化可反映機(jī)體脂質(zhì)代謝的情況。由表6可知，與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠血清中TC、TG和LDL含量分別提高了 97.47%（p＜0.01）、93.27%（p＜0.01）和175.61%（p＜0.01），HDL 含量降低了33.33%（p＜0.01），表明體內(nèi)血脂代謝已出現(xiàn)紊亂

與模型組相比，牛樟芝微粉中劑量組小鼠血清中TC、TG和LDL含量分別降低了11.94%（p＜0.05）、20.97%和30.53%，HDL含量提高了26.83%（p＜0.05），牛樟芝微粉高劑量組小鼠血清中TC、TG和LDL含量則分別降低了28.36%（p＜0.01）、25.32%（p＜0.05）和 41.15%（p＜0.05），HDL 含量提高了 25.61%（p＜0.01），但低劑量牛樟芝微粉灌胃處理并無明顯效果。上述結(jié)果說明，該牛樟芝微粉能在一定程度上改善糖尿病小鼠體內(nèi)血脂代謝紊亂的情況。

2.7 牛樟芝功能飲料對(duì)糖尿病小鼠空腹血糖值、糖耐量和血脂代謝的影響

在驗(yàn)證牛樟芝微粉的功效后，以其為基本原料調(diào)配了牛樟芝功能飲料，并探討其對(duì)糖尿病小鼠空腹血糖值、糖耐量和血脂代謝的影響。由表7～9可知，與牛樟芝微粉一致，該功能飲料能有效改善糖尿病小鼠的血糖調(diào)節(jié)能力以及由血糖代謝異常引起的血脂代謝紊亂，發(fā)揮對(duì)糖尿病小鼠的保護(hù)作用。

表6 牛樟芝微粉對(duì)糖尿病小鼠血清中TG、TC、LDL和HDL水平的影響Table 6 Effects of Antrodia camphorata powder on serum levels of TG, TC, LDL, and HDL in diabetic mice（ˉx±s，n=10）

表7 牛樟芝功能飲料對(duì)糖尿病小鼠空腹血糖值的影響Table 7 Effects of Antrodia camphorata functional beverage on fasting glucose in diabetic mice （ˉx±s，n=10）

表8 牛樟芝功能飲料對(duì)糖尿病小鼠糖耐量的影響Table 8 Effects of Antrodia camphorata functional beverage on glucose tolerance in diabetic mice (ˉx ± s, n=10)

表9 牛樟芝功能飲料對(duì)糖尿病小鼠血清中TG、TC、LDL和HDL水平的影響Table 9 Effects of Antrodia camphorata functional beverage on the levels of TG, TC, LDL, and HDL in serum of diabetic mice （ˉx±s，n=10）

2.8 牛樟芝微粉及其功能飲料對(duì)糖尿病小鼠肝臟中AMPK和AKT磷酸化水平的影響

AMPK是動(dòng)物體內(nèi)能量代謝的關(guān)鍵調(diào)控因素。在肝臟和肌肉中，AMPK的活化能增強(qiáng)脂肪酸的氧化作用以及對(duì)胰島素的敏感性，抑制甘油三酯和膽固醇的生成，減少能量代謝[18,19]。而AKT也被報(bào)道與葡萄糖代謝以及糖尿病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[20,21]。從圖1可知，與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠肝臟中AMPKα和AKT磷酸化水平顯著降低。而與模型組相比，牛樟芝微粉（高劑量）及其功能飲料灌胃均可使小鼠肝臟中AMPKα和AKT磷酸化水平基本恢復(fù)到正常狀態(tài)，由此推測，該牛樟芝微粉及其功能飲料可能通過激活A(yù)MPKα和AKT的方式來發(fā)揮降血糖以及改善血脂代謝的作用。

圖1 牛樟芝微粉（a）及其功能飲料（b）對(duì)糖尿病小鼠肝臟中AMPKα和AKT磷酸化水平的影響Fig.1 Effects of Antrodia camphorata powder (a) and its functional beverage (b) on the phosphorylation levels of hepatic AMPKα and AKT in diabetic mice

3 結(jié)論

3.1 目前，牛樟芝固態(tài)發(fā)酵的研究和開發(fā)還處于初步階段。固態(tài)發(fā)酵具有用水少，成本低廉，低能源消耗以及高產(chǎn)出等優(yōu)點(diǎn)。與椴木栽培相比，固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)周期短且能獲得具有接近野生牛樟芝功效的牛樟芝菌絲體，而與液態(tài)發(fā)酵相比，其在次級(jí)代謝產(chǎn)物，尤其是三萜類化合物的產(chǎn)生和累積方面有著明顯的優(yōu)勢[12]。本文建立了一種牛樟芝固態(tài)發(fā)酵法，并對(duì)培養(yǎng)所得牛樟芝的主要功效性成分進(jìn)行含量分析，結(jié)果顯示，該牛樟芝富含三萜類和多糖類化合物。此外，該固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)成本低，培養(yǎng)周期較短，且對(duì)環(huán)境友好，故具有潛在的開發(fā)和應(yīng)用前景。

3.2 酒精代謝失調(diào)所導(dǎo)致的氧化應(yīng)激以及炎癥等是造成酒精性肝病的重要原因[1,14]。本文通過乙醇誘導(dǎo)的急性酒精肝損傷小鼠模型，探討經(jīng)培養(yǎng)基優(yōu)化所得牛樟芝微粉的抗氧化及肝保護(hù)功效。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，乙醇誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠血清中ALT和AST活性以及MDA含量明顯高于空白對(duì)照組小鼠，而SOD、CAT和GSH-Px活性則顯著降低，表明模型組小鼠的肝臟已發(fā)生嚴(yán)重的氧化性損傷，而中、高劑量牛樟芝微粉灌胃處理可降低ALT和AST活性，抑制MDA含量增加，同時(shí)提高SOD、CAT和GSH-Px活性，說明通過該固態(tài)發(fā)酵法所得牛樟芝微粉對(duì)過量攝入乙醇所致的小鼠急性肝損傷具有一定的預(yù)防保護(hù)作用，且是通過增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，緩解氧化性損傷而實(shí)現(xiàn)。

3.3 糖尿病主要臨床表征是持續(xù)性的高血糖狀態(tài)，如不加以控制會(huì)導(dǎo)致多種急、慢性并發(fā)癥的產(chǎn)生，因此，能否有效控制血糖水平與糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生密切相關(guān)[6,22]。此外，血脂代謝紊亂在糖尿病患者中較為常見，具體表現(xiàn)為過高甘油三酯、總膽固醇以及低密度脂蛋白[23]。STZ是一種特異性的胰島β細(xì)胞毒劑，可選擇性破壞小鼠的胰島β細(xì)胞，誘發(fā)小鼠高血糖，形成實(shí)驗(yàn)性糖尿病模型[24]。從STZ誘導(dǎo)糖尿病小鼠的相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看到，中、高劑量牛樟芝微粉及其功能飲料均能有效降低糖尿病小鼠的空腹血糖值和糖耐量，同時(shí)抑制血清中TC、TG和LDL含量升高以及HDL含量降低，表明通過該固態(tài)發(fā)酵法所得牛樟芝微粉及其功能飲料具有輔助降血糖以及改善血脂代謝的功效。進(jìn)一步的免疫印跡結(jié)果顯示，該牛樟芝微粉及其功能飲料均能顯著上調(diào)糖尿病小鼠肝臟中 AMPKα和 AKT磷酸化水平，揭示該牛樟芝微粉及其功能飲料可能是通過調(diào)控機(jī)體能量代謝相關(guān)因子的表達(dá)進(jìn)而發(fā)揮對(duì)糖尿病小鼠保護(hù)作用。綜上所述，本文建立并驗(yàn)證了一種能產(chǎn)出高質(zhì)且培養(yǎng)周期較短牛樟芝的固態(tài)發(fā)酵法，且經(jīng)該固態(tài)發(fā)酵法所得牛樟芝微粉具有護(hù)肝、降血糖以及改善血脂代謝紊亂功效，其作用機(jī)制可能與其能提高機(jī)體抗氧化能力、調(diào)控能量代謝相關(guān)因子的表達(dá)有關(guān)。同時(shí)，本文還為牛樟芝固態(tài)發(fā)酵研發(fā)做一定補(bǔ)充，也為相關(guān)功能產(chǎn)品的研發(fā)奠定了重要基礎(chǔ)。