miR-155在3-oxo-C12-HSL阻礙人單核細(xì)胞源性樹突狀細(xì)胞成熟過程中的表達(dá)變化

李沫，吳行貴，李啟偉，李有強(qiáng)

(1廣東省中醫(yī)院，廣州 510006；2廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院)

銅綠假單胞菌(PA)是醫(yī)院內(nèi)常見的引起嚴(yán)重獲得性感染的條件致病菌之一[1]，可通過調(diào)節(jié)人體免疫細(xì)胞功能實(shí)現(xiàn)免疫逃逸從而引起機(jī)體致病。N-3-氧代十二烷酰-L-同型絲氨酸內(nèi)酯(3-oxo-C12-HSL)是PA分泌的一種重要的信號(hào)分子。本課題組前期發(fā)現(xiàn)3-oxo-C12-HSL可阻礙單核細(xì)胞源性樹突狀細(xì)胞(Mo-DCs)成熟,從而介導(dǎo)免疫逃逸[2],但具體機(jī)制尚未完全明確。微小核糖核酸(miRNA)可調(diào)控免疫細(xì)胞的分化及免疫功能。近年來有研究[3～5]發(fā)現(xiàn)，miR-155的表達(dá)與樹突狀細(xì)胞(DCs)的成熟與功能密切相關(guān)?；趍iR-155轉(zhuǎn)錄后調(diào)控功能，我們推測miR-155可能與3-oxo-C12-HSL阻礙Mo-DCs的成熟相關(guān)。2017年4～11月，本研究通過檢測與DCs成熟狀態(tài)相關(guān)的CD80、CD40、CD11c、HLA-DR及IL-10、IL-12水平，觀察miR-155在3-oxo-C12-HSL阻礙Mo-DCs成熟過程中的表達(dá)變化，并探討3-oxo-C12-HSL阻礙Mo-DCs成熟的機(jī)制。

1　材料與方法

1.1主要試劑PRIM1640、胎牛血清購于Gibco公司，人淋巴細(xì)胞分離液購于天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰?；重組人白介素4(rhIL-4)及人粒-單核細(xì)胞集落刺激因子(hGM-CSF)購于Peprotech公司，CCK-8試劑盒購于南京恩晶生物科技有限公司，3-oxo-C12-HSL購自Sigma公司，IL-12、IL-10及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒購于達(dá)科為科技有限公司;熒光標(biāo)記APC-CD11c、FITC-CD80和PE-CD40購于eBioscience公司，PEcy5-HLA- DR、FITC-CD14、抗人CD14+免疫磁珠和磁架購于BD公司；小RNA抽提試劑盒購自美國Qiagen公司，RNA抽提試劑TRIzol和逆轉(zhuǎn)錄試劑Superscript Ⅲ購自美國Invitrogen公司，PCR試劑盒和DNA DL2000 Marker購自大連寶生物(TaKaRa)公司,引物由上海生工合成。

1.2方法

1.2.1人Mo-DCs的誘導(dǎo)和培養(yǎng)取廣州市血液中心分離的健康志愿獻(xiàn)血者血液中的白膜(富含單核細(xì)胞)4～10 mL，淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法分選出單個(gè)核細(xì)胞。PBS洗滌后加入抗人CD14+免疫磁珠，室溫孵育30 min，上磁架8 min，分選出經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定后純度大于95%的CD14+單核細(xì)胞。加入含10%胎牛血清PRIM1640完全培養(yǎng)基、終濃度500 U/mL的hGM-CSF、500 U/mL的rhIL-4培養(yǎng)。第3天半量換液，誘導(dǎo)培養(yǎng)6 d后收獲不成熟Mo-DCs。

1.2.2Mo-DCs的分組及處理將不成熟Mo-DCs制成細(xì)胞懸液接種于96孔板中，1×104/孔，懸液體積為200 μL。將其分為4組：陰性對(duì)照組、模型組、實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2。模型組加入終濃度為1 μg/mL的LPS，陰性對(duì)照組加入同體積PBS作為平衡。實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2分別加入終濃度為1 μg/mL的LPS后分別加入終濃度為50 μmol/L和100 μmol/L的3-oxo-C12-HSL。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.2.3Mo-DCs表型檢測48 h后收集各組Mo-DCs，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL;分別加入Anti-CD80-FITC、Anti-CD40-PE、Anti-CD11c-APC、Anti-HLA-DR-PEcy5，4 ℃避光孵育30 min；PBS洗滌，流式細(xì)胞儀檢測，記錄CD80、CD40、CD11c、HLA-DR平均熒光強(qiáng)度。

1.2.4各組Mo-DCs培養(yǎng)上清液IL-10、IL-12水平檢測48 h后收集各組Mo-DCs培養(yǎng)的上清液，按照ELISA試劑盒說明，測定上清液IL-10和IL-12水平。每孔重復(fù)3次，取3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值。

1.2.5Mo-DCs中miR-155檢測采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。分組處理48 h后收集Mo-DCs，按QIAGEN公司小RNA抽提試劑盒說明書要求，提取各組細(xì)胞中小RNA。瓊脂凝膠電泳法鑒定純度，紫外分光光度法鑒定濃度。鑒定RNA后上Applied Biosystems?Veriti PCR儀進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄循環(huán)參數(shù)：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，終止溫度4 ℃。取RT產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，qPCR循環(huán)參數(shù)：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s變性，60 ℃ 60 s退火，40個(gè)循環(huán)。miR-155引物序列：正向?yàn)?′-AGTGCGTGTCGTGGAGTC-3′，反向?yàn)?′-GGGGTTAATGCTAATTGTGA-3′。U6引物序列：正向?yàn)?′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向?yàn)?′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。以U6作為內(nèi)參，所有qPCR在Light Cycler?480(Roche Diagnostics)中進(jìn)行反應(yīng)，采用其自帶軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。在指數(shù)期內(nèi)得到樣品PCR循環(huán)反應(yīng)的閾值(Ct)，每個(gè)樣品均有3個(gè)復(fù)孔。以2-ΔΔCt計(jì)算miR-155相對(duì)表達(dá)量。

2　結(jié)果

2.1各組Mo-DCs表型檢測結(jié)果比較見表1。

2.2各組Mo-DCs培養(yǎng)上清IL-10、IL-12水平比較見表2。

表1　各組Mo-DCs表型檢測結(jié)果比較

注：與陰性對(duì)照組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05；與實(shí)驗(yàn)組1相比，cP<0.05。

表2　　　　各組Mo-DCs培養(yǎng)上清液IL-10、IL-12水平比較

注：與陰性對(duì)照組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05；與實(shí)驗(yàn)組1相比，cP<0.05。

2.3各組Mo-DCs中miR-155的表達(dá) 陰性對(duì)照組、模型組、實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2 miR-155相對(duì)表達(dá)量分別為0.93±0.41、2.14±0.63、1.29±0.51、1.06±0.48，模型組與陰性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組1與實(shí)驗(yàn)組2相比，P均<0.05。

3　討論

PA是醫(yī)院內(nèi)常見的引起嚴(yán)重獲得性感染的條件致病菌之一，目前臨床以抗生素治療為主[6,7]。但近年來PA對(duì)抗生素高度耐藥的現(xiàn)象日益嚴(yán)重，并表現(xiàn)出多重耐藥，如對(duì)亞胺培南、頭孢他啶、哌拉西林和環(huán)丙沙星等均具有耐藥性[8]。在PA感染嚴(yán)重威脅患者健康的嚴(yán)峻形勢下，深入研究PA感染形成的內(nèi)在機(jī)制對(duì)PA感染的預(yù)防和非抗生素治療有重要意義。

DCs是機(jī)體免疫系統(tǒng)中功能最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞[9]。DCs的功能與其成熟狀態(tài)密切相關(guān)：成熟DCs傾向于激發(fā)免疫應(yīng)答，而未成熟DCs傾向于誘導(dǎo)免疫耐受[10]。在免疫穩(wěn)定狀態(tài)下，絕大多數(shù)DCs處于非成熟狀態(tài)，主要功能為識(shí)別和攝取抗原。與其功能相適應(yīng)，未成熟的DCs表面表達(dá)低水平的主要組織相容性復(fù)合體MHC分子Ⅱ類分子(HLA-DR)、協(xié)同刺激分子B7(CD80、CD86)和黏附分子(CD40)等，并能分泌免疫抑制因子IL-10等。未成熟的DCs在攝取抗原或接受某些刺激因素如LPS后可以分化成熟。成熟DCs表面表達(dá)大量的HLA-DR、CD80、CD40等分子，并分泌IL-12等具有免疫激活作用的細(xì)胞因子[11]，這是DCs將抗原呈遞給T淋巴細(xì)胞并激活免疫應(yīng)答的基礎(chǔ)。因此，本研究選擇與DCs抗原遞呈功能密切相關(guān)的DCs表面標(biāo)志物HLA-DR、CD80、CD40，以及與DCs成熟狀態(tài)相關(guān)的細(xì)胞因子IL-10、IL-12作為判斷DCs成熟狀態(tài)的判定指標(biāo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與陰性對(duì)照組相比，模型組CD80、CD40、HLA-DR表達(dá)高，IL-10水平低，IL-12水平高，表明LPS可刺激人Mo-DCs的分化成熟。模型組CD11c與陰性對(duì)照組相比無明顯變化，因CD11c為髓源性DCs的標(biāo)志，本實(shí)驗(yàn)選用的是Mo-DCs，故本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ陀行Э煽俊?/p>

在病理?xiàng)l件下如各種感染，病原菌通過抑制DCs表面的信號(hào)分子和細(xì)胞因子表達(dá)水平阻礙DCs成熟，使DCs逐漸成為具有免疫抑制功能的半成熟或未成熟DCs[12]，抑制免疫反應(yīng)或誘導(dǎo)免疫耐受。3-oxo-C12-HSL是PA分泌的一種重要信號(hào)分子[13]，可作用于樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞，調(diào)節(jié)PA的耐藥、毒力因子的表達(dá)和宿主免疫功能[2,14,15]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2較模型組CD80、CD40、HLA-DR表達(dá)低，IL-10水平高，IL-12水平低。表明3-oxo-C12-HSL可通過阻礙LPS誘導(dǎo)的Mo-DCs成熟而促進(jìn)耐受性免疫應(yīng)答的形成，參與免疫逃逸。

Mo-DCs的成熟狀態(tài)和功能與眾多基因的表達(dá)水平密切相關(guān)，而miRNA可通過轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，在Mo-DCs的功能成熟過程中發(fā)揮重要的作用。miR-155是近年來已發(fā)現(xiàn)的與機(jī)體免疫調(diào)控密切相關(guān)的經(jīng)典miRNA,有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)miR-155與Mo-DCs的成熟和功能相關(guān)：在不同TLR配體、TNF-α和IFN-α刺激的小鼠與人的多種DCs亞群分化成熟過程中，可觀察到其miR-155表達(dá)升高[16]。miR-155通過下調(diào)DCs特異性黏附分子結(jié)合非整合素因子表達(dá)，從而調(diào)節(jié)DCs的成熟及抗原攝取能力，從而影響機(jī)體的免疫應(yīng)答[17]?；趍iR-155調(diào)控基因表達(dá)水平的功能和與Mo-DCs的成熟狀態(tài)的相關(guān)性，我們推測miR-155可能與3-oxo-C12-HSL阻礙Mo-DCs的成熟相關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組較陰性對(duì)照組miR-155表達(dá)上調(diào)，表明miR-155可能通過調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)促進(jìn)Mo-DCs的成熟，這與之前的一些研究[16,17]相符。實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2較模型組miR-155表達(dá)降低，表明3-O-C12-HSL可能通過降低miR-155表達(dá)阻礙Mo-DCs成熟，這與我們的推測一致。目前發(fā)現(xiàn)的miR-155與DCs成熟相關(guān)的信號(hào)機(jī)制主要有以下幾種。①PU.1:Martinez-Nunez等[17]發(fā)現(xiàn),在人外周血DCs的成熟過程中miR-155表達(dá)上調(diào)，它直接抑制PU.1，影響DCs與真菌及HIV-gp120的結(jié)合能力。②SOCS-1:Lu等[3]發(fā)現(xiàn)，小鼠miR-155通過抑制SOCS-1，引起成熟DCs中IL-12p70的減少。③TAB-2：Ceppi等[18]用LPS刺激人Mo-DCs后發(fā)現(xiàn)miR-155表達(dá)上調(diào)，它作用于TAB-2，抑制TLR/IL-1炎性信號(hào)通路的活性。但是，3-oxo-C12-HSL具體通過何種機(jī)制降低miR-155表達(dá)從而阻礙Mo-DCs成熟，仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。