超臨界流體色譜同時(shí)測定運(yùn)動飲料中的8種鄰苯二甲酸酯類增塑劑

韋俊芳,　姜　磊,　樓超艷,　朱　巖

(1. 浙江大學(xué)公共體育與藝術(shù)部, 浙江 杭州 310000; 2. 浙江省紡織測試研究院, 浙江 杭州 310013; 3. 浙江大學(xué)化學(xué)系, 浙江 杭州 310000)

增塑劑是一類可以在一定程度上與聚合物混溶的低揮發(fā)性有機(jī)物,增塑劑通過削弱聚合物分子鏈間的引力使聚合物體系的可塑性和柔韌性增強(qiáng),是食品包裝、兒童玩具、醫(yī)療器械所用聚合物高分子材料中不可或缺的助劑[1,2]。鄰苯二甲酸酯(phthalate esters, PAEs)類化合物,又稱酞酸酯,是目前廣泛使用的一類增塑劑,在塑料制品中的添加量達(dá)20%～50%[3,4]。此類化合物在環(huán)境中難以降解,已成為全球最普遍的環(huán)境污染物之一。研究[4-7]表明,PAE類增塑劑是一類環(huán)境雌激素,具有雌激素的特征,使人體產(chǎn)生抗雄激素效應(yīng),影響激素分泌,進(jìn)而對內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生干擾,臨床上表現(xiàn)為發(fā)育異常及生殖能力下降等,在人體內(nèi)長期積累會導(dǎo)致畸形、癌變和突變。國外研究小組[8]通過動物試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),受PAE類增塑劑污染的小鼠存活率降低,體重減輕,肝腎功能下降,血中正常紅細(xì)胞數(shù)量減少。PAE類增塑劑會導(dǎo)致動物仔胎在發(fā)育過程中出現(xiàn)腭裂、脊柱畸形、心臟變形、眼睛缺陷、指或趾畸形、肢變形等嚴(yán)重后果[8]。日常生活中的很多用品為塑料制品,而PAE類增塑劑與塑料制品之間僅僅靠氫鍵或范德華力結(jié)合,易遷移到外環(huán)境中,再通過飲水、進(jìn)食、皮膚接觸和呼吸等途徑進(jìn)入人體,存在極大的安全隱患[9]。食品是人體攝入增塑劑的一大來源,以運(yùn)動飲料為例,目前絕大多數(shù)市售運(yùn)動飲料瓶的包裝材料都是塑料,包裝材料中的增塑劑與飲料接觸時(shí)很容易通過擴(kuò)散、浸出等方式遷移到飲料中,危害人體健康。因此建立準(zhǔn)確、快速、環(huán)保、靈敏的分析方法對運(yùn)動飲料中PAE類增塑劑的含量監(jiān)測十分必要。

目前文獻(xiàn)中有關(guān)PAE類增塑劑的測定方法主要有高效液相色譜法[10,11]、氣相色譜法[1,12]、超高效液相色譜法[13]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[14,15]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[16,17]等。上述分析方法中,超高效液相色譜檢測技術(shù)尚未普及;氣相色譜法精密度相對較差,實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤差較大,氣相色譜的氣源在燃燒時(shí)也存在潛在的危險(xiǎn)性;液相色譜在分析過程中需要大量有機(jī)溶劑作為流動相,對分析人員和環(huán)境都會造成毒害。超臨界流體色譜(SFC)[18-20]一般以超臨界態(tài)二氧化碳作為流動相,無毒性,在對PAE類化合物進(jìn)行分離時(shí)只需加入少量的改性試劑,通過優(yōu)化色譜分離條件可實(shí)現(xiàn)對這類增塑劑的高效快速分離,對食品中PAE類增塑劑的檢測分析具有重要作用和意義。

本文針對運(yùn)動飲料中的PAE類增塑劑建立了同時(shí)測定鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、鄰苯二甲酸二丙酯(DPRP)、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸二戊酯(DPP)、鄰苯二甲酸丁基芐基酯(BBP)、鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)、鄰苯二甲酸二辛酯(DNOP)共8種PAE類增塑劑的SFC-UV檢測分析方法。該方法快速、高效、選擇性高,適用于實(shí)際檢測工作中各類飲料樣品里多種增塑劑的同時(shí)檢測分析。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1　儀器與試劑

Shimadzu Nexera UC超臨界流體色譜儀,配置紫外檢測器(日本島津公司); SBL-5DTS超聲波恒溫清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司); Millipore simplicity超純水機(jī)(美國Millipore公司)。色譜柱:Ultimate C18 (250 mm×4.6 mm, 5 μm,美國Welch公司); Wonda Cract ODS-2(250 mm×4.6 mm, 5 μm,日本島津公司); Zorbax SB C8(250 mm×4.6 mm, 5 μm,美國Agilent公司)。

甲醇、乙腈均為HPLC級,購自阿拉丁試劑公司;DMP、DEP、DPRP、DBP、DPP、BBP、DEHP和DNOP共8種PAE類增塑劑標(biāo)準(zhǔn)化合物(相關(guān)信息見表1和圖1)購自德國Dr. Ehrenstorfer公司。實(shí)驗(yàn)室用水為18.2 MΩ·cm去離子水(Millipore Simplicity)。實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格清洗容器,避免塑料器皿的使用,以防干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

表 1 　8種鄰苯二甲酸酯(PAE)類增塑劑的CAS號、分子式、相對分子質(zhì)量和純度

圖 1 　8種PAE類增塑劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig. 1 　Chemical structures of the eight PAE plasticizers

1.2　溶液配制

PAE類增塑劑混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制:準(zhǔn)確稱取20.0 mg的各標(biāo)準(zhǔn)化合物,用甲醇溶解,轉(zhuǎn)移至同一100 mL玻璃容量瓶中,用甲醇定容,配制成200 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液,超聲后置于-4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

PAE類增塑劑標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制:用甲醇逐級稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液,配制成混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,置于-4 ℃保存,現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3　樣品前處理

取3份同一品牌同一種類未拆封的運(yùn)動飲料樣品,混合均勻,準(zhǔn)確稱取5.0 g(若實(shí)際運(yùn)動樣品中含有二氧化碳則先除去二氧化碳),轉(zhuǎn)移至潔凈的25 mL具塞磨口玻璃試管中。加入固體氯化鈉至飽和,加入5.0 mL甲醇,振蕩至溶液充分混合均勻,超聲30 min。待樣品溶液完全分散后以5 000 r/min的速度離心10 min,收集上清液(甲醇層),供SFC分析。

1.4　SFC分析條件

色譜柱為Ultimate C18色譜柱;流速為1.6 mL/min;進(jìn)樣量為5.0 μL;柱溫為38 ℃;流動相為超臨界態(tài)二氧化碳(純度≥99.999%)-3%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲醇,等度洗脫;背壓為10 MPa;檢測波長為225 nm。

圖 2 　3種不同色譜柱對8種PAE類增塑劑分離效果的影響Fig. 2 　Effects of the three different columns on the separation efficiencies of the eight PAE plasticizers

2　結(jié)果與討論

2.1　色譜柱的篩選

取3種商品化色譜柱:Ultimate C18、Wonda Cract ODS-2和Zorbax SB C8(尺寸皆為250 mm×4.6 mm, 5 μm)。以超臨界態(tài)二氧化碳-3%甲醇為流動相,在1.6 mL/min的流速下測定3種色譜柱對8種PAE類增塑劑的分離效果。由圖2可知,Ultimate C18色譜柱對8種PAE類增塑劑的分離效果最佳,在6 min內(nèi)可實(shí)現(xiàn)基線分離。Wonda Cract ODS-2和Zorbax SB C8色譜柱對目標(biāo)化合物的選擇性較低,色譜峰數(shù)較少,目標(biāo)化合物在這兩種色譜柱上出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象,Zorbax SB C8色譜柱的拖尾現(xiàn)象尤為嚴(yán)重。綜上所述,選擇Ultimate C18色譜柱進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2　SFC條件優(yōu)化

2.2.1改性劑

圖 3 　使用(a)3種改性劑(甲醇、乙醇和乙腈)及(b)添加不同 體積分?jǐn)?shù)甲醇時(shí)8種PAE類增塑劑的色譜圖Fig. 3 　Chromatograms of the eight PAE plasticizers using (a) three different modifiers (methanol, ethanol and acetonitrile) and (b) methanol with different volume percentages

PAE類增塑劑是弱極性化合物,在SFC中使用的超臨界態(tài)二氧化碳流體是非極性溶劑,對極性化合物的溶解性能和洗脫能力較弱,為增強(qiáng)流動相對PAE類增塑劑的溶解性能和洗脫能力,達(dá)到更好的分離效果,往往需要在超臨界態(tài)二氧化碳流體中加入少量的極性有機(jī)溶劑(改性劑)。不同有機(jī)溶劑的選擇性和洗脫能力各不相同,能有效改變目標(biāo)化合物的峰形和保留時(shí)間,以獲得最佳的分離效果。如圖3所示,本試驗(yàn)考察了3種不同的極性改性劑(甲醇、乙醇和乙腈)對SFC分離PAE類增塑劑的影響分離效果。用乙醇作改性劑時(shí),峰形和分離度較差,而且由于乙醇的黏度相對較高,導(dǎo)致系統(tǒng)壓力升高,長期使用可能會影響色譜柱的使用壽命;用乙腈作改性劑時(shí),出峰不完全,有拖尾,分離效果差;用甲醇作改性劑時(shí),峰形尖窄對稱,分離效果得到很大的提高,能同時(shí)分離8種PAE類增塑劑。因此,最終選擇甲醇作為改性劑來分離8種PAE類增塑劑。

選擇甲醇作為改性劑后,探究了甲醇在流動相中的比例對分離效果的影響。較高的改性劑濃度可以縮短待測組分的分析時(shí)間,但同時(shí)也會降低相鄰組分的分離選擇性。如圖3b所示,改性劑在流動相中的比例對分離的影響十分明顯,隨著甲醇的體積分?jǐn)?shù)從1%升到10%, 8種PAE類增塑劑的保留時(shí)間明顯變短,但當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到8%及以上時(shí),DMP和DEP不能有效分離。當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)為5%時(shí),DMP和DEP的分離度低于1.3,無法達(dá)到定量要求。因此,綜合考慮樣品中目標(biāo)組分的分離效果和定量要求,最終選擇在流動相中添加體積分?jǐn)?shù)為3%的甲醇。

2.2.2溫度、流速和背壓

溫度、流速和背壓是影響SFC分離效果的主要因素。在本試驗(yàn)中,以混合標(biāo)準(zhǔn)溶液為樣品,采用超臨界態(tài)二氧化碳-3%甲醇等度洗脫,在Ultimate C18色譜柱上分別考察了溫度、流速和背壓對分離效果的影響。

一般情況下,在液相色譜中,隨著溫度的升高,目標(biāo)化合物在固定相上的吸附/脫附會加快,從而加速樣品的分離,縮短保留時(shí)間;而在SFC中,由于超臨界態(tài)流動相的密度受溫度影響變化明顯,溫度的升高會使流動相的密度降低,從而減慢目標(biāo)化合物在固定相上的吸附/脫附過程,使保留時(shí)間延長。在本試驗(yàn)中,保持其他條件一致,研究不同溫度(34、36、38、40和42 ℃)下8種PAE類增塑劑的分離效果。如圖4a所示,隨著溫度的升高,8種PAE類增塑劑的保留時(shí)間延長。在34和36 ℃下,峰1和峰2的分離度有待提高。因此選擇38 ℃作為最佳溫度條件。在此溫度下,8種PAE類增塑劑可在6 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)完全分離。

圖 4 　(a)溫度、(b)流速和(c)背壓對8種PAE 類增塑劑分離的影響Fig. 4 　Effects of (a) temperature, (b) flow rates and (c) backpressure on the separation of the eight PAE plasticizers

保持其他條件一致,研究不同流速(1.2、1.4、1.6、1.8和2.0 mL/min)對分離8種PAE類增塑劑的影響,結(jié)果見圖4b。隨著流速的增大,目標(biāo)化合物的保留時(shí)間縮短,但當(dāng)流速超過1.6 mL/min時(shí),DMP和DEP的分離度低于1.3, 8種PAE類增塑劑不能完全分離,不利于進(jìn)行定量分析,因此綜合考慮分離度和分析時(shí)間,選擇1.6 mL/min作為最佳流速。

系統(tǒng)背壓的變化會改變流動相的密度,從而影響對目標(biāo)化合物的洗脫能力和選擇性。背壓升高,超臨界流體的密度增大,對分析物的溶解和洗脫能力增強(qiáng)。保持其他條件一致,研究了不同的系統(tǒng)背壓(10、11、12、13和14 MPa)對PAE類增塑劑分離的影響。圖4c表明,隨著背壓的增大,8種PAE類增塑劑的保留均減弱。雖然背壓的增大可以有效縮短分析時(shí)間,但考慮到背壓太大會使分離度降低(DMP和DEP的分離度低于1.3),最終選擇背壓為10 MPa對8種PAE類增塑劑進(jìn)行分離。在此色譜條件下,8種PAE類增塑劑可以完全分離,峰形對稱。

經(jīng)過以上優(yōu)化,最終選擇Ultimate C18色譜柱作為色譜柱,流動相組成為超臨界態(tài)二氧化碳-3%甲醇,在溫度為38 ℃、流速為1.6 mL/min和背壓為10 MPa的最佳條件下,8種PAE類增塑劑能在6 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)完全分離。

2.3　線性范圍及檢出限

將8種PAE類增塑劑的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用甲醇稀釋成系列標(biāo)準(zhǔn)工作液,在超臨界流體色譜最佳條件下進(jìn)樣分析。8種PAE類增塑劑的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)及檢出限見表2。8種PAE類增塑劑在線性范圍(0.05～25 mg/L)內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)均大于0.999,檢出限為7.5～15 μg/L。

表 2 　8種PAE類增塑劑的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)(r)及檢出限(n=3)

Y: peak area;X: mass concentration, mg/L.

2.4　回收率及精密度

將實(shí)際樣品分成3份,分別添加0.1、0.2和0.4 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照1.3節(jié)樣品前處理方法進(jìn)行處理,按1.4節(jié)的色譜條件進(jìn)行檢測,回收率及精密度數(shù)據(jù)見表3。結(jié)果表明,8種PAE類增塑劑的加標(biāo)回收率為91.7%～100.2%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均不大于6.5%。

表3實(shí)際運(yùn)動飲料樣品中8種PAE類增塑劑的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)

Table 3 Recoveries and RSDs of the eight PAE plasticizers in real sports beverage samples (n=3)

CompoundSpiked level/(mg/L)Recovery/%RSD/%DMP0.193.24.50.295.62.80.496.13.9DEP0.195.33.10.296.84.50.496.13.0DPRP0.191.73.80.293.55.30.495.24.6DBP0.192.44.30.293.83.70.496.25.6DPP0.198.74.80.297.85.90.497.34.2BBP0.198.74.10.2100.26.50.498.85.7DEHP0.196.15.30.299.83.90.495.66.2DNOP0.198.13.90.299.84.50.497.75.2

2.5　樣品分析

抽取8種不同品牌不同種類的運(yùn)動飲料,按1.3節(jié)樣品前處理方法進(jìn)行處理,按1.4節(jié)色譜條件進(jìn)行檢測。其中7種運(yùn)動飲料樣品中均未檢出PAE類增塑劑。樣品3中檢出3種增塑劑,分別為:DEP(0.338 mg/L)、DPRP(0.320 mg/L)和DBP(0.387 mg/L),色譜圖見圖5。

圖 5 　(a)空白樣品、(b)實(shí)際運(yùn)動飲料樣品及(c)實(shí)際加標(biāo) (2 mg/L)運(yùn)動飲料樣品的色譜圖Fig. 5 　Chromatograms of (a) the blank sample, (b) real sports beverage sample and (c) real sports beverage sample spiked with 2 mg/L PAEs

2.6　方法對比

如表4所示,通過本方法和文獻(xiàn)方法的對比發(fā)現(xiàn),本方法不僅具有良好的線性、精密度和穩(wěn)定性,而且可以用于更多種類的PAE類增塑劑的同時(shí)分離分析,分析時(shí)間比其他方法短(只需6 min),在實(shí)驗(yàn)過程中也避免了大量使用有毒有害有機(jī)溶劑,有效減少了對工作人員和環(huán)境的危害。

表 4 　本方法與文獻(xiàn)方法的對比

SFC: supercritical fluid chromatography.

3　結(jié)論

本文采用SFC法同時(shí)檢測運(yùn)動飲料中的DMP、DEP、DPRP、DBP、DPP、BBP、DEHP和DNOP 8種PAE類增塑劑。該方法綠色環(huán)保、簡單快速、靈敏性強(qiáng)、選擇性高、結(jié)果準(zhǔn)確,在6 min內(nèi)即可完成樣品的分析,在實(shí)際樣品的批量檢測中有巨大的優(yōu)勢。