重組人可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白對小鼠腦缺血/再灌注損傷的神經(jīng)保護作用及機制研究

黃山鑒，韋貴寧，姚人銀，鄧小玲，黃祖貴

[1.廣西醫(yī)科大學第十附屬醫(yī)院（欽州市第一人民醫(yī)院）藥劑科，廣西 欽州 535000；2.廣西中藥與天然藥物工程技術(shù)研究中心，廣西 南寧 530022]

腦卒中是致死和致殘主要病因之一。大約80%急性腦卒中是缺血性腦卒中，其中25%～35%是由于大血管阻塞引起的[1]。高遷移率族蛋白1（high mobility group box protein1, HMGB1）在機體各組織中廣泛表達，包括大腦。腦卒中患者血漿HMGB1水平增高；而在小鼠腦缺血模型中，缺血性腦組織可釋放HMGB1[2]。此外，有研究報道，腦缺血后HMGB1進入細胞外液，誘導缺血腦組織神經(jīng)炎癥及小膠質(zhì)細胞激活，從而使缺血損傷增重[3]。血栓調(diào)節(jié)蛋白是一種細胞表面糖蛋白，在多種細胞表面表達。血栓調(diào)節(jié)蛋白可與HMGB1 D1結(jié)構(gòu)域結(jié)合具有抗炎作用[4]。在一些動物模型中，重組人可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白（recombinant human soluble thrombomodulin alpha, ART-123）與HMGB1表達有關(guān)聯(lián)，如急性肺窘迫綜合征、敗血癥和痛覺過敏等[5-6]。然而，目前沒有研究評估ART-123是否通過調(diào)節(jié)HMGB1在小鼠腦缺血/再灌注損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護作用。因而，本研究目的是評估ART-123是否能改善小鼠大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion, MCAO）后腦缺血性損傷，并評估HMGB1在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

40只雄性BALB/c小鼠，體重22～28 g，購自廣西醫(yī)科大學動物中心。室溫下自由飲食和飲水。將BALB/c小鼠隨機分成：Sham組（n=10）、Vehicle組（n=10）和ART-123組（1和5 mg/kg 各10小鼠）。Vehicle組和ART-123組小鼠均在MCAO后4 h靜脈注射蒸餾水或ART-123（溶于蒸餾水配成1和5 mg/kg溶液）。

1.2 實驗試劑

ART-123（日本朝日化學公司），TTC（美國Sigma公司），HMGB1 ELISA試劑盒（上海內(nèi)含子生物科技有限公司）。

1.3 MCAO誘導腦缺血/再灌模型

腹腔注射1%戊巴比妥鈉（0.06 g/kg）麻醉BALB/c小鼠，然后頸部進行手術(shù)操作。最終在顯微鏡下可以觀察到左側(cè)頸動脈鞘，然后分離出頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈。然后用縫合線結(jié)扎頸總動脈近心端和頸外動脈遠心端，用針頭在頸外動脈遠端動脈壁上扎1個小口，將準備好的線栓從頸外動脈小孔插入頸總動脈，通過頸內(nèi)動脈最后到達大腦中動脈，用縫合線固定線栓，MCAO后4 h拔出線栓，縫合小鼠皮膚，再灌注24 h。Sham組小鼠進行相關(guān)手術(shù)操作，但不插入線栓。

1.4 評估腦梗死體積與出血量

神經(jīng)行為學評分后，將小鼠迅速斷頭取腦，放入-20℃冰箱冷凍約15 min后，行冠狀切片，厚度為2 mm。采用圖像分析系統(tǒng)（NIH圖像，版本1.63）測定每個腦片出血面積，并計算出血量。然后將腦片放入1% TTC磷酸鹽緩沖液中，在37℃水浴中避光孵育10 min。腦梗死區(qū)域不染色（灰白色），而正常腦組織染為深紅色。依據(jù)相關(guān)研究[7]方法計算MCAO后腦梗死體積。

1.5 神經(jīng)行為學評分

小鼠MCAO 4 h后，再灌注24 h，按照文獻報道的方法[8]進行神經(jīng)行為學評分，評分范圍是0～5分。0分為正常運動功能；1分為動物尾巴抬起時軀干和對側(cè)前肢屈曲；2分為同側(cè)旋轉(zhuǎn)，但靜止時姿勢正常；3分為對側(cè)旋轉(zhuǎn)；4分為向同側(cè)滾動；5分為靜止時時向同側(cè)傾斜（無自發(fā)性運動活動）。

1.6 旋轉(zhuǎn)桿試驗

通過旋轉(zhuǎn)桿試驗測定小鼠的運動協(xié)調(diào)能力[8]，把小鼠被放置在直徑3 cm防滑的桿上，桿以10 r/min速度旋轉(zhuǎn)，記錄小鼠從桿上跌下的時間。

1.7 ELISA分析

采集小鼠MCAO后再灌注24 h的血液樣本，離心后獲得血漿（1 200 r/min×10 min），按照ELISA規(guī)定的步驟檢測血漿HMGB1濃度。

1.8 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用方差分析；并行Turkey's post hoc檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ART-123對腦梗死體積的影響

平均腦梗死體積Vehicle組為（93.2±7.0）mm3，ART-123（1 mg/kg） 為（76.7±7.4）mm3，ART-123（5 mg/kg）為（64.8±6.5）mm3。方差分析顯示，3組腦梗死體積差異有統(tǒng)計學意義（F=4.843，P=0.038）。與Vehicle組比較，ART-123（5 mg/kg）組小鼠梗死體積減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖1。

2.2 ART-123對神經(jīng)行為學評分和運動協(xié)調(diào)的影響

平均神經(jīng)學評分Vehicle組為（3.6±0.3），ART-123（1 mg/kg）組為（3.5±0.3），ART-123（5 mg/kg）組為（2.9±0.3）。3組間比較差異無統(tǒng)計學意義（F=2.564，P=0.084）。

在旋轉(zhuǎn)桿試驗中，平均跌落時間Sham組為（120.0±7.5）s，Vehicle 組為（22.3±12.5）s，ART-123（5 mg/kg）組為（66.2±9.9）s。方差分析顯示，各組間比較差異有統(tǒng)計學意義（F=7.042，P=0.013）。與Sham組比較，Vehicle組小鼠運動協(xié)調(diào)能力降低（P＜0.05）。而 ART-123（1、5 mg/kg）可改善 MCAO后小鼠的運動協(xié)調(diào)能力（P＜0.05）。見圖2。

2.3 ART-123對血漿HMGB1濃度影響

平均血漿HMGB1濃度Sham組為（18.3±3.82）ng/ml，Vehicle組為（37.2±3.15）ng/ml，ART-123（1 mg/kg） 組 為（20.7±3.82）ng/ml，ART-123（5 mg/kg）組為（14.8±3.16）ng/ml。方差分析顯示，各組間比較差異有統(tǒng)計學意義（F=9.673，P=0.012）。與Sham組比較，Vehicle組平均血漿HMGB1濃度增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。ART-123（1 mg/kg）和 ART-123（5 mg/kg）均可降低Vehicle組血漿HMGB1濃度（均P＜0.05）。結(jié)果表明ART-123能降低血漿HMGB1濃度。見圖3。

2.4 ART-123對出血體積的影響

平均出血體積Vehicle組為（3.48±2.43）mm3；ART-123（1 mg/kg）為（6.92±3.27）mm3；ART-123（5 mg/kg）為（5.18±2.58）mm3。3組出血體積差異無統(tǒng)計學意義（F=1.071，P=0.164）。見圖4。

圖1 ART-123對MCAO后腦梗死體積的影響

圖2 ART-123對MCAO后運動協(xié)調(diào)的影響

圖3 ART-123對血漿HMGB1濃度的影響

圖4 ART-123對MCAO后出血體積的影響

3 討論

本結(jié)果表明，再灌時注射ART-123可減少腦梗死體積，改善神經(jīng)功能缺損，并降低血漿HMGB1水平，且出血并發(fā)癥無變化。ART-123在4 h MCAO模型中可抑制血漿HMGB1表達。此外，腦缺血損傷后，白細胞可釋放HMGB1，引起小膠質(zhì)細胞活化[8]。血液和中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞外HMGB1迅速增加，可誘導炎癥反應[9]。LIU等[10]報道，HMGB1單克隆抗體可減少大鼠腦缺血后梗死體積，且與神經(jīng)功能缺損改善相關(guān)。同時，HMGB1單克隆抗體可抑制血腦屏障通透性增加、小膠質(zhì)細胞活化及促炎因子產(chǎn)生。重組血栓調(diào)節(jié)蛋白Solulin可減少缺血性腦卒中動物模型梗死體積，主要是通過其抗凝和抗炎性質(zhì)[11]。RYANG等[12]報道，Solulin下調(diào)2 h MCAO大鼠缺血半影區(qū)炎癥因子表達，并降低CD11B表達，CD11B是小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞活化標志物。本結(jié)果提示，ART-123可能下調(diào)腦缺血時HMGB1表達。以往動物模型研究HMGB1，ART-123注射劑量為1～10 mg/kg[13]。有研究報道，10 mg/kg重組組織型纖溶酶原激活物（recombinant tissue plasminogen activator, rtPA）對4 h MCAO小鼠梗死體積無影響，而且腦內(nèi)大量出血[14]。因此，在本研究中選擇ART-123劑量1和5 mg/kg。本研究表明，ART-123減少腦梗死體積且無出血改變。由于ART-123可結(jié)合凝血酶，所以具有抗凝作用，但是5 mg/kg ART-123未增加出血量。日本ART-123第3階段臨床試驗表明，ART-123注射7 d后出血相關(guān)不良事件發(fā)生率低于肝素組[15]。本結(jié)果表明，ART-123是一種較安全治療缺血性腦卒中藥物。此外，Solulin通過其抗凝和抗炎作用可減少缺血性腦卒中動物模型梗死體積，模型中MCAO時間為30、60或120 min[11-12]。而本研究表明，ART-123改善4 h MCAO引起的缺血損傷。rtPA是臨床唯一批準用于缺血性腦卒中溶栓治療的藥物，但是在腦卒中發(fā)作4.5 h內(nèi)使用才有效果[16]。然而，不到10%急性腦卒中患者符合rtPA治療[17]。但本研究結(jié)果提示，ART-123有可能用于治療延遲性缺血性腦卒中。

總之，ART-123可能通過抑制血漿HMGB1表達，降低小鼠腦缺血所致神經(jīng)功能缺損，而且出血并發(fā)癥無明顯變化。