瓊膠酶研究進(jìn)展

許競男

【摘 要】瓊膠酶（Agarase）是一類可以水解瓊膠和瓊脂糖的糖苷水解酶。根據(jù)作用方式的不同，瓊膠酶可以分為α-瓊膠酶和β-瓊膠酶。本文從瓊膠酶的分布來源、酶學(xué)性質(zhì)，應(yīng)用等方面綜述了瓊膠酶的研究進(jìn)展。

【關(guān)鍵詞】瓊膠酶；糖苷水解酶；綜述

瓊膠是紅藻的主要成分，又稱瓊脂，是一種一種海洋粘性多糖。瓊膠的有兩種主要組成成分，分別是是瓊脂糖（agarose）和硫瓊脂（agaropectin）[1]。瓊脂糖是瓊膠的最主要的組成成分，它是由3，6-內(nèi)醚-α-L-半乳糖和β- D -半乳糖通過α-1，3-糖苷鍵和β-1，4-糖苷件交替連接而成的線性多糖。瓊膠酶（Agarase）是一類可以水解瓊膠和瓊脂糖的糖苷水解酶。

一、瓊膠酶的分類方式

瓊膠酶（Agarase）是一類可以水解瓊膠和瓊脂糖的糖苷水解酶。根據(jù)作用方式的不同，瓊膠酶可以分為α-瓊膠酶和β-瓊膠酶。α-瓊膠酶（EC3.2.1.158）能夠水解瓊脂糖的α-1，3-糖苷鍵，所得的產(chǎn)物是瓊寡糖（agarooligosaccharides）。β-瓊膠酶（EC3.2.1.81）水解能夠瓊脂糖的β-1，4-糖苷鍵，所得的產(chǎn)物是新瓊寡糖（neo-agarooligosaccharades） [2]。目前，有大量的β-瓊膠酶被發(fā)現(xiàn)和報(bào)道。而α-瓊膠酶只有幾個(gè)。

瓊膠酶的另一種分類方式是根據(jù)糖苷水解酶家族分類。它的分類依據(jù)主要是糖苷水解酶的氨基酸序列相似性，并且結(jié)合了三維結(jié)構(gòu)、底物特異性和催化反應(yīng)機(jī)制的相似性[3]。這種分類方式有利于反應(yīng)糖苷水解酶的進(jìn)化關(guān)系，對新發(fā)現(xiàn)的酶的分類有很好的預(yù)見作用。

根據(jù)上述分類方式，瓊膠酶被劃分在五個(gè)糖苷水解酶家族中。其中，β-瓊膠酶分別被劃分在GH-16、GH-50、GH-86和GH-118家族，而α-瓊膠酶均被劃分在GH-96家族。目前發(fā)現(xiàn)并報(bào)道的α-瓊膠酶均歸屬于GH-96家族。

二、瓊膠酶的來源及性質(zhì)

瓊膠酶的來源于微生物，這些微生物主要分布在海水[4-6]、海泥[7， 8]、海藻[9-11]、海螺[12]，海腸[13]等海洋軟體動(dòng)物體內(nèi)，還有少量來源于淡水[14]、紅樹林沉積物[15]、動(dòng)物和人體糞便[12， 16]等。細(xì)菌的種類廣泛，包括革蘭氏陰性菌，如太平洋火色桿菌[17]，嗜冷單胞菌[8]等。也包括革蘭氏陽性細(xì)菌，如淡紫灰鏈霉菌[18]。

（一）野生β-瓊膠酶的性質(zhì)

目前，隨著1902年第一個(gè)β-瓊膠酶[7]，來自假單胞菌Pseudomonas galatica，被Groleau等發(fā)現(xiàn)并報(bào)道，人們陸陸續(xù)續(xù)發(fā)現(xiàn)了一系列β-瓊膠酶，并進(jìn)行了系統(tǒng)地深入研究。

在發(fā)現(xiàn)的野生β-瓊膠酶中，酶活性的差別很大。自1992年，土壤來源細(xì)菌Acinetobacter sp. AGLSL-1 β-瓊膠酶酶活達(dá)到397 U/ml[19]和1998年海洋來源的Pseudoalteromonas sp. β-瓊膠酶酶活達(dá)到292 U/mL[10]，沒有發(fā)現(xiàn)酶活更高的野生β-瓊膠酶。

瓊膠酶的底物瓊脂糖具有膠凝性，在低于38℃的溫度下，瓊脂糖溶液會開始凝固，所以，大部分的瓊膠酶的最適反應(yīng)溫度高于38℃。比如，來自Stenotrophomonas sp. Nta的嗜堿性瓊膠酶[20]和來自Agarivorans gilvus WH0801的瓊膠酶的最適反應(yīng)溫度為40℃。部分的β-瓊膠酶最適反應(yīng)溫度特殊。來自來自Flammeovirga Sp. OC4.的β-瓊膠酶Aga4436[17]的最適溫度范圍廣泛，30-80℃；來源Bacillus sp. BI-3的耐熱瓊膠酶，最適反應(yīng)溫度高達(dá)70 ℃，在80 ℃是仍然保留最大酶活力的50%[21]；來自Gayadomonas joobiniege G7的瓊膠酶Aga J9[22]的最適反應(yīng)溫度為25℃，在5℃的時(shí)候，仍能保留最大酶活的80%。

根據(jù)已經(jīng)報(bào)道的β-瓊膠酶相關(guān)文獻(xiàn)，大部分的瓊膠酶最適反應(yīng)pH在6.5-7.5之間，pH接近中性。部分β-瓊膠酶的最適反應(yīng)pH比較特殊，來源Gayadomonas joobiniege G7的瓊膠酶Aga J9[22]的最適反應(yīng)pH為5；來源Stenotrophomonas sp. Nta的嗜堿性瓊膠酶最適反應(yīng)pH為10.0[20]；有的β-瓊膠酶的pH耐受范圍較廣，來自Flammeovirga Sp. OC4.的β-瓊膠酶Aga4436[17]最適pH在5-10，來源于Agarivorans sp. LQ48的瓊膠酶AgaA，其最適反應(yīng)pH在3.0-11.0之間[23]。

（二）野生α-瓊膠酶的性質(zhì)

相比較進(jìn)行大量研究報(bào)道的β-瓊膠酶，目前已經(jīng)報(bào)道的α-瓊膠酶僅有3例。1993年，法國人Potin等[4]從交替假單胞菌Altermonas agarlytics GJ1B中分離出第一個(gè)α-瓊膠酶AgaA，SDS-PAGE電泳顯示其分子量為180 kDa，Native-PAGE電泳顯示其分子量約360 kDa，表明該酶存在二聚體現(xiàn)象產(chǎn)物為瓊四糖。2005年，第二個(gè)α-瓊膠酶AgaA33由Ohta等[8]自嗜冷單胞菌Thalassomonas sp. JAMB-A33里分離得到。SDS-PAGE電泳顯示其分子量為85 kDa，但是其理論分子量為180 kDa，存在二聚體現(xiàn)象，降解終產(chǎn)物瓊四糖。第三個(gè)α-瓊膠酶AgaD[24]是于2017年報(bào)道的，分離自海洋細(xì)菌Thalassomonas sp. LD5。SDS-PAGE電泳顯示其分子量為180 kDa，Native-PAGE電泳顯示其分子量約360 kDa，也存在二聚體現(xiàn)象，最終產(chǎn)物為瓊四糖。

（三）瓊膠酶編碼基因克隆及重組酶性質(zhì)

目前，越來越多的瓊膠酶被重組表達(dá)。最早有關(guān)瓊膠酶重組表達(dá)報(bào)道是在1984年，是被表達(dá)在變鉛青鏈霉菌中的[25]。1988年，來自Pseudomonas atlantica的瓊膠酶被表達(dá)在大腸桿菌中。產(chǎn)量最大的重組酶是來海洋細(xì)菌JAMB-A94的β-瓊膠酶[26]。它被表達(dá)在枯草芽孢桿菌中，通過發(fā)酵優(yōu)化，產(chǎn)量達(dá)到81mg/ml。

三、瓊膠酶的應(yīng)用

（一）瓊膠酶在分子生物學(xué)中的應(yīng)用

瓊膠酶在分子生物學(xué)領(lǐng)域，常用來在瓊脂糖凝膠回收過程中水解瓊脂糖凝膠，回收目的核酸分子。1993年，Y Sugano等[27]用瓊膠酶進(jìn)行了膠回收DNA的研究。至今，瓊膠酶在膠回收試驗(yàn)中的應(yīng)用已經(jīng)十分成熟。

（二）瓊膠酶在水產(chǎn)養(yǎng)殖等工業(yè)方面的應(yīng)用

瓊膠酶可以用于獲得海藻單細(xì)胞。在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，單細(xì)胞生物是水生生物育苗期間常用的餌料。紅藻細(xì)胞壁的主要成分是瓊膠，通過瓊膠酶制備海藻原生質(zhì)體[28]。這個(gè)方法簡單高效，有效提高單細(xì)胞生物餌料產(chǎn)量。

瓊膠酶還可以用于生產(chǎn)生物乙醇[29]。由于海洋藻類不像木質(zhì)纖維素那樣難降解，應(yīng)用到生物乙醇的生產(chǎn)過程中，可以有效提高生產(chǎn)效率。

（三）瓊膠酶在制備瓊膠寡糖方面的應(yīng)用

近年來關(guān)于瓊膠寡糖的研究越來越多，為瓊膠寡糖的應(yīng)用提供了越來越多的方向，帶來了新的機(jī)遇。目前，瓊膠酶制備的瓊膠寡糖種類，穩(wěn)定性，酶活越來越好，為瓊膠寡糖的工業(yè)化應(yīng)用打好了基礎(chǔ)。

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