2型糖尿病周圍神經(jīng)病變患者外周血CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與25-（OH）D3的關(guān)系及其意義*

秦宏超，張真穩(wěn)

（揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 內(nèi)分泌科，江蘇 揚(yáng)州 225100）

糖尿?。╠iabetes mellitus, DM）周圍神經(jīng)病變（diabetic peripheral neuropathies, DPN） 是DM主 要的慢性并發(fā)癥之一?！?0%的2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus, T2DM）患者合并有DPN，≥1/3的DPN患者存在針刺、燒灼及電擊等疼痛癥狀[1]，嚴(yán)重影響患者正常的工作和生活，也是DM晚期致死、致殘的主要原因之一。T2DM及其并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制涉及多方面，免疫機(jī)制也參與其中。由于疾病病因和長期病程，患者免疫功能多受到影響，細(xì)胞免疫平衡被破壞，其中T淋巴細(xì)胞亞群的變化尤為顯著。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（T-regulatory cell, Tregs）是一類具有獨(dú)特免疫調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞亞群，在維持機(jī)體的免疫穩(wěn)態(tài)和控制自身免疫病的進(jìn)展方面具有重要作用[2]。維生素D（vitamin D, VD）除作為鈣、磷代謝調(diào)節(jié)劑參與骨代謝外，還具有免疫調(diào)節(jié)作用（包括調(diào)節(jié)Tregs各個(gè)亞群比例、促進(jìn)CD4+T分化及上調(diào)Tregs活性等）。血清25-羥維生素D3[25-（OH）D3]在DPN患者的糖代謝、營養(yǎng)神經(jīng)、氧化應(yīng)激及免疫調(diào)節(jié)方面均發(fā)揮作用[3-5]，與DPN具有相關(guān)性[6]。本文旨在探討DPN患者25-（OH）D3和CD4+Tregs的關(guān)系及其意義，為DPN的發(fā)生機(jī)制和治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月-2017年7月該院就診的T2DM患者42例。其中，男性26例，女性16例；病程1～40年，平均10.5年；年齡35～86歲，平均（60.36±12.22）歲。所有患者均符合1999年世界衛(wèi)生組織的DM診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①非DM因素導(dǎo)致的神經(jīng)病變（如腰椎病變、VB12缺乏及格林-巴利綜合征等）、甲狀腺功能亢進(jìn)癥及惡性腫瘤等；②合并有DM高滲昏迷、低血糖及DM酮癥酸中毒等急性并發(fā)癥；③合并有各類急性或慢性感染；④有骨質(zhì)疏松和其他骨代謝異常疾病病史；⑤肝腎功能障礙、心功能不全及甲狀旁腺疾病；⑥半年內(nèi)使用過甲狀旁腺激素、降鈣素、類固醇激素、VD制劑及性激素等藥物。

1.2 方法

1.2.1 一般資料采集 記錄每位患者性別、年齡、DM病程等一般數(shù)據(jù)，測(cè)量身高、體重，計(jì)算體重指數(shù)（body mass index, BMI）。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)室檢查 所有受試者空腹≥8 h，于次日清晨抽取靜脈血，采用AU2700型全自動(dòng)生化分析儀（美國貝克曼庫爾特公司）測(cè)定TG、TC、HDL-C、LDL-C、Scr、BUM及尿微量白蛋白（urine microalbuminuria,UMA）；采用糖化血紅蛋白測(cè)定儀（美國Bia-rad公司）對(duì)HbA1c水平進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3 VD3水平測(cè)定及分類 抽取所有受試對(duì)象空腹靜脈血，采用25-（OH）D3試劑盒（英國IDS公司）用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法測(cè)定。依據(jù)25-（OH）D3的水平：≤50 nmol/L為VD3缺乏；50～75 nmol/L為VD3不足；≥75 nmol/L為VD3充足[7]。

1.2.4 CD4+Tregs檢測(cè) 使用PF-anti-CD25/FITC-anti-CD4熒光標(biāo)記抗體（美國Serotec公司）標(biāo)記兩組分離好的單個(gè)核細(xì)胞樣本，采用流式細(xì)胞儀（美國BD公司）進(jìn)行Tregs檢測(cè)，采用CXP Cytometer（美國貝克曼庫爾特公司）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行收集和分析。

1.2.5 DPN診斷 對(duì)受試者使用肌電誘發(fā)儀（日本光電工業(yè)株式會(huì)社）進(jìn)行肌電圖檢查。確診DPN標(biāo)準(zhǔn)[8]：在明確診斷DM同時(shí)或之后出現(xiàn)神經(jīng)病變，臨床表現(xiàn)與DPN表現(xiàn)（麻木、疼痛及感覺異常等）相符；5項(xiàng)檢查（溫度覺、足部感覺、踝反射、振動(dòng)覺及神經(jīng)傳導(dǎo)速度）≥2項(xiàng)為異常。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）或中位數(shù)（四分位數(shù)）表示，比較用t檢驗(yàn)，不滿足或用軼和檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Pearson法或Spearman法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組臨床資料比較

兩組年齡、25-（OH）D3水平及Tregs百分比比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩組 BMI、HbA1c、UMA、BUM、Scr及血脂分析等比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 兩組外周血25-（OH）D3水平和Tregs百分比的比較

兩組外周血25-（OH）D3水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），DPN組外周血25-（OH）D3水平比非DPN組更低（P＜0.05）；兩組外周血Tregs百分比比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），DPN組外周血Tregs百分比非DPN組更低（P＜0.05）。見表1和附圖。

2.3 DPN組外周血Tregs百分比與各臨床指標(biāo)相關(guān)性分析

DPN組外周血Tregs百分比與25-（OH）D3呈正相關(guān)（P＜0.05），與年齡、BMI、HbA1c、UMA、BUM、Scr、TC、TG、HDL-C、LDL-C 無相關(guān)性（P＞0.05）。見表2。

附圖 兩組Tregs百分比的比較

表2 DPN組外周血Tregs百分比與臨床指標(biāo)相關(guān)性

3 討論

近年來，Tregs作為維持機(jī)體免疫耐受的一個(gè)重要調(diào)控者備受關(guān)注。研究顯示，T2DM外周血淋巴細(xì)胞的數(shù)量和比例以及相關(guān)炎癥因子的改變，支持CD4+、CD25+Tregs參與DM微血管病變過程。楊雪等[9]研究發(fā)現(xiàn)，DPN患者外周血中CD4+、CD25+Foxp3+Tregs數(shù)量減少，可能是導(dǎo)致DPN患者神經(jīng)組織自身免疫性損傷的原因之一。但DPN發(fā)病過程中Tregs所起作用進(jìn)行的深入研究仍然較少。

VD作為一種脂溶性維生素，主要通過與其受體結(jié)合，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步發(fā)揮其生物學(xué)作用。VD在體內(nèi)的主要存在形式為血清25-（OH）D3，是目前評(píng)價(jià)VD營養(yǎng)狀況最有效指標(biāo)[10]。多項(xiàng)研究表明，T2DM中VD缺乏與DPN相關(guān)，且VD缺乏可作為DPN發(fā)病的危險(xiǎn)因子[11-12]。SHEHAB等[13]給57例VD缺乏DPN患者補(bǔ)充外源性VD后發(fā)現(xiàn)，VD能有效緩解DPN患者的臨床癥狀，使疼痛評(píng)分得到改善。充足的VD還可降低中老年人罹患T2DM的風(fēng)險(xiǎn)[14-15]。而低于人群VD水平中位數(shù)的T2DM患者，5年后發(fā)生微血管并發(fā)癥的概率增高[16]。VD對(duì)DPN的影響機(jī)制還不明確，研究證實(shí)VD可通過影響微血管功能、抑制炎癥反應(yīng)因子及直接保護(hù)作用對(duì)外周神經(jīng)發(fā)揮作用[17-21]。筆者早期研究結(jié)果顯示，T2DM DPN與VD水平有關(guān)[22]，本研究也證實(shí)DPN組25-（OH）D3水平較對(duì)照組降低，DPN患者普遍存在VD缺乏現(xiàn)象，進(jìn)一步證實(shí)25-（OH）D3或參與DPN發(fā)生、發(fā)展。

近期研究表明，VD除經(jīng)典的鈣磷調(diào)節(jié)功能外，還在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，其主要的靶細(xì)胞（包括T淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等）抗原遞呈細(xì)胞。VD可抑制T淋巴細(xì)胞的增殖、介導(dǎo)T細(xì)胞的凋亡并且改變Th1與Th2細(xì)胞之間的比例[23]。有研究表明，25-（OH）D3和轉(zhuǎn)化生長因子β的聯(lián)合刺激下，可增加FoxP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)原始CD4+T細(xì)胞向Tregs分化[24]，此結(jié)論在URRY等[25]體外實(shí)驗(yàn)中也得到證實(shí)。PRIETL等[26]臨床研究指出，在血清25-（OH）D3充足的正常對(duì)照組的外周血淋巴細(xì)胞中，Tregs所占比例增高，兩者呈正相關(guān)。王琦等[27]在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，VD能刺激Tregs分泌的抑制性細(xì)胞因子產(chǎn)生白細(xì)胞介素10，從而發(fā)揮生物學(xué)作用。

綜上所述，本研究結(jié)果支持DPN患者外周血CD4+Tregs與 25-（OH）D3水平相關(guān)。25-（OH）D3可通過影響DPN患者Tregs表達(dá)而影響DPN的發(fā)生、發(fā)展，為進(jìn)一步揭示DPN發(fā)病機(jī)制提供新方向，VD或成為未來治療DPN的一個(gè)新靶點(diǎn)，其能否通過補(bǔ)充外源性VD來調(diào)節(jié)T細(xì)胞的免疫功能，進(jìn)而改變DPN進(jìn)程，則需要更多的臨床實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。