泰克地那林對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)小鼠急性腎損傷的治療作用*

程樹林，胡春燕，朱平宇，周文浩，龔志勇

（川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 泌尿外科，四川 南充 637000）

急性腎損傷（acute kidney injury, AKI）是臨床常見的危急重癥[1-2]，其發(fā)病率逐年上升，是導(dǎo)致患者死亡的重要原因。組蛋白去乙?；福℉istone deacetylases, HDACs）是一類調(diào)控染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的蛋白酶，既往研究主要集中在神經(jīng)退行性疾病、衰老相關(guān)疾病、糖尿病、心血管疾病以及腫瘤，證實(shí)HDACs抑制劑具有抗炎、抗纖維化和抗腫瘤作用[3]。而最近研究表明，HDACs調(diào)控在腎損傷應(yīng)答過程中起重要作用[4-5]。廣譜性HDAC抑制劑辛二酰苯胺異羥肟酸（suberoylanilide hydroxamic acid, SAHA）、丙戊酸（valproic acid, VPA）已被證實(shí)具有一定的急性腎損傷修復(fù)作用，但也存在藥效不穩(wěn)定、副作用較強(qiáng)等局限性[6-7]。泰克地那林（Tacedinaline, CI994）是一種I類HDAC特異性抑制劑，主要作用于HDAC1、2、3[8]，其對(duì)急性腎損傷是否具有治療作用目前尚未可知。本研究采用特異性HDAC抑制劑CI994代替廣譜性抑制劑，通過構(gòu)建四氯化碳（carbon tetrachloride, CCl4）誘導(dǎo)小鼠急性腎損傷模型，觀察CI994對(duì)小鼠腎損傷的影響，探究其潛在的治療性價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 主要試劑材料

無特定病原體（SPF）級(jí)雄性小鼠40只，體重25～30 g，購自川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（本研究符合川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)所制定的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)）；CCl4（川東化工），食用橄欖油（RONGS，西班牙），CI994（Selleck），尿素氮（blood urea nitrogen, BUN）、肌酐（serum creatinine, Scr）、丙二醛（malondialdehyde,MDA）及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）測(cè)定試劑盒（南京建成），胱抑素C（cystatin C,Cys C）ELISA試劑盒（美國），小鼠腎損傷分子1（kidney injury molecular 1, KIM-1）ELISA試劑盒（上海瓦蘭）。CCl4與橄欖油按照1∶9的體積比例配置成10% CCl4溶液。CI994溶于DMSO，配置成200 mmol/L濃度，并用生理鹽水配制成最終濃度4 mmol/L（約1.08 mg/ml）。

1.2 CCl4誘導(dǎo)小鼠急性腎損傷模型的復(fù)制

參照KOICHIRO SUZUKI等的實(shí)驗(yàn)方法建立CCl4誘導(dǎo)小鼠急性腎損傷模型[9]。將小鼠隨機(jī)分為4組，對(duì)照組：一次性腹腔注射300 μl生理鹽水；藥物對(duì)照組：在腹腔注射等體積生理鹽水6 h后腹腔注射CI994，注射劑量為10 mg/kg，24 h后再次注射等劑量CI994；CCl4造模組：按20 ml/kg體重的劑量一次性腹腔注射10% CCl4溶液；CI994治療組：在CCl4給藥后6和24 h分別腹腔注射CI994，注射劑量為10 mg/kg[10]。于給藥CCl4后48 h通過提尾法收集尿液，然后腹腔注射麻醉后處死小鼠，心臟采集全血，不加抗凝劑靜置2 h，離心并收集血清。開腹收集腎組織標(biāo)本進(jìn)行包埋固定或者液氮冷凍保存。

1.3 腎功能指標(biāo)檢測(cè)

用7600全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清BUN、Scr，采用ELISA法測(cè)血清Cys C、尿液KIM-1水平。具體方法參照試劑盒說明書。

1.4 組織勻漿及MDA、SOD含量檢測(cè)

取腎組織0.75 g，用剪刀剪碎后加20倍干重體積的0.05 mol/L預(yù)冷PBS緩沖液在勻漿機(jī)內(nèi)勻漿，制成5%腎勻漿。參照試劑盒說明書，采用7600全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定MDA水平和SOD活性。

1.5 腎臟組織HE染色

取小鼠完整左腎組織固定于10%中性甲醛溶液48 h，經(jīng)脫水、透明和包埋，制成腎組織石蠟塊。石蠟包埋切片，行HE染色鏡下觀察腎組織病理改變。

1.6 組織mRNA提取以及細(xì)胞色素2E1（CYP2E1）表達(dá)水平檢測(cè)

取適量-80℃保存的腎臟組織，采用Trizol法提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后合成cDNA，采用SYBR法行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)細(xì)胞色素2E1（cytochrome P450 2E1, CYP2E1）mRNA水平。檢測(cè)所用的小鼠CYP2E1引物序列：正向AGAGACCACCA GCACAACTC，反向TTCATCCTGTCTCGGACTGC。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠血清的BUN、Scr和Cys C水平比較

各組小鼠血清的BUN、Scr和Cys C水平比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（BUN：F=66.594，P=0.000；Scr：F=181.818，P=0.000；Cys C：F=82.059，P=0.000）。藥物對(duì)照組與對(duì)照組BUN、Cys C等指標(biāo)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與對(duì)照組比較，CCl4造模組小鼠注射CCl448h后BUN、Scr和Cys C均升高（P＜0.05）。通過CI994治療各組指標(biāo)均有一定程度回落，與CCl4造模組和對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組小鼠腎功能指標(biāo)的比較（n=10，±s）

表1 各組小鼠腎功能指標(biāo)的比較（n=10，±s）

注：1）與對(duì)照組比較，P＜0.05；2）與CCl4造模組比較，P＜0.05

組別 BUN/（mg/dl） Scr/（mg/dl） Cys C/（mg/L）對(duì)照組 21.78±2.02 0.599±0.097 3.818±0.202藥物對(duì)照組 20.65±3.42 0.712±0.156 4.123±0.325 CCl4造模組 93.64±9.371）3.624±0.2791）14.379±2.9121）CI994 治療組 60.36±5.721）2）2.354±0.1761）2）9.213±1.0551）2）F值 66.594 181.818 82.059P值 0.000 0.000 0.000

2.2 各組小鼠尿液KIM-1含量比較

各組小鼠尿液KIM-1含量比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=152.279，P=0.000）。與對(duì)照組比較，藥物對(duì)照組尿液KIM-1含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），CCl4造模組小鼠注射CCl448 h后KIM-1升高（P＜0.05），經(jīng)CI994治療小鼠KIM-1有一定程度降低，但仍然高于對(duì)照組（P＜0.05）。見圖1。

2.3 腎組織形態(tài)學(xué)變化

對(duì)照組和藥物對(duì)照組腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)正常。CCl4造模組可見腎小管上皮細(xì)胞變性，腎小管囊腔緊縮，空泡樣變化明顯，細(xì)胞腫脹、壞死和脫落；腎小球和微血管中大量淤血，甚至腎小管中亦有滲血情況；腎小球萎縮退化，腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤；CI994治療組腎臟仍然存在空泡樣變、腎小球和微血管中淤血、腎小管細(xì)胞腫脹等情況，但損傷程度均較造模組輕，見圖2。

2.4 腎組織MDA含量和SOD活性比較

4組MDA和SOD變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（MDA：F=65.735，P=0.000；SOD ：F=13.272，P=0.000）。藥物對(duì)照組相與對(duì)照組MDA和SOD比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。CCl4造模組MDA和SOD與對(duì)照組比較升高（P＜0.05），經(jīng)過CI994治療后，MDA和SOD降低（與CCl4造模組和對(duì)照組比較，P＜0.05），見表2。

2.5 各組小鼠CYP2E1 mRNA表達(dá)水平比較

各組小鼠腎組織CYP2E1的mRNA表達(dá)水平比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=45.642，P=0.000）。CCl4造模組CYP2E1 mRNA表達(dá)水平在腎臟中相對(duì)于對(duì)照組升高（P＜0.05），而CI994治療組CYP2E1 mRNA表達(dá)水平降低（與對(duì)照組和CCl4造模組比較，P＜0.05）。見圖3。

圖1 4組小鼠尿液Kim-1含量的變化

圖2 4組小鼠腎組織病理改變 （×200）

表2 CI994對(duì)各組小鼠腎組織MDA含量和SOD活性的影響

圖3 4組小鼠腎組織CYP2E1 mRNA表達(dá)水平的變化

3 討論

腎臟作為機(jī)體主要的排泄器官，是多種藥物的代謝場(chǎng)所，亦是最容易受到毒性損傷的器官。其功能受損會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)代謝終產(chǎn)物堆積，典型標(biāo)志為尿素氮和肌酐水平上升50%以上[11]。本研究分析CI994對(duì)于CCl4介導(dǎo)的小鼠急性腎損傷的治療作用，結(jié)果顯示CCl4誘導(dǎo)的小鼠腎損傷進(jìn)程受到CI994的阻斷，提示CI994是一種理想的急性腎損傷治療藥物。

四氯化碳作為一種典型的親肝毒物，對(duì)腎臟亦具有強(qiáng)烈的毒性損傷效應(yīng)[12]。CCl4作用于肝臟中產(chǎn)生的自由基（如CCl3-和CCl3O2-），通過血液進(jìn)入腎臟，并攻擊腎小管、腎小球細(xì)胞膜上的磷脂分子，引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，進(jìn)而發(fā)生急性腎損傷[13]。因此，CCl4模型常用于探索藥物性腎損傷發(fā)病機(jī)制和評(píng)估抗腎損傷藥物的藥效等實(shí)驗(yàn)研究。大鼠實(shí)驗(yàn)中證實(shí)CCl4誘導(dǎo)急性腎損傷后導(dǎo)致腎臟活性氧反應(yīng)出現(xiàn)紊亂，磷脂氫過氧化物、血清和腎組織MDA均升高[14]。本研究中，造模小鼠經(jīng)腹腔注射CCl4后出現(xiàn)精神萎靡、動(dòng)作遲緩等癥狀；同時(shí)血清中尿素氮和肌酐增高，CYP2E1在腎組織中出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)；光學(xué)顯微鏡下腎小球萎縮退化，近端小管上皮細(xì)胞變性壞死；尿液中KIM-1含量升高，提示CCl4對(duì)小鼠同樣造成嚴(yán)重的腎損傷，表明造模組小鼠表出現(xiàn)典型的急性腎功能衰竭癥狀。

組蛋白去乙?；敢种苿┚哂锌估w維化、抗炎、抗氧化的作用并參與調(diào)控多種疾病的發(fā)生、發(fā)展。ADVANI等研究小鼠糖尿病模型時(shí)發(fā)現(xiàn)SAHA可通過減少體內(nèi)活性氧產(chǎn)物的方式改善腎臟的損傷[6]。李瑞芳和Katrienvan Beneden分別通過復(fù)制腎性高血壓大鼠腎臟纖維化模型和小鼠阿霉素腎病模型并使用組蛋白去乙?；敢种苿┨幚頃r(shí)發(fā)現(xiàn)丙戊酸鈉（VPA）可有效降低大鼠和小鼠的腎損傷程度[7，15]。汪麗等證實(shí)SAHA可通過下調(diào)OPN、CD44表達(dá)，降低氧化應(yīng)激水平等機(jī)制預(yù)防腎結(jié)石形成和減弱腎損傷程度[16]。SAHA和VPA均為廣譜性HDAC抑制劑，但其也存在較大局限性，如藥效不穩(wěn)定、副作用較強(qiáng)等[17]。本研究基于國內(nèi)外研究，采用CI994這種Ⅰ類HDAC特異性抑制劑對(duì)腎損傷的作用做進(jìn)一步的探討。CI994是一種組蛋白去乙?；敢种苿赏瑫r(shí)抑制HDAC1、2和3的去乙?；δ躘6]，并通過上調(diào)生長抑素受體亞型2（somatostatin receptor subtype 2, SSTR2）抑制腫瘤細(xì)胞增殖[18]。本研究中，在CCl4誘導(dǎo)小鼠腎損傷并給予CI994腹腔注射后，其血清BUN、Scr以及尿液KIM-1下降，說明CI994對(duì)腎損傷有著抑制作用。并且實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)腎臟中MDA含量隨著CI994的使用而呈下降趨勢(shì)，SOD活性成上升趨勢(shì)，提示CI994可能通過調(diào)控組蛋白乙?；酱龠M(jìn)細(xì)胞氧化損傷修復(fù)從而促進(jìn)細(xì)胞對(duì)CCl4毒性的代謝。

細(xì)胞色素CYP2E1是肝腎等組織中特異性表達(dá)的氧化損傷應(yīng)答關(guān)鍵因子之一，其在藥物損傷過程中表達(dá)水平急劇上升，并導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)異常升高[19]。WANG等通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)抑制CYP2E1表達(dá)可通過抑制催化鐵的釋放、降低活性氧簇（ROS）的生成，從而有效減輕急性腎損傷程度[20-21]。本研究中，CCl4介導(dǎo)小鼠急性腎損傷期間，CYP2E1 mRNA表達(dá)水平急劇上升、SOD活性下降均提示胞內(nèi)活性氧成分積累過度，細(xì)胞損傷嚴(yán)重。通過給藥CI994后，CYP2E1 mRNA表達(dá)水平下降，同時(shí)腎功能相關(guān)指標(biāo)如BUN、Scr等均出現(xiàn)回降趨勢(shì)，提示CI994對(duì)CCl4介導(dǎo)的小鼠急性腎損傷的治療性作用機(jī)制可能是通過降低CYP2E1表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，CI994對(duì)腎損傷具有治療性作用，相關(guān)機(jī)制可能與Ⅰ相毒物代謝蛋白CYP2E1的表達(dá)下調(diào)有關(guān)。這對(duì)防治急性腎損傷或許有良好的應(yīng)用前景，但關(guān)于HDAC抑制劑減輕損傷的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步闡明。