N-乙酰半胱氨酸對丙酮醛誘導的人腎小管上皮細胞損傷的保護作用及機制研究*

羅婷，莊曉東，凡棟，顧海風，陳燕玲，康毅，吳秀香，王曉玲

（1.遵義醫(yī)學院珠海校區(qū) 病理生理學教研室，廣東 珠海 519041；2.中山大學附屬第一醫(yī)院 心血管內(nèi)科，廣東 廣州 510080；3.中山大學腫瘤醫(yī)院 婦科，廣東 廣州 510080）

丙酮醛作為葡萄糖代謝的副產(chǎn)物，是晚期糖基化終產(chǎn)物（advanced glycosylation end products, AGEs）的前體，可快速生成AGEs[1]。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，丙酮醛在糖尿病患者靶器官損傷中具有重要作用[2]。長期高血糖可導致丙酮醛生成增加，丙酮醛可通過修飾蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及核糖核酸等引起細胞損傷。體外研究發(fā)現(xiàn)，腎系膜細胞、心肌細胞及內(nèi)皮細胞等經(jīng)丙酮醛處理后均發(fā)生明顯損傷[3-5]。而筆者前期的研究也發(fā)現(xiàn)，丙酮醛可以引起人腎小管上皮細胞（HK-2細胞）損傷[6]。腎小管上皮細胞損傷在糖尿病腎病發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。腎小管上皮細胞凋亡可使腎小管重吸收及排泌功能失調(diào)，促進腎小管萎縮及腎功能惡化。而目前，在臨床上還缺乏針對糖尿病腎病的特效藥，只能通過對癥治療，療效欠佳。

N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl cystein, NAC）是臨床上治療慢性呼吸系統(tǒng)感染時常用的一種祛痰劑。是一種作用非常廣泛的氨基酸，研究報道其具有清除自由基、抗氧化應激、調(diào)節(jié)基因表達和信號轉導系統(tǒng)以及抑制細胞凋亡等作用[3]。NAC能否減輕丙酮醛誘導的腎小管上皮細胞損傷，目前尚未見報道。本實驗以HK-2細胞作為研究對象，探討NAC對丙酮醛誘導的HK-2細胞損傷是否具有抑制作用，并初步探討其可能的機制，為臨床治療糖尿病腎病提供新的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 HK-2細胞來源及細胞培養(yǎng) HK-2細胞由中山大學中山醫(yī)學院高血壓研究所王蔚東教授提供[7]。細胞接種于25 cm2無菌培養(yǎng)瓶中，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基在37℃、5%二氧化碳CO2條件下培養(yǎng)，每隔1天進行1次細胞傳代，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.1.2 藥物與相關試劑 細胞培養(yǎng)用的DMEM/F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶及胎牛血清購自Gibco公司，丙酮醛（購自上海源葉生物科技有限公司）（純度≥95%），CCK-8細胞計數(shù)試劑盒（購自同仁化學研究所），Rh123及DAPI染色液（購自Sigma公司），Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3、p-ERK1/2、GAPDH抗體（購自Cell Signaling Technology公司）。

1.2 實驗儀器

蛋白電泳儀及細胞培養(yǎng)箱（Bio-Rad公司），熒光倒置顯微鏡（Olympus公司），酶聯(lián)免疫檢測儀（Thermo Fisher Scientific公司）。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組 實驗分組：對照組（只加正常培養(yǎng)基）、丙酮醛組（加入400 μmol/L丙酮醛處理24 h）、丙酮醛+不同濃度NAC組[400 μmol/L丙酮醛與不同濃度NAC（1、2、4及8 mmol/L）共孵育24 h]。

1.3.2 CCK-8法檢測細胞生長活力 取處于對數(shù)生長期且生長狀態(tài)良好的細胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，按2×108個/L的細胞密度接種在96孔板中。根據(jù)實驗分組給予不同藥物處理，每組設置5個平行復孔。細胞培養(yǎng)24 h后，棄上清液，每孔加入100 μl含10% CCK-8的無血清培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1.5 h，用酶標儀在波長450 nm處測定吸光度值（OD）。細胞活力（%）=（試驗組OD值-空白孔OD值）/（對照組OD值-空白孔OD值）×100%。

1.3.3 DAPI染色觀察HK-2細胞核形態(tài)變化 取處于對數(shù)生長期且生長狀態(tài)良好的細胞，用胰蛋白酶消化后，按3×107個/L的細胞密度接種在6孔板中。按分組給予不同藥物處理后，棄培養(yǎng)基，用4%多聚甲醛固定10 min，再用PBS漂洗3遍后，然后加入終濃度為1 μg/LDAPI染色液，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中避光孵育20 min，吸除DAPI染色液，再用PBS漂洗3遍，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.4 細胞線粒體膜電位檢測 取處于對數(shù)生長期且生長狀態(tài)良好的細胞，胰蛋白酶消化后，按3×107個/L的細胞密度接種在6孔板中，每組設置3個平行復孔。根據(jù)分組給予相應藥物處理24 h后，吸除培養(yǎng)基，用PBS清洗2遍，然后加入終濃度為100 μg/L羅丹明123的無血清培養(yǎng)基，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育30 min，用PBS漂洗3遍，熒光顯微鏡下觀察并隨機選取10個不重復視野進行拍照。同時重復1次上述實驗，在染色完成后，PBS漂洗3次，然后用不含EDTA的胰酶消化收集細胞，離心，棄上清液，加入PBS吹打混勻，流式細胞儀上機檢測細胞內(nèi)線粒體膜電位變化。

1.3.5 Western blot測 定 HK-2細 胞 Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3及p-ERK1/2蛋白表達水平 取處于對數(shù)生長期且生長狀態(tài)良好的細胞，用胰蛋白酶消化后，按照4×106個/L的細胞密度接種在100 mm培養(yǎng)皿中，待細胞長至鋪滿皿底約85%時，根據(jù)實驗分組加入相應藥物處理24 h后，棄培養(yǎng)基，用預冷的PBS洗3遍，再加入150～250 μl含有PMSF的RIPA裂解液，在冰上裂解細胞20 min，然后用細胞刮把蛋白刮下來，收集到1.5 ml EP管中，12 000 r/min離心10 min，吸取上清液。然后用BCA蛋白定量試劑盒（Thermo Scientific Pierce）檢測蛋白濃度。每個泳道上樣量為60 μg蛋白。電泳：80 V恒壓跑膠30 min；然后改為120 V恒壓跑膠60 min；轉膜：220 mA恒流轉60 min，p-ERK1/2蛋白轉90 min。PVDF膜用5%脫脂奶粉室溫下封閉60 min，然后加入Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3及p-ERK1/2抗體（抗體稀釋倍數(shù)1∶1 000）孵育過夜，再用TBST洗3次，加入辣根過氧化物酶標記Ⅱ抗（抗體稀釋倍數(shù)1∶5 000），室溫下孵育60 min，TBST洗3次，最后經(jīng)Jena成像儀掃描或者暗室曝光顯影后，Image J軟件分析條帶的光密度值。GAPDH為內(nèi)參，以目的條帶與內(nèi)參的密度值的比值作為目的蛋白的相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間正態(tài)分布的計量資料比較用單因素方差分析，組間均數(shù)的兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 NAC對丙酮醛誘導的HK-2細胞活力的影響

顯微鏡下示，正常HK-2細胞呈橢圓形或梭形，并呈鋪路石樣排列（見圖1）。與對照組比較，加入400 μmol/L的丙酮醛后，HK-2細胞活力降低，約有對照組的40%（P＜0.01），而加入不同濃度的NAC處理后，HK-2細胞活力均有不同程度的升高，且隨著NAC劑量的增加，細胞活力呈劑量依賴性升高（P＜0.01）（見表1）。

2.2 NAC對丙酮醛誘導的HK-2細胞凋亡的影響

正常HK-2細胞經(jīng)DAPI染色后細胞核呈現(xiàn)均勻的低密度藍色熒光。對照組HK-2細胞胞核顯示均勻的低密度藍色熒光，經(jīng)400 μmol/L丙酮醛處理后，部分細胞胞核出現(xiàn)局部高密度藍色熒光，呈明顯的凋亡特征，即呈現(xiàn)核分裂及核固縮。而使用不同濃度NAC處理后，具有凋亡形態(tài)的細胞核數(shù)量減少。見圖2。

表1 不同濃度NAC對丙酮醛誘導的HK-2細胞活力的影響 （n=5，%，±s）

表1 不同濃度NAC對丙酮醛誘導的HK-2細胞活力的影響 （n=5，%，±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與丙酮醛組比較，P＜0.05

細胞活力組別對照組 113.700±1.578 400 μmol/L 丙酮醛組 48.528±1.3661）400 μmol/L 丙酮醛 +1 mmol/L NAC 組 56.544±0.4872）400 μmol/L 丙酮醛 +2 mmol/L NAC 組 67.896±2.2602）400 μmol/L 丙酮醛 +4 mmol/L NAC 組 83.622±0.8112）400 μmol/L 丙酮醛 +8 mmol/L NAC 組 87.759±0.7652）F值 308.770P值 0.000

圖1 正常HK-2細胞形態(tài) （×100）

2.3 NAC對丙酮醛誘導的HK-2細胞線粒體膜電位的影響

對照組HK-2細胞綠色熒光強度較強，線粒體膜電位較高；而經(jīng)400 μmol/L的丙酮醛處理后，綠色熒光強度減弱，線粒體膜電位降低；但加入NAC處理后，線粒體膜電位逐漸升高，以8 mmol/LNAC組最為明顯。通過流式細胞儀檢測也可得到相似的結果，1和2 mmol/L NAC處理組平均熒光強度與丙酮醛組比較差異無統(tǒng)計學意義。當NAC濃度增高至4 mmol/L時，平均熒光強度增高，與丙酮醛組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖3、4 和表2。

2.4 NAC對丙酮醛誘導的HK-2細胞Bax、Bcl-2蛋白表達的影響

Western blot檢測，與對照組比較，HK-2細胞經(jīng)丙酮醛處理后，Bax/Bcl-2比值升高（P＜0.01）。而經(jīng)不同濃度NAC干預后，Bax/Bcl-2比值降低（P＜0.01）。見圖5和表3。

2.5 NAC對丙酮醛誘導的HK-2細胞Cleaved Caspase-3蛋白表達的影響

Western blot結果顯示，對照組HK-2細胞Cleaved Caspase-3蛋白有基礎量表達，丙酮醛作用24 h后，HK-2細胞Cleaved Caspase-3蛋白表達量較對照組增高（P＜0.01），而加入不同濃度NAC處理后，各組細胞Cleaved Caspase-3蛋白表達量降低（P＜0.05）。見圖6和表4。

2.6 NAC對丙酮醛誘導的HK-2細胞p-ERK1/2蛋白表達的影響

對照組HK-2細胞p-ERK1/2蛋白有基礎量表達，經(jīng)400μmol/L濃度的丙酮醛作用24 h后，p-ERK1/2蛋白表達水平升高（P＜0.05），而加入不同濃度NAC處理后，各組細胞p-ERK1/2蛋白表達水平均降低（P＜0.05）。見圖7和表5。

圖2 各組細胞核形態(tài)學變化 （DAPI熒光染色×200）

圖3 各組細胞線粒體膜電位 （熒光顯微鏡×200）

圖4 流式細胞儀檢測各組細胞線粒體膜電位

表2 NAC對丙酮醛誘導的HK-2細胞線粒體膜電位的影響 （n=3，±s）

表2 NAC對丙酮醛誘導的HK-2細胞線粒體膜電位的影響 （n=3，±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與丙酮醛組比較，P＜0.05

組別 平均熒光強度對照組 2 079.983±62.476 400 μmol/L 丙酮醛組 1 462.207±173.1871）400 μmol/L丙酮醛+1 mmol/L NAC組 1 610.097±117.216 400 μmol/L丙酮醛+2 mmol/L NAC組 1 712.750±107.291 400 μmol/L 丙酮醛 +4 mmol/L NAC 組 1 887.243±78.8702）400 μmol/L 丙酮醛 +8 mmol/L NAC 組 1 994.003±99.9522）F值 4.474P值 0.016

圖5 各組細胞Bax、Bcl-2蛋白表達 （n=3，±s）

表3 NAC對丙酮醛誘導的HK-2細胞Bax與Bcl-2蛋白比值的影響 （n=3，±s）

表3 NAC對丙酮醛誘導的HK-2細胞Bax與Bcl-2蛋白比值的影響 （n=3，±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與丙酮醛組比較，P＜0.05

組別 Bax灰度值/Bcl-2灰度值對照組 0.672±0.067 400 μmol/L 丙酮醛組 2.617±0.1311）400 μmol/L 丙酮醛 +1 mmol/L NAC 組 0.581±0.0602）400 μmol/L 丙酮醛 +2 mmol/L NAC 組 0.498±0.0752）400 μmol/L 丙酮醛 +4 mmol/L NAC 組 0.249±0.0142）400 μmol/L 丙酮醛 +8 mmol/L NAC 組 0.315±0.0522）F值 141.132P值 0.000

圖6 各組細胞Cleaved Caspase-3表達（n=3，±s）

表4 NAC對丙酮醛誘導的HK-2細胞Cleaved Caspase-3 蛋白表達的影響 （n=3，±s）

表4 NAC對丙酮醛誘導的HK-2細胞Cleaved Caspase-3 蛋白表達的影響 （n=3，±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與丙酮醛組比較，P＜0.05

組別 Cleaved Caspase-3灰度值/GAPDH灰度值對照組 0.517±0.062 400 μmol/L 丙酮醛組 1.185±0.0281）400 μmol/L 丙酮醛 +1 mmol/L NAC 組 0.887±0.0292）400 μmol/L 丙酮醛 +2 mmol/L NAC 組 1.026±0.0812）400 μmol/L 丙酮醛 +4 mmol/L NAC 組 0.428±0.0342）400 μmol/L 丙酮醛 +8 mmol/L NAC 組 0.625±0.0372）F值 37.439P值 0.000

圖7 各組細胞p-ERK1/2蛋白的相對表達（n=3，±s）

表5 NAC對丙酮醛誘導的HK-2細胞p-ERK1/2蛋白表達的影響 （n=3，±s）

表5 NAC對丙酮醛誘導的HK-2細胞p-ERK1/2蛋白表達的影響 （n=3，±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與丙酮醛組比較，P＜0.05

組別 p-ERK灰度值/GAPDH灰度值對照組 0.687±0.066 400 μmol/L 丙酮醛組 0.996±0.1091）400 μmol/L 丙酮醛 +1 mmol/L NAC 組 0.506±0.0882）400 μmol/L 丙酮醛 +2 mmol/L NAC 組 0.497±0.0982）400 μmol/L 丙酮醛 +4 mmol/L NAC 組 0.518±0.0642）400 μmol/L 丙酮醛 +8 mmol/L NAC 組 0.448±0.0602）F值 6.155P值 0.005

3 討論

以往對糖尿病腎病的研究主要集中在腎小球損傷，但是近年來研究發(fā)現(xiàn)在糖尿病腎病中腎小管損傷可能要早于腎小球損傷，且其在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[8]。研究報道，糖尿病大鼠在病程第1周即可觀察到腎小管擴張及腎小管上皮細胞變性，且隨著時間推移，腎小管受損的數(shù)目增加，損傷程度加重[9]。糖尿病引起的腎小管損傷主要表現(xiàn)為腎小管上皮細胞肥大、高轉運及凋亡。腎小管上皮細胞凋亡可促進腎小管萎縮及腎功能惡化[10]。因此，通過控制腎小管損傷可能可以達到預防及治療糖尿病腎病的目的。

本研究顯示，HK-2細胞經(jīng)丙酮醛作用24 h后，細胞存活率降低，部分細胞發(fā)生凋亡；而經(jīng)NAC處理后細胞存活率升高，凋亡細胞減少，說明NAC具有對抗丙酮醛誘導的HK-2細胞損傷的作用。

細胞凋亡主要有兩種途徑：外源性信號通路和內(nèi)源性信號通路。內(nèi)源性信號通路是由線粒體介導的。線粒體不僅是產(chǎn)生能量的關鍵場所，也是控制細胞存活的關鍵細胞器。線粒體膜電位的崩塌，細胞色素C的釋放會啟動Caspase級聯(lián)反應，執(zhí)行凋亡程序[11]。在該過程中還有Bcl-2家族的參與。Bcl-2蛋白是內(nèi)源性凋亡途徑的重要調(diào)節(jié)蛋白，當其表達量較高占主導地位時，可與Bax蛋白形成二聚體，抑制Bax的活性，預防細胞色素C從線粒體釋放，從而抑制Caspase的活性[12-13]。而當Bax過表達占主導地位時，可與自身形成Bax/Bax同源二聚體，誘導細胞發(fā)生凋亡。因此，Bax與Bcl-2兩者間的比例決定細胞是否發(fā)生凋亡。當細胞發(fā)生凋亡時，Bax與Bcl-2兩者的比值會增高[14]。Caspase-3作為凋亡的執(zhí)行蛋白，其激活是凋亡級聯(lián)反應中的關鍵環(huán)節(jié)，抑制Caspase-3的激活可以抑制細胞發(fā)生凋亡[15-16]。本實驗結果顯示，NAC可以抑制丙酮醛引起的HK-2細胞線粒體膜電位降低，并且降低Bax/Bcl-2的比值及Cleaved Caspase-3蛋白表達，說明NAC可能通過線粒體途徑抑制細胞凋亡。

研究報道，NAC可以分別通過抑制p38 MAPK信號通路以及JNK信號通路抑制丙酮醛誘導的人腹膜間皮細胞以及H9C2心肌細胞凋亡[3，17]。說明NAC抗凋亡的作用與MAPK信號通路密切相關。而糖尿病引起腎小管損傷也與MAPK家族相關。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠病程第2周起，腎小管上皮細胞ERK蛋白表達水平增高[9]。本研究結果顯示，HK-2細胞經(jīng)丙酮醛處理后，p-ERK1/2蛋白表達增高，而加入NAC后，p-ERK1/2蛋白表達降低，提示NAC對抗丙酮醛誘導的細胞損傷作用可能與抑制ERK1/2信號通路有關，但其確切機制還有待進一步探討。

綜上所述，NAC對丙酮醛誘導的HK-2細胞損傷具有保護作用，其機制可能與其抗凋亡及抑制ERK1/2信號通路有關。