蔬菜枯萎病鐮刀菌種類研究

劉一景

（山西省植物保護(hù)植物檢疫總站，山西太原　030000）

蔬菜是人們生活中不可或缺的食物，目前我國蔬菜種植面積約2000萬hm2?？菸∈怯绊懯卟松a(chǎn)最主要的病害之一[1]。特別是由于保護(hù)地的特殊環(huán)境條件和長期連作，土壤中的病原菌量積累越來越多，使枯萎病之類的土傳病害發(fā)生逐年加重[2]。鐮刀菌(Fusarium)是引起枯萎病的病原菌，廣泛分布于自然界中，可侵害多種農(nóng)作物[3]。鐮刀菌是植物維管束系統(tǒng)的寄生菌，在適宜的環(huán)境條件下，不但破壞作物的輸導(dǎo)組織維管束，而且在菌體生長發(fā)育代謝過程中產(chǎn)生毒素危害作物，造成作物萎蔫死亡，嚴(yán)重時(shí)影響產(chǎn)量和品質(zhì)[4]。

由于鐮刀菌對(duì)人類的生產(chǎn)生活影響極大，許多科學(xué)家不斷地對(duì)鐮刀菌的形態(tài)、生理、致病性等多方面進(jìn)行研究。因鐮刀菌形態(tài)復(fù)雜，又易受到營養(yǎng)和外界環(huán)境影響而發(fā)生變異，所以給鐮刀菌的分類鑒定造成了一定的困難，同時(shí)也給科學(xué)家提出了挑戰(zhàn)，引起了人們的關(guān)注[5,6]。在我國，從谷類糧食、蔬菜中檢測出鐮刀菌的現(xiàn)象屢有報(bào)道，但對(duì)其有效防治和準(zhǔn)確的鑒定還有欠缺，對(duì)鐮刀菌種的研究還有待進(jìn)一步的加強(qiáng)。因此，研究和明確一個(gè)地區(qū)的鐮刀菌種類，對(duì)于檢疫、病害防治、資源利用是一項(xiàng)基礎(chǔ)性工作，具有重要的意義。本次研究對(duì)主要蔬菜枯萎病鐮刀菌種類進(jìn)行鑒定，了解鐮刀菌種類資源狀況，豐富真菌資源，為由鐮刀菌引起的枯萎病的研究與防治提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　試驗(yàn)材料

1.1.1供試菌株。鐮刀菌（Fusarium）菌株根據(jù)來源不同作物分別標(biāo)記為，黃瓜（Fc01、Fc02、Fc03、Fc04、Fc05、Fc06、Fc07、Fc08），西瓜（Fw09），茄子（Fe10、Fe11），番茄（Ft12），油菜（Fr13）。

1.1.2供試培養(yǎng)基。PDA培養(yǎng)基，PSA培養(yǎng)基，Bilai’s培養(yǎng)基，米飯培養(yǎng)基。

1.2　試驗(yàn)方法

1.2.1培養(yǎng)性狀試驗(yàn)方法。①菌株的活化：從儲(chǔ)存的菌株中挑取菌絲，轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上于25℃條件下培養(yǎng)5d。②菌落生長速度測定：PSA培養(yǎng)基上接菌，每皿2塊，重復(fù)2次，于25℃下培養(yǎng)4d后，測量菌落直徑，并取其平均值。③菌落質(zhì)地及顏色測定：觀察轉(zhuǎn)接到PSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)1周后的菌落質(zhì)地，即氣生菌絲是否茂盛，是否為棉絮狀、羊毛狀、絨狀或氈狀等，菌絲顏色，基物表面顏色，基物顏色（培養(yǎng)基有無變色，菌株有無分泌色素）。在Bilai’s培養(yǎng)基上接菌的方法同PSA培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件相同，1周后觀察菌落顏色,是否疏松。米飯培養(yǎng)基上每試管接入2塊菌，重復(fù)4次，25℃條件下恒溫培養(yǎng)20 d后，觀察顏色。

1.2.2形態(tài)特征試驗(yàn)方法。①分生孢子特征的測定：待PSA培養(yǎng)基上的菌株培養(yǎng)2周后，制作臨時(shí)玻片。在顯微鏡10×40倍數(shù)下進(jìn)行檢測。分別觀察小型分生孢子和大型分生孢子的數(shù)量狀況、形狀、著生方式、有無分隔及分隔數(shù)，大、小型分生孢子各隨機(jī)選取30個(gè)，測量其長和寬，最后進(jìn)行顯微攝影并記錄。②產(chǎn)孢細(xì)胞特征的測定：判斷產(chǎn)孢細(xì)胞是屬于單瓶梗還是復(fù)瓶梗，并且觀察其長度，最后進(jìn)行顯微攝影。

1.2.3綜合鑒定方法。根據(jù)上述的培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征測定結(jié)果按 Booth （1971）、Nelson（1983）、Brayford（1993）和 Leslie（2006）的分類系統(tǒng),結(jié)合《常見鐮刀菌鑒定指南》對(duì)鐮刀菌菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定[7]。首先利用鐮刀菌組和種的檢索表，初步查出供試菌株的分類地位，再和同一組中相類似的種類進(jìn)行相對(duì)應(yīng)項(xiàng)目的比較，最后根據(jù)綜合性狀鑒定出所得菌株的種名。

2　結(jié)果與分析

2.1　研究結(jié)果

2.1.1菌株Fc01。①培養(yǎng)性狀：平均生長速度為4.3cm。在PSA培養(yǎng)基上氣生菌絲棉絮狀，最初白色，后變淺駝色，基物表面淺黃色至駝色，基物不變色（A）。在Bilai’s培養(yǎng)基上菌絲稀疏，白色。在米飯培養(yǎng)基上呈黃色（B）。②形態(tài)特征：小型分生孢子多，橢圓形、腎形、瓜子形等，0～2隔，大小為 5.8～20μm×2.8～4μm（C）。大型分生孢子紡錘形，或稍彎成鐮刀狀，2～6隔，多數(shù)3隔，大小為 15～44.2μm×3～6μm（D）。產(chǎn)孢細(xì)胞復(fù)瓶梗，較長（E）（圖1）。

圖1　菌株Fc01形態(tài)學(xué)特性

2.1.2菌株Fc02。①培養(yǎng)性狀：平均生長速度為3.9cm。在PSA培養(yǎng)基上氣生菌絲絨狀，米色、黃色、棕紅，基物表面棕紅、淺黃色，基物不變色，可形成桔黃色分生孢子座（A）。在Bilai’s培養(yǎng)基上菌絲稀疏，白色。米飯培養(yǎng)基上粉紅色（B）。②形態(tài)特征：小型分生孢子多,卵形、橢圓形、腎形、紡錘形等，大小為6.2～17.3μm×1.8～4.3μm（C）。大型分生孢子啞鈴形、紡錘形，或稍彎成鐮刀狀，大小為 16～34.7μm×2.4～6.5μm（D）。產(chǎn)孢細(xì)胞單瓶梗和復(fù)瓶梗均有，較短（E）（圖2）。

圖2　菌株Fc02形態(tài)學(xué)特性

2.1.3菌株Fc03。①培養(yǎng)性狀：平均生長速度為4.2cm。在PSA培養(yǎng)基上氣生菌絲絨狀，白色、粉白色，基物表面粉紅，基物不變色（A）。在Bilai’s培養(yǎng)基上菌絲少，白色。在米飯培養(yǎng)基上呈粉紅色（B）。②形態(tài)特征：小型分生孢子數(shù)量多，卵圓形或橢圓形，大小為5.2～12.3μm×2.8～4.6μm（C）。大型分生孢子月牙形，稍彎，多數(shù) 3隔，大小為 11.2～40μm×2.8～5.4μm（D）。產(chǎn)孢細(xì)胞單瓶梗，短（E）（圖3）。

圖3　菌株Fc03形態(tài)學(xué)特性

2.1.4菌株Fc04。①培養(yǎng)性狀：平均生長速度為3.9cm。在PSA培養(yǎng)基上氣生菌絲絨狀，白色、粉白色、深紅棕色，基物表面深紅棕色、淺黃色，基物不變色（A）。在Bilai’s培養(yǎng)基上菌絲少，白色。在米飯培養(yǎng)基上呈粉紅色（B）。②形態(tài)特征：小型分生孢子數(shù)量多，卵圓形、腎形或橢圓形，大小為 5～10.7μm×2.4～3.4μm（C）。大型分生孢子美麗形、月牙形，稍彎，向兩端比較均勻的逐漸變尖，多數(shù) 3隔，大小為 12～41μm×2.7～4.5μm（D）。產(chǎn)孢細(xì)胞單瓶梗，短（E）（圖4）。

圖4　菌株Fc04形態(tài)學(xué)特性

2.1.5菌株Fc05。①培養(yǎng)性狀：平均生長速度為3.8cm。在PSA培養(yǎng)基上氣生菌絲棉絮狀，培養(yǎng)初期白色至粉色，后變淺駝色，可長橘黃色分生孢子座，基物表面橙黃色至淡褐色，基物不變色（A）。Bilai’s培養(yǎng)基上氣生菌絲少，白色。米飯培養(yǎng)基上為淺咖啡色(B)。②形態(tài)特征：小型分生孢子極少。大型分生孢子鐮刀形，彎曲，3～7 隔，多數(shù) 3～5 隔，大小為 16.5～42μm×3～6μm（C、D）。產(chǎn)孢細(xì)胞單瓶梗，較長（E）（圖5）。

圖5　菌株Fc05形態(tài)學(xué)特性

2.1.6菌株Fc06。①培養(yǎng)性狀：平均生長速度為3.9cm。在PSA培養(yǎng)基上氣生菌絲絨狀，米色、黃色、棕紅色，基物表面紫紅色，淺黃色，基物不變色（A）。在Bilai’s培養(yǎng)基上菌絲稀疏，白色。米飯培養(yǎng)基上淡黃至紫色（B）。②形態(tài)特征：小型分生孢子多，卵形、橢圓形、腎形等，串生和假頭生并存，大小為4.4～20μm×2.1～3.7μm（C）。大型分生孢子紡錘形，或稍彎成鐮刀狀，大小為 16.8～33.7μm×3.1～6.7μm（D）。產(chǎn)孢細(xì)胞單瓶梗（E）（圖6）。

圖6　菌株Fc06形態(tài)學(xué)特性

2.1.7菌株Fc07。①培養(yǎng)性狀：平均生長速度為3.7cm。在PSA培養(yǎng)基上氣生菌絲絨狀，白色、粉白色，基物表面粉紅色，基物不變色（A）。在Bilai’s培養(yǎng)基上菌絲少，白色。在米飯培養(yǎng)基上呈粉紅色（B）。②形態(tài)特征：小型分生孢子數(shù)量多,卵圓形或腎形，大小為6.2～12.4μm×2.8～4.4μm（C）。大型分生孢子美麗形，月牙形，稍彎，大小為 15～47.2μm×3～4.7μm（D）。產(chǎn)孢細(xì)胞單瓶梗，短（E）（圖7）。

圖7　菌株Fc07形態(tài)學(xué)特性

圖8　菌株Fc08形態(tài)學(xué)特性

2.1.8菌株Fc08。①培養(yǎng)性狀：平均生長速度為3.8cm。在PSA培養(yǎng)基上氣生菌絲絨狀，白色，有黃色分生孢子座，基物表面橙色、淺黃色，基物不變色（A）。在Bilai’s培養(yǎng)基上菌絲稀疏，白色。米飯培養(yǎng)基上咖啡色（B）。②形態(tài)特征：小型分生孢子多,卵形、腎形，大小為7.1～15.5μm×3.1～4.2μm（C）。大型分生孢子馬特形，頂胞稍尖，大小為 15.1～35.2μm×3.3～6.4μm（D）。產(chǎn)孢細(xì)胞單瓶梗，長短不一（E）（圖8）。

2.1.9菌株Fw09。①培養(yǎng)性狀：平均生長速度為3.7cm。在PSA培養(yǎng)基上氣生菌絲絨狀，白色、粉白色，基物表面粉紅色，基物不變色（A）。在Bilai’s培養(yǎng)基上菌絲少，白色。在米飯培養(yǎng)基上呈粉紅色（B）。②形態(tài)特征：小型分生孢子數(shù)量多,卵圓形或橢圓形，大小為6.8～12.3μm×2.4～4.1μm（C）。大型分生孢子美麗形，月牙形，稍彎，向兩端比較均勻地逐漸變尖，多數(shù)3隔，大小為 11.9～42μm×2.6～4.7μm（D）。產(chǎn)孢細(xì)胞單瓶梗，短（E）（圖9）。

圖9　菌株Fw09形態(tài)學(xué)特性

2.1.10菌株Fe10。①培養(yǎng)性狀：平均生長速度為3.4cm。在PSA培養(yǎng)基上氣生菌絲絨狀，白色、粉白色，基物表面粉紅色，基物不變色（A）。在Bilai’s培養(yǎng)基上菌絲稀疏，白色。在米飯培養(yǎng)基上呈粉紅色（B）。②形態(tài)特征：小型分生孢子數(shù)量多，卵圓形或橢圓形，大小為 5.7～10.4μm×2～3.3μm （C）。大型分生孢子美麗形、鐮刀形，向兩端比較均勻地逐漸變尖，多數(shù)3隔，大小為 10.4～45.6μm×2.2～3.7μm（D）。產(chǎn)孢細(xì)胞單瓶梗，較短（E）（圖10）。

圖10　菌株Fe10形態(tài)學(xué)特性

2.1.11菌株Fe11。①培養(yǎng)性狀：平均生長速度為3.2cm。在PSA培養(yǎng)基上氣生菌絲絨狀，白色至淺灰色，基物表面肉色、淺棕色，基物不變色（A）。在Bilai’s培養(yǎng)基上菌絲稀疏，白色。在米飯培養(yǎng)基上黃色至淡咖啡色（B）。②形態(tài)特征：小型分生孢子多,卵形、橢圓形等，大小為 8.6～15.6μm×2.6～3.5μm（C）。大型分生孢子馬特形，兩端較鈍，大小為 11.7～35.5μm×3.3～4.2μm（D）。產(chǎn)孢細(xì)胞單瓶梗（E）（圖11）。

圖11　菌株Fe11形態(tài)學(xué)特性

2.1.12菌株Ft12。①培養(yǎng)性狀：平均生長速度為3.3cm。在PSA培養(yǎng)基上氣生菌絲棉絮狀，白色至淺灰色，基物表面淺肉色至紫色，基物不變色,兼有黃色分生孢子座（A）。在Bilai’s培養(yǎng)基上菌絲稀少，白色。在米飯培養(yǎng)基上呈黃色至淡咖啡色（B）。②形態(tài)特征：小型分生孢子多，卵形、橢圓形等，大小為4.5～16μm×1.5～4μm（C）。大型分生孢子較胖，馬特形，大小為14.1～34.2μm×3.7～5.5μm（D）。產(chǎn)孢細(xì)胞單瓶梗，少分枝，長短不一（E）（圖12）。

圖12　菌株Ft12形態(tài)學(xué)特性

2.1.13菌株Fr13。①培養(yǎng)性狀：平均生長速度為4.2cm。在PSA培養(yǎng)基上氣生菌絲絨狀，米色、黃色，基物表面橙色，淺黃色，基物不變色，可形成桔黃色分生孢子座（A）。在Bilai’s培養(yǎng)基上菌絲稀疏，白色。在米飯培養(yǎng)基上黃色（B）。②形態(tài)特征：小型分生孢子多,卵形、橢圓形等，假頭狀著生，大小為5.6～19.4μm×2.4～4μm（C）。大型分生孢子紡錘形，大小為11～34μm×2.8～5.5μm（D）。產(chǎn)孢細(xì)胞單瓶梗（E）（圖13）。

圖13　菌株Fr13形態(tài)學(xué)特性

2.2　分析

根據(jù)以上測得的結(jié)果，利用鐮刀菌檢索表，初步得出菌株Fc01為直孢組（Arthrosporiella section），菌株Fc02、Fc06、Fr13 為李瑟組（Liseola section），菌株 Fc05為膨孢組（Gibbosum section）, 菌株 Fc03、Fc04、Fc07、Fw09、Fe10為美麗組（Elegans section），菌株 Fc08、Fe11、Ft12為馬特組（Martiella section）。

通過種間特征對(duì)比，以及與標(biāo)準(zhǔn)形態(tài)圖對(duì)比，綜合得出最終鑒定結(jié)果(表1)：尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）5株,茄病鐮刀菌（Fusarium solani）3株，膠孢鐮刀菌（Fusarium subglutinans）)2株，擬枝孢鐮刀菌（Fusarium sporotrichioides）1株，木賊鐮刀菌（Fusarium equiseti）1株，串珠鐮刀菌（Fusarium moniliforme）1 株。

3　討論

3.1　菌的致病性

從鑒定的結(jié)果可以看出：尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）占供試總菌株的38%，其次是茄病鐮刀菌（Fusarium solani）為23%和膠孢鐮刀菌（Fusarium subg-lutinans）為15%，其余鑒定所得3種菌種類型則均為8%。雖然本研究未做鐮刀菌的致病性測定,但根據(jù)鐮刀菌鑒定結(jié)果和已有文獻(xiàn)報(bào)道[8]，說明尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）對(duì)蔬菜的侵染能力強(qiáng)，特別是黃瓜和茄子，表明尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）是蔬菜枯萎病的主要致病菌，其次是茄病鐮刀菌（Fusarium solani）和膠孢鐮刀菌（Fusarium subglutinans）。鐮刀菌有許多是腐生菌，所以很多植物的枯萎病可能受到一種或幾種鐮刀菌和其他病原菌的侵染，可以引起單獨(dú)侵染或復(fù)合侵染[9]。因此需要廣泛采集樣本來明確致病菌種類和優(yōu)勢(shì)種。本次研究的供試菌株只來源于4個(gè)種植區(qū)的5種蔬菜，共13株，不能完全代表蔬菜枯萎病鐮刀菌的所有種類，因此還有待后續(xù)研究更多樣本。

表1　主要蔬菜枯萎病鐮刀菌鑒定結(jié)果

3.2　致病菌的產(chǎn)生及防治

鑒定結(jié)果表明，不同的蔬菜上菌種類型可能不同，也可能相同，同一種蔬菜上菌種類型也可能不同，說明鐮刀菌種類與植物生理特征和植物生存環(huán)境有一定關(guān)系，尤其是小種?；途N。對(duì)于適合尖孢鐮刀菌的形成和繁殖的地區(qū)，可推薦其防治措施有：輪作，但要考慮輪作時(shí)間和植物的種類，不宜與寄主植物輪作，一般以水旱輪作比較好；合理選地整地，清理病株殘?bào)w，減少土壤濕度，抑制鐮刀菌生長發(fā)育，蔬菜收獲后要及時(shí)耕翻土壤，將殘株深埋于土中，加快病殘?bào)w的腐爛和防止子囊殼的形成；選育抗病品種；利用菌根真菌進(jìn)行生物防治；植物檢疫，有許多種鐮刀菌病害,如菜豆、洋蔥、大豆、菠菜等的枯萎病，國內(nèi)尚無報(bào)道，必須嚴(yán)格執(zhí)行檢疫，防止危險(xiǎn)性病害蔓延[10]。

3.3　培養(yǎng)基類型與菌株生長的關(guān)系

在鐮刀菌的培養(yǎng)中,我們發(fā)現(xiàn)在PSA培養(yǎng)基上鐮刀菌菌落明顯，容易觀察菌落特征，但部分鐮刀菌不易產(chǎn)生大型分生孢子或產(chǎn)孢數(shù)量少，給鐮刀菌的鑒定帶來很大困難。黃文芳曾提到不同培養(yǎng)基上，菌絲生長速度和密度不同[11]。一些在PSA培養(yǎng)基和米飯培養(yǎng)基上只產(chǎn)生小型分生孢子的菌株，在Bilai’s培養(yǎng)基上卻可以產(chǎn)生大型分生孢子。因此認(rèn)為，不同培養(yǎng)基對(duì)鐮刀菌營養(yǎng)生長和生殖生長有一定的影響，一般是營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基有利于營養(yǎng)生長，而營養(yǎng)貧乏的培養(yǎng)基有利于生殖生長。