自噬對急性肺損傷小鼠肺泡上皮屏障功能的影響及機制探討

邱玉環(huán)，賀天文，李國平

(1西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院,四川瀘州 646000；2西南醫(yī)科大學)

急性肺損傷(ALI)是一種常見的具有高發(fā)病率和病死率的綜合征。該綜合征主要的病理學特征之一是由于肺泡上皮屏障的破壞和隨之造成的肺泡滲透性增加，使富含蛋白的水腫液進入組織間隙和肺泡腔內(nèi)而導致非心衰性肺水腫[1]。肺泡上皮屏障是由單層肺泡上皮細胞和細胞間的緊密連接蛋白維持的[2]，而細胞緊密連接蛋白Zo-1、Occludin等是負責調(diào)節(jié)上皮細胞滲透性重要的結(jié)構(gòu)蛋白，它們是維持肺泡上皮屏障功能和清除肺內(nèi)液體不可或缺的[3,4]。當它們表達障礙或減少時，可破壞肺泡上皮屏障的功能從而導致肺泡滲透性增加，影響氣血交換[5]。自噬是細胞生物學中高度保守的過程，影響著人類幾乎所有類型的細胞固有免疫和適應性免疫的許多方面[6,7]，并且可通過調(diào)節(jié)各固有免疫各信號通路之間的聯(lián)系來控制炎癥反應[8]。研究[9,10]發(fā)現(xiàn)，自噬在許多疾病(包括ALI)的發(fā)病機制中具有極強的細胞和病原體依賴性。在自噬形成過程中，LC3Ⅱ/Ⅰ的大小可用來評估自噬水平的高低。目前，有關(guān)自噬在ALI微血管內(nèi)皮細胞損傷中作用的研究較多且深入，但是作為同樣十分重要的肺泡上皮細胞，有關(guān)自噬在ALI肺泡上皮屏障的作用及機制的研究較少。因此，探索自噬在ALI肺泡上皮屏障破壞過程中的作用對于尋找ALI新型藥物治療有重要作用。2017年3～12月，本實驗采用氣道滴注脂多糖(LPS)構(gòu)建ALI模型，并分別用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)和自噬促進劑雷帕霉素(RAPA)對模型小鼠進行干預，通過評價自噬對肺泡上皮緊密連接蛋白Occludin和Zo-1表達的影響，探討自噬在ALI發(fā)生中的可能機制，為防治ALI提供新的靶點和思路。

1　材料與方法

1.1實驗材料4～6周健康SPF級雄性BALB/c小鼠40只，體質(zhì)量20～24 g，購于重慶騰鑫比爾動物實驗中心，飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學實驗動物中心。細菌LPS(E.eoli055:B5)購自美國Sigma公司，3-MA及RAPA購自美國MedChemExpress公司；BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司，總RNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；兔多克隆β-actin抗體、大鼠單克隆Zo-1抗體、小鼠單克隆Occludin抗體、小鼠單克隆LC3抗體、小鼠抗兔IgG-HRP、兔抗小鼠IgG-HRP、山羊抗大鼠IgG-HRP均購自美國Santa Cruz公司。

1.2動物分組、ALI模型建立及給藥將40只小鼠按隨機數(shù)字表法分為C組、LPS組、RAPA+LPS組、3-MA+LPS組，每組各10只。LPS組、RAPA+LPS組及3-MA+LPS組氣管滴入LPS(5 mg/kg)制備小鼠ALI模型，C組滴入等量生理鹽水。在氣管滴入LPS前1 h，3-MA+LPS組和RAPA+LPS組分別腹腔預注射3-MA(10 mg/kg)和RAPA(5 mg/kg)，C組、LPS組腹腔預注射等量生理鹽水。小鼠飼養(yǎng)在SPF動物中心。

1.3標本采集以氣管內(nèi)注射LPS為時間起點，在注射18 h后處死小鼠，采集標本。①支氣管肺泡灌洗液(BALF)的收集。每組隨機抽取5只，用過量的戊巴比妥鈉處死并固定在操作臺上；沿頸部正中線剪開頸部皮膚，鈍性分離皮下組織；暴露并游離氣管，用絲線在環(huán)狀軟骨下結(jié)扎頭側(cè)氣管。采用1 mL注射器抽取0.5 mL預冷的PBS，沿向心方向穿入氣管注入左肺肺腔，輕輕按摩肺臟后再緩慢回抽，重復操作3次。液體回收率90%左右，用EP管收集BALF，4 ℃下以1 500 r/min離心10 min;收集上清液，保存于-80 ℃冰箱備用。②肺組織標本的采集。收集小鼠BALF后，沿胸腹正中線剪開皮膚。從胸部正中剪開胸腔，充分暴露心肺并離斷腹主動脈，5 mL注射器插入右心室沖洗肺循環(huán)血管內(nèi)血液，至肺組織泛白，游離雙肺，左肺置于甲醛中固定用作石蠟切片及HE染色。每組剩余5只用于測定肺組織干濕重比(W/D)，用過量的戊巴比妥鈉處死并固定在操作臺上；從胸部正中剪開胸腔，充分暴露心肺，取新鮮左肺用于測定肺組織W/D。余肺置于無菌無酶的EP管中，立即放入液氮快速冷凍后，再轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱備用。

1.4肺組織病理學觀察將肺組織標本送于西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院病理科，行HE染色，并在光鏡下觀察各組小鼠肺組織病理學變化。

1.5肺組織W/D測定取出小鼠左肺葉，吸干肺組織表面水分后立即稱重，置于80 ℃恒溫箱中烘烤48 h至恒重后再次測量其重量。計算各組小鼠肺組織W/D，評價各組小鼠肺水腫程度。

1.6BALF中總蛋白水平測定采用碧云天BCA蛋白濃度測定試劑盒測定各組小鼠BALF中總蛋白水平，步驟嚴格按照說明書進行。

1.7肺組織中Zo-1、Occludin mRNA檢測采用RT-PCR法。使用總RNA提取試劑盒，按步驟提取肺組織RNA。將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進行相應的基因擴增。擴增反應條件:95 ℃預變性10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，45個循環(huán)。末次循環(huán)后進行溶解曲線分析。本實驗的引物由上海捷瑞生物工程公司合成，所用引物信息如下：Zo-1(161 bp)的上游序列為5′-TTAGAGCAAAAGACCAACCGT-3′，下游序列為5′-AGACAATAGCATTCTCCCACC-3′；Occludin(226 bp)的上游序列為5′- CTGTCATAATCTCCCACCATC-3′，下游序列為5′-AGAGCTTACAGGCAGAACTAG-3′。以GAPDH作內(nèi)參基因，其上游序列為5′-TGTCGTGGAGTCTACTGGTGTGTT-3′，下游序列為5′-TTCTCGTGGTTCACACCCATCACA-3′。獲取各基因的Ct值，以公式2-ΔΔCt計算目的基因相對表達量。

1.8肺組織Zo-1、Occludin、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白檢測 采用Western blotting法。取適量肺組織置于研磨缽中研磨，并不斷加液氮研磨至粉末狀;加入適量蛋白裂解液，冰上裂解30 min;4 ℃下以12 000 r/min離心15 min，將上清轉(zhuǎn)移至新的EP管中；加入5×SDS上樣緩沖液，100 ℃煮沸10 min。用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定各組肺組織蛋白濃度。取45 μg蛋白上樣，SDS-PAGE凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別加入β-actin、LC3、Occludin以及Zo-1一抗，4 ℃孵育過夜；TBST洗膜3次，每次5 min；加入相應的二抗，4 ℃孵育2 h；再用TBST洗膜3次，每次5 min；最后采用美國Bio-Rad公司的ChemiDoc Touch成像系統(tǒng)曝光成像。應用Image Lab軟件對目的條帶相對灰度值進行分析，以β-actin為內(nèi)參計算Zo-1、Occludin及LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白相對表達量。

2　結(jié)果

2.1各組小鼠肺組織病理學變化LPS組及3-MA+LPS組均出現(xiàn)嚴重的肺部結(jié)構(gòu)破壞，肺泡腔及肺間質(zhì)內(nèi)大量炎癥細胞浸潤、部分肺泡腔可見大量紅細胞或粉紅色水腫液，而3-MA+LPS組以上病理表現(xiàn)較LPS組更為嚴重，RAPA+LPS組則較兩組病理變化明顯減輕。

2.2各組小鼠肺組織W/D比較C組、LPS組、3-MA+LPS組、RAPA+LPS組小鼠肺組織W/D分別為4.976±0.113、6.060±0.096、6.682±0.106、5.042±0.087，LPS組、3-MA+LPS組與C組相比，3-MA+LPS組、RAPA+LPS組與LPS組相比，P均<0.01。

2.3各組小鼠BALF中總蛋白水平比較C組、LPS組、3-MA+LPS組、RAPA+LPS組小鼠BALF中總蛋白水平分別為(0.150±0.015)、(0.423±0.018)、(0.607±0.033)、(0.175±0.006)mg/mL，LPS組、3-MA+LPS組與C組相比，3-MA+LPS組、RAPA+LPS組與LPS組相比，P均<0.01。

2.4各組小鼠肺組織中Zo-1、Occludin mRNA表達比較 見表1。

表1　　　　各組小鼠肺組織中Zo-1、Occludin mRNA表達比較

注：與C組相比，*P<0.05；與LPS組相比，#P<0.05。

2.5 各組小鼠肺組織中Zo-1、Occludin、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達比較見表2。

表2　　　　各組小鼠肺組織中Zo-1、Occludin、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達比較

注：與C組相比，*P<0.05；與LPS組相比，#P<0.05。

3　 討論

肺上皮細胞被認為是肺泡原發(fā)性宿主防御，它可形成一個堅固的防御屏障來抵御感染和非感染性刺激[11]。ALI是一種嚴重的臨床疾病，LPS是常見的建立ALI模型的方法[12]。肺泡上皮屏障功能降低在LPS誘導ALI的發(fā)生發(fā)展過程起決定性作用。因此，本研究通過氣管滴注LPS誘導小鼠ALI模型來研究ALI時肺泡上皮屏障功能改變的發(fā)病機制。本研究結(jié)果顯示，LPS組肺部結(jié)構(gòu)破壞，肺泡腔及肺間質(zhì)內(nèi)大量炎癥細胞浸潤、部分肺泡腔可見大量紅細胞或粉紅色水腫液；肺組織W/D和BALF中總蛋白水平明顯增加，Zo-1、Occludin mRNA和蛋白表達降低。這表明LPS可通過減少Zo-1、Occludin的表達進而導致小鼠肺泡上皮屏障遭到破壞，造成其滲透性增高，使富含蛋白的水腫液進入組織間隙和肺泡腔內(nèi)而導致非心衰性肺水腫。

自噬是一種保護機制。LPS可引起肺組織中某些細胞發(fā)生自噬[13]。而被激活的自噬可以快速地清除已被損傷的細胞器，特別是損傷的線粒體，從而限制細胞死亡和損傷[14]。另有研究報道，一些LPS或內(nèi)毒素誘導的器官損傷部分原因是由于能量供給不足[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS組自噬標志蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ表達增加，表明LPS可誘導ALI時細胞自噬水平增加，與上述文獻報道一致。因此，探討自噬對ALI小鼠肺泡上皮屏障的調(diào)節(jié)機制有助于探尋改善ALI時肺泡上皮屏障功能的方法。

本研究發(fā)現(xiàn)，與LPS組相比，3-MA+LPS組肺部病理表現(xiàn)較LPS組更為嚴重且肺組織W/D、BALF中總蛋白水平高，RAPA+LPS組肺組織病理變化明顯減輕且肺組織W/D、BALF中總蛋白水平低，顯示抑制自噬會加重小鼠肺水腫情況，而促進自噬后小鼠肺水腫情況得到明顯改善。RT-PCR和Western blotting結(jié)果顯示，與LPS組相比，3-MA+LPS組肺組織Zo-1、Occludin表達低，RAPA+LPS組表達高，表明促進自噬后會減少緊密連接蛋白的破壞而降低肺泡上皮屏障通透性，改善肺泡上皮屏障功能，使小鼠肺水腫減輕，緩解ALI，而抑制自噬則對肺泡上皮屏障破壞更嚴重，從而加重ALI。且Western blotting結(jié)果顯示，與LPS組相比，3-MA+LPS組肺組織LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達低，RAPA+LPS組表達高。我們推測RAPA通過激活自噬，在一定程度可以上調(diào)Zo-1和Occludin的表達來改善肺泡上皮屏障功能，從而發(fā)揮對ALI的保護作用。未來的研究應該旨在明確自噬在調(diào)節(jié)LPS誘導的ALI的確切機制，同時需要更深入的研究來確定自噬在調(diào)節(jié)肺泡上皮屏障Zo-1及Occludin表達和分布的分子機制。