朱碧麗,吳序櫟,辛啟航,王孟環(huán),胡小鵬,賀震旦,劉立忠
(1.深圳大學醫(yī)學部基礎醫(yī)學院,廣東深圳 518060)(2.深圳大學醫(yī)學部藥學院,廣東深圳 518060)(3.深圳新型天然保健品重點實驗室,廣東深圳 518060)
隨著生活水平的提高,越來越多的人患有肥胖[1],代謝綜合征[2]、心臟病[3]和Ⅱ型糖尿病[4],這些疾病的發(fā)生機制都與胰島素抵抗(Insulin Resistance,IR)[5]有關(guān)。2型糖尿病狀態(tài)下脂肪酸和甘油三酯在骨骼肌細胞內(nèi)的累積,導致骨骼肌對胰島素的敏感性降低,是引起胰島素抵抗的重要原因[6]。由于在胰島素刺激下,體內(nèi)超過 70%的葡萄糖可被骨骼肌細胞攝取并利用[7],所以骨骼肌是攝取葡萄糖的最主要組織。胰島素主要通過磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信號通路進行代謝調(diào)節(jié)[8],磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)信號通路是胰島素抵抗相關(guān)的一條信號通路,與胰島素抵抗相關(guān)的2型糖尿病有著不可分割的聯(lián)系[8~11]。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)作為能量調(diào)控器,在調(diào)節(jié)肝臟、脂肪和骨骼肌的糖脂代謝方面發(fā)揮著重要的作用,并且維持著能量供需平衡[12]。AMPK參與了體內(nèi)葡萄糖、脂肪酸和蛋白質(zhì)代謝的調(diào)節(jié),因此在肥胖、糖尿病、代謝綜合征患者的代謝調(diào)節(jié)中,AMPK是關(guān)鍵靶點之一[13,14]。骨骼肌的胰島素敏感性降低是機體胰島素抵抗的主要原因,因此臨床上仍然需要能夠促進骨骼肌攝取葡萄糖,降低血糖濃度,恢復機體的正常胰島素水平,并且副作用小的藥物治療胰島素抵抗及 2型糖尿病。
金線蓮苷(kinsenoside)是葡萄糖與五元內(nèi)酯環(huán)的手性碳以糖苷鍵形式連接形成的葡萄糖苷,是金線蓮的特質(zhì)性成分[15]。金線蓮(Anoectochilus roxburghii)即花葉開唇蘭,又名金蠶、金線蘭等,是蘭科開唇蘭屬的一種多年生的草本植物[16],我國南方福建、臺灣、廣西、廣東、四川和云南等省都有豐富的資源[17],它是我國傳統(tǒng)的珍貴藥材,有清熱解毒、滋補養(yǎng)陰降火和消炎減輕疼痛等功效[18]。在現(xiàn)代中藥研究中,金線蓮多用于糖尿病、高血脂、高血壓和腫瘤等疾病的治療[19]。據(jù)文獻報道該屬植物含金線蓮苷的水提物有降血糖、降血脂、保護肝臟、止痛和消炎等廣泛的藥理活性[20,21]。隨著研究的深入,金線蓮的藥用價值日益凸顯,其治療效果引起廣泛的關(guān)注,有良好的開發(fā)前景。
本課題以大鼠骨骼肌細胞為模型,研究在正常及胰島素抵抗情況下,金線蓮苷對細胞攝取葡萄糖的促進作用。結(jié)果顯示金線蓮苷可通過激活Akt和AMPK來增加細胞對葡萄糖的攝取,進而改善胰島素抵抗的情況。
大鼠骨骼肌細胞系L6myc,由Dr.Amira Klip友情提供;金線蓮苷,深圳大學賀震旦教授課題組提供;必需基本培養(yǎng)(簡稱α-MEM),Gibco公司;磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline,簡稱PBS),Notlas公司;胰蛋白酶,Gibco公司;雙抗,Cell Signaling Technology公司;葡萄糖(Glucose),Sigma公司;胰島素(insulin),諾和諾德公司;抗體,Cell Signaling Technology公司;ECL發(fā)光液試劑盒(Enhanced Chemiluminescence),Bio-Rad公司;分離膠緩沖液(Resolving Gel Buffer pH 8.8),Bio-Rad公司;積沉膠緩沖液(Stacking Gel Buffer pH 6.8),Bio-Rad公司;十二烷基磺酸鈉(Sodium Dodecyl Sulphate,簡稱SDS),Bio-Rad公司;過硫酸銨(Ammonium Persulphate,簡稱 APS),Amresco公司;四甲基乙二胺(tetramethylethylenediamine,簡稱TEMED),Amresco公司;Trizma堿(Trizma Base,簡稱Triz),Vetec公司;吐溫20(Tween-20),Sangon Biotech公司。
Purelab Ultra超純水儀,ELGA公司;小型垂直電泳儀,美國Bio-Rad公司;CO2培養(yǎng)箱,廣東丹利科技有限公司;超凈工作臺,浩瀚技術(shù)有限公司;小型臺式高速冷凍離心機,德國Eppendorf公司;化學發(fā)光成像儀,Clinx Science Instruments公司;搖床,海門市其林貝爾儀器制造有限公司;紫外分光光度計,Thermo Fisher Scientific公司;漩渦混合器,江蘇金怡儀器科技有限公司;水浴鍋,上海精宏實驗設備有限公司。
1.3.1 L6骨骼肌細胞培養(yǎng)
將 L6myc肌母細胞從液氮中取出后,迅速置于37 ℃水浴中,充分融化。轉(zhuǎn)移至含 10%的血清和含1%雙抗的α-MEM培養(yǎng)瓶中,充分分散細胞并將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中(37 ℃、5%CO2)培養(yǎng)。過夜后,更換新鮮的培養(yǎng)基。根據(jù)細胞的生長情況,一般每兩天傳一次代。L6myc肌母細胞在培養(yǎng)瓶中的密度達到60%~70%后,消化傳代(104cells/mL),并置于誘導培養(yǎng)基中(α-MEM,2%胎牛血清,l%雙抗),每兩天換一次培養(yǎng)基。6~7 d后90%以上的細胞融合為多核、長樹枝狀或手狀的肌管細胞時,可用于實驗。
1.3.2 細胞處理
L6myc肌母細胞誘導分化為成熟肌管細胞后,用于實驗。金線蓮苷(kinsenoside)以不同濃度(10 nM,100 nM,1 μM)分別作用細胞1 h和24 h,以胰島素和黃連素小檗堿為對照,確定金線蓮苷對骨骼肌細胞的最適濃度和時間。采用高糖高胰島素(HGI)誘導細胞產(chǎn)生胰島素抵抗。
1.3.3 蛋白免疫印跡分析
于細胞中加入 RIPA(使用前加入 1%protease inhibitor cocktail,2‰NaF和2‰PMSF)裂解液,刮取細胞至冰上裂解30 min后4 ℃,14000 r/min高速離心15 min,將上清液吸取至EP管中。進行BCA蛋白定量,各取20 μg蛋白樣品于SDS-PAGE凝膠上進行電泳,電泳結(jié)束后進行電轉(zhuǎn)。5%BSA封閉1 h后分別加入一抗4 ℃孵育過夜。第二天TBST洗膜三次后二抗孵育1 h,TBST洗膜三次后進行ECL法學發(fā)光液顯影,曝光。結(jié)果用ImageJ軟件對圖像進行灰度掃描處理并進行量化分析,以GAPDH作為內(nèi)參,用灰度值的比值表示相應樣品所檢測蛋白質(zhì)的相對含量。
1.3.4 2-NBDG法檢測葡萄糖攝取
2-脫氧葡萄糖(2-DG)是天然D型葡萄糖衍生物,通過葡萄糖轉(zhuǎn)運體蛋白進入細胞。2-DG第2位氧原子被熒光基團NBD取代即形成2-DG的熒光類似物,即熒光標記2-脫氧葡萄糖(2-NBDG)。2-NBDG激發(fā)波長為460 nm,發(fā)射波長為540 nm,能夠被熒光酶標儀、熒光顯微鏡及流式細胞儀等儀器探測。細胞根據(jù)實驗條件處理后,用常溫PBS潤洗后以2-NBDG于培養(yǎng)箱中孵育30 min。PBS潤洗兩次后進行讀數(shù)。
采用 ImageJ軟件對圖像進行灰度掃描處理并進行量化分析和GraphPad Prism 5軟件對所得的數(shù)據(jù)進行顯著性分析。與對照組相比較,顯著水平設定為*p<0.05 和#p<0.05。
圖1 骨骼肌細胞形態(tài)學觀察Fig.1 Morphological observation of skeletal muscle cells
細胞復蘇后對細胞進行培養(yǎng)和誘導分化,觀察細胞形態(tài)。L6骨骼肌細胞在接種的6~8 h會輕微貼壁,此時細胞還未完全展開,呈單個圓形或梭形,見圖1(a)。24 h后細胞完全展開,細胞數(shù)有所增加,見圖1(b)。48 h后細胞密度增加,細胞出現(xiàn)排列現(xiàn)象,見圖1(c)。在2%FBS誘導分化培養(yǎng)基的作用下,第3~4 d細胞有規(guī)律地平行排列,細胞與細胞之間相互融合,見圖1(d)。第6 d時85%以上的細胞融合成肌管細胞。肌管為光滑長條形,許多細胞核聚集在一起,位于肌管的中央,肌管之間多呈平行排列,見圖1(e)。肌管細胞為成熟的骨骼肌細胞,所以本研究以分化好的肌管細胞為模型進行各種實驗。
圖2 金線蓮苷對Akt和AMPK活性和表達的影響Fig.2 Effects of kinsenoside on the activity and expression of Akt and AMPK
圖3 Western Blot圖像量化分析Fig.3 Quantitative analysis of Western Blot
Akt與AMPK是胰島素信號通路和AMPK信號通路中的重要靶點,參與細胞對葡萄糖的攝取,它們的活性高低與細胞攝取葡萄糖密切相關(guān)。金線蓮苷(kinsenoside,Kin)以不同濃度(10 nM,100 nM,1 μM,100 μM)分別作用細胞1 h和24 h,同時以胰島素(insulin,Ins)作用 10 min和黃連素小檗堿(berberine,BBR)作用1 h作為對照組。結(jié)果顯示,與對照組相比,金線蓮苷濃度為100 μM,作用1 h和24 h對Akt(與對照組相比,1 h降低15.50%,p>0.05;24 h降低26.55%,p>0.05)和AMPK(與對照組相比,1 h增加24.37%,p>0.05;24 h降低2.79%,p>0.05)均無顯著激活作用,說明高濃度的金線蓮苷可能會對細胞產(chǎn)生毒性作用。當10 nM、100 nM和1 μM金線蓮苷作用細胞1 h后,與對照組相比,Akt活性分別增加了 56.46%(p<0.05)、19.79%(p>0.05)、1.88%(p>0.05)。說明只有10 nM金線蓮苷顯著激活了Akt;10 nM、100 nM和1 μM金線蓮苷作用1 h后,與對照組相比,AMPK 活性分別增加了 15.54%(p>0.05)、71.39%(p<0.05)、94.70%(p<0.05),說明100 nM 和1 μM的金線蓮苷激活AMPK作用較好;當10 nM、100 nM金線蓮苷作用細胞24 h后,與對照組相比,Akt的活性分別增加了 34.53%(p<0.05)、5.53%(p>0.05),而 1μM金線蓮苷作用后Akt活性降低了6.20%(p>0.05),說明10 nM激活Akt的效果最好。當10 nM、100 nM和1 μM金線蓮苷作用24 h后,與對照組相比,AMPK的活性分別增加了 149.92%(p<0.05)、114.26%(p<0.05)、147.84%(p<0.05),說明三個濃度的金線蓮苷都可顯著激活AMPK,見圖2和圖3(圖3是對圖2中各蛋白條帶的定量分析結(jié)果)。結(jié)果顯示,10 nM金線蓮苷作用細胞24 h后對Akt和AMPK同時激活的作用最為顯著,以后的試驗中均采用此條件處理細胞。
圖4 金線蓮苷對細胞攝取葡萄糖的作用Fig.4 The effect of kinsenoside on the glucose uptake of cells
與蛋白檢測結(jié)果相對應,葡萄糖吸收實驗顯示,以胰島素(Ins)和黃連素小檗堿(BBR)為參照,10 nM金線蓮苷(Kin)作用細胞1 h即可增加細胞對葡萄糖的吸收(與對照組相比,增加19.32%,p>0.05),但不顯著;作用24 h后可顯著增加細胞對葡萄糖的攝取(與對照組相比,增加43.35%,p<0.05),見圖4。結(jié)合圖2的結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)10 nM金線蓮苷短期作用(1 h)只能顯著激活Akt(與對照組相比,增加54.46%,p<0.05),雖然 AMPK 的活性也有增加的趨勢,但不顯著,此時金線蓮苷引發(fā)的細胞對葡萄糖的攝取有輕微的增加(與對照組相比,增加 19.32%,p>0.05)。當10 nM金線蓮苷作用24 h后,可有效激活Akt和AMPK,同時顯著增加細胞對葡萄糖的攝?。ㄅc對照組相比,增加 43.35%,p<0.05)。這說明金線蓮苷促進細胞攝取葡萄糖需要同時激活Akt和AMPK,但是以AMPK活化為主,以Akt活化為輔。
圖5 不同處理條件下Akt和AMPK活性與表達Fig.5 Activity and expression of Akt and AMPK under different treatments
圖6 Western Blot圖像量化分析結(jié)果Fig.6 Quantitative analysis of Western Blot
正常情況下,胰島素(Ins,I)可激活 Akt(與對照組相比,增加 434.73%,p<0.05)。高糖高胰島素(High glucose high insulin,HGI)誘導細胞胰島素抵抗后,與對照組比較,雖然經(jīng)胰島素長時間處理后Akt本底活性較高,但是胰島素再刺激不能顯著激活 Akt,與對照組相比,對胰島素的敏感性(胰島素加入后 Akt的活性變化/胰島素加入前 Akt的活性變化)降低了2.84倍,p<0.05。說明胰島素抵抗的細胞模型誘導成功。但金線蓮苷(Kin,K)在正常和胰島素抵抗情況下都可激活Akt(與對照組相比,分別增加了59.77%,p<0.05 和79.05%,p<0.05)和AMPK(與對照組相比,分別增加了91.48%,p<0.05和128.35%,p<0.05)。更為重要的是,金線蓮苷可以改善胰島素抵抗的情況,恢復了胰島素對Akt的激活作用,與胰島素抵抗組相比,細胞對胰島素敏感性增加了1.17倍,p<0.05。見圖5和圖6(圖6是對圖5中各蛋白條帶的定量分析結(jié)果)。結(jié)合圖2和圖5的Western Blot結(jié)果,發(fā)現(xiàn)胰島素不但不能激活AMPK,甚至對AMPK的活性有下調(diào)的作用。因為胰島素引發(fā)的是合成代謝,促進糖原、脂肪和蛋白的合成。而AMPK激活的是分解代謝,促進糖原、脂肪和蛋白的分解。因此在正常情況下,胰島素刺激細胞后所引發(fā)的合成代謝占據(jù)優(yōu)勢,對AMPK的活性有一定的抑制作用。但是在胰島素抵抗的情況下,胰島素信號通路受阻,而AMPK的激活不受影響,這時激活AMPK后不但促進葡萄糖攝取,還可在一定程度上改善胰島素抵抗的作用[22]。
圖7 各個處理因素下葡萄糖的攝取情況Fig.7 Glucose uptake under various treatment factors
對于正常細胞來說,胰島素(Ins,I)和金線蓮苷(Kin,K)都可促進細胞對葡萄糖的攝取(與對照組相比,分別增加72.30%,p<0.05、39.03%,p<0.05)。金線蓮苷與胰島素共同作用細胞后,可引發(fā)更多的葡萄糖吸收,并且實驗結(jié)果顯示金線蓮苷與胰島素共同作用細胞時展示的是協(xié)同效應(與胰島素促進細胞對葡萄糖攝取相比,增加 64.70%,p<0.05)。高糖高胰島素(HGI)誘導胰島素抵抗后,胰島素促進葡萄糖攝取的作用明顯減弱(與胰島素促進細胞對葡萄糖攝取相比,增加 25.70%,p>0.05),但是金線蓮苷仍然可以很好地促進葡萄糖攝取(與對照組相比,增加59.00%,p<0.05),并且金線蓮苷與胰島素共同作用后,可進一步增強胰島素的作用(與胰島素促進細胞對葡萄糖攝取相比,增加88.70%,p<0.05),見圖7。這里,葡萄糖攝取實驗與上述的蛋白檢測結(jié)果相一致。高糖高胰島素誘導胰島素抵抗后,本底的Akt活性增加,所以導致胰島素抵抗細胞比正常細胞在基礎水平上具有較多的葡萄糖吸收。金線蓮苷處理胰島素抵抗的細胞后,不但增強了Akt的活性,還進一步增加了胰島素對Akt的活化作用,同時還顯著地激活了AMPK,所以無論正常細胞還是胰島素抵抗細胞,經(jīng)金線蓮苷處理后都可顯著增加對葡萄糖的攝取。
胰島素抵抗會導致糖脂代謝紊亂,進而引發(fā)全身性的代謝紊亂[23]。骨骼肌的胰島素敏感性受損是機體胰島素抵抗的主要原因。金線蓮苷是金線蓮的主要成分之一,已被證明具有增強胰島素敏感性的作用,但其具體的分子機制尚不清楚。在本研究中,利用金線蓮提取物金線蓮苷作用骨骼肌細胞。實驗結(jié)果顯示,在細胞正常情況下,金線蓮苷可以增加AMPK和Akt的活性,并且可促進骨骼肌細胞對葡萄糖的攝?。辉谝葝u素抵抗的細胞中,金線蓮苷可顯著改善胰島素對Akt的激活作用。在正常及胰島素抵抗情況下,金線蓮苷都可顯著激活 AMPK,從而促進細胞攝取葡萄糖。推測體內(nèi)金線蓮苷降糖機制如下:金線蓮苷作用細胞后,細胞內(nèi)蛋白激酶Akt與AMPK被激活,進而促進葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白 4(GLUT4)向細胞膜遷移,并鑲嵌在細胞膜上,協(xié)助葡萄糖從細胞外轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi),這樣就降低了血糖濃度,減少了糖毒性,從而改善了胰島素抵抗。本研究為應用金線蓮苷治療胰島素抵抗和Ⅱ型糖尿病提供了理論基礎。