中國北方高發(fā)區(qū)人群ABCB1基因多態(tài)性與食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系

孫立坤，徐昌青

(1山東大學(xué)第二醫(yī)院，濟(jì)南250033；2 山東省千佛山醫(yī)院)

目前，食管癌大體分為食管鱗狀細(xì)胞癌(簡稱鱗癌)和食管腺癌2種類型。從伊朗北部到中亞再到中國北方發(fā)病率均較高，被稱作“食管癌帶”，90%都是食管鱗癌。食管鱗癌發(fā)病與吸煙、飲酒、肥胖和飲食習(xí)慣有關(guān)，但是這些因素可能是小部分原因，基因突變可能是導(dǎo)致食管癌的最主要原因。ABCB1基因也叫多耐藥基因(MDR1)，位于染色體7q21，由28個(gè)外顯子組成。在不同的人群中ABCB1基因有超過50種單核苷酸多態(tài)性和3種插入或缺失突變[1]。在這些突變中，位于26外顯子的C3435T(rs1045642)是研究最多的與P-糖蛋白(P-gp)表達(dá)相關(guān)的突變之一。許多研究[2～5]表明，ABCB1 rs1045642基因多態(tài)會(huì)增加許多疾病如胃癌、急性白血病、乳腺癌、結(jié)腸癌、腎癌、帕金森病等的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。本研究觀察了中國北方高發(fā)區(qū)(安陽)人群ABCB1 rs1045642、rs3789243、rs4148737基因多態(tài)性與食管鱗癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1　資料與方法

1.1臨床資料選擇安陽腫瘤醫(yī)院2004年2月～2005年7月未接受化療、放療的食管鱗癌患者，生存時(shí)間≥3個(gè)月，共175例(觀察組)。其中男101例、女74例，年齡(60.10±8.06)歲。手術(shù)或胃鏡取得所有患者食管癌組織，并經(jīng)病理學(xué)檢查確診。同時(shí)隨機(jī)篩選安陽地區(qū)175例健康志愿者作為對(duì)照組，其中男101例、女74例，年齡(60.11±8.04)歲。觀察組和對(duì)照組根據(jù)年齡和性別1∶ 1配對(duì)。觀察組吸煙78例、飲酒48例、有食管癌家族史58例，對(duì)照組分別為73、37、36例，兩組吸煙例數(shù)相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩組飲酒、有食管癌家族史例數(shù)相比P均<0.05。

1.2ABCB1基因多態(tài)性觀察采用限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-RFLP)技術(shù)檢測ABCB1基因多態(tài)性。采集兩組研究對(duì)象外周血5 mL，采用DNA提取試劑盒提取基因組DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｒ酝庵苎蚪MDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)ABCB1基因序列采用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物并用Oligo 5.0軟件檢測。反應(yīng)體系:引物(10 μmol/L)0.5 μL、dNTP(2.5 mmol/L)0.5 μL、1 U Taq DNA聚合酶、2.5 μL 10×緩沖液(包括2 mmol/L Mg2+)、1.5 μL基因組DNA，然后加蒸餾水至25 μL。①ABCB1 rs1045642多態(tài)位點(diǎn)。引物F為5′-GCCCATCCTGTTTGACTG-3′，R為5′-TTGAAGAGAGACTTACATTAGGCA-3′。PCR擴(kuò)增條件：變性94 ℃ 7 min,退火94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s,共35個(gè)循環(huán)；最終延伸72 ℃ 7 min。擴(kuò)增后5 μL的產(chǎn)物加1 U Mbol限制性內(nèi)切酶37 ℃ 12 h，酶切片段用3%瓊脂糖凝膠電泳，然后在紫外線下觀察每個(gè)個(gè)體的基因型。若rs1045642位點(diǎn)是胞嘧啶，Mbol內(nèi)切酶會(huì)把DNA鏈切成2個(gè)片段，72 bp和77 bp，如果是胸腺嘧啶，內(nèi)切酶則不會(huì)把149 bp切開。②ABCB1 rs3789243多態(tài)位點(diǎn)。引物F為5′-TGGCATTTGATTGCTTCTACTTCA-3′，R為5′-TCACCCAGACAATAAGCCCAAG-3′。PCR擴(kuò)增條件與rs1045642相同。擴(kuò)增后取5 μL的產(chǎn)物，加1 U BsaHⅠ限制性內(nèi)切酶37 ℃ 12 h。若rs3789243位點(diǎn)是胞嘧啶，2個(gè)片段分別為115 bp和73 bp，如果是胸腺嘧啶，內(nèi)切酶則不會(huì)把188 bp切開。③ABCB1 rs4148737多態(tài)位點(diǎn)。引物F為5′-GCCTGGGCTGAGTGAATGAC-3′，R為5′-TTTCTGTTCGGATTCCCTCTTG-3′。PCR擴(kuò)增條件除了退火溫度是62 ℃，其余與rs1045642相同。內(nèi)切酶是BanⅠ，若是鳥嘌呤，內(nèi)切酶會(huì)把DNA鏈切成2個(gè)片段，154 bp和65 bp，如果是腺嘌呤，內(nèi)切酶則不會(huì)把219 bp切開。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。采用χ2檢驗(yàn)分析3個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的基因型分布Hardy-Weinberg平衡；采用條件logistic回歸比較兩組吸煙、飲酒、有食管癌家族史和基因型分布情況；采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析年齡分布；采用Phase V2.1構(gòu)建3個(gè)基因多態(tài)的8個(gè)單倍型；采用條件logistic回歸模型分析ABCB1基因型和單倍型與食管鱗癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

兩組每個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡方程(P均>0.05)。

2.1兩組ABCB1基因型分布比較見表1。

表1　兩組ABCB1基因型分布比較(例)

注：a采用條件單變量logistic回歸分析。

2.2ABCB1基因型與食管癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系將飲酒、食管癌家族史和rs1045642多態(tài)加入到條件多變量logistic回歸分析，通過逐步回歸法(Forward:LR)選擇絕對(duì)危險(xiǎn)因素。發(fā)現(xiàn)飲酒和食管癌家族史均是食管癌的危險(xiǎn)因素，然而rs1045642多態(tài)與食管癌沒有明顯相關(guān)性。見表2。

2.3ABCB1基因單倍型與食管癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系觀察組攜帶rs1045642 C-rs3789243 T-rs4148737

表2　　　　ABCB1中rs1045642基因型、飲酒、食管癌家族史與食管癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系(例)

注：a采用條件多變量logistic回歸分析。

A單倍型例數(shù)少于對(duì)照組(P=0.018,OR=1.774,95%CI:1.104～2.850)，剩下的7個(gè)單倍型與食管癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)沒有明顯相關(guān)性。見表3。

表3　ABCB1基因單倍型與食管癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系(例)

注：a采用條件單變量logistic回歸分析；-/-表示任何一種其他單倍體；-/CCA表示CCA與其他任何單倍體之一的組合；其他同此。

3　討論

已有報(bào)道表明，許多基因的單核苷酸多態(tài)性可能導(dǎo)致或預(yù)防癌癥的發(fā)生，在這些基因中，ABCB1/MDR1基因在腫瘤的進(jìn)展中起重要作用。本研究對(duì)中國人食管癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)和rs1045642、rs3789243、rs4148737多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析。食管癌的發(fā)生是個(gè)復(fù)雜的過程，是環(huán)境和基因相互作用的結(jié)果，最常見的環(huán)境因素是吸煙和飲酒。本研究觀察組飲酒者高于對(duì)照組，飲酒者似乎更易患食管癌，但吸煙與食管癌的發(fā)生沒有明顯相關(guān)性，食管癌家族史也對(duì)食管癌發(fā)生有影響。

ABCB1基因?qū)儆贏TP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族，編碼位于胞膜上的P-gp，它是具有廣泛底物特異性的ATP依賴的藥物外流泵。人類P-gp是一種磷酸化和糖基化的跨膜蛋白，由1 280個(gè)氨基酸組成，包括2個(gè)同源對(duì)稱序列，每個(gè)又包括6個(gè)跨膜區(qū)和1個(gè)ATP結(jié)合基序；它把底物從胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到胞外，并可能與捕獲的藥物分子在細(xì)胞膜的磷脂雙分子層相互作用。ATP水解為底物轉(zhuǎn)運(yùn)提供能量，使轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能夠?qū)節(jié)舛忍荻?。P-gp起初是因?yàn)榘┘?xì)胞對(duì)抗癌藥物產(chǎn)生耐藥性而被發(fā)現(xiàn)的，在許多正常上皮組織如肝微管膜、腎近端小管、胃腸黏膜、甲狀旁腺上皮細(xì)胞和胎盤、卵巢、睪丸等血組織屏障均有表達(dá)[6,7]，也在腎上腺、造血干細(xì)胞、NK細(xì)胞、抗原遞呈樹突狀細(xì)胞和T、B淋巴細(xì)胞中表達(dá)。P-gp在這些組織中頂或腔的表達(dá)使外源性物質(zhì)毒性下降，減少代謝物、藥物從胃腸道的吸收，增加藥物通過膽管、尿液的排出并阻止某些藥物進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)[8]。P-gp在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡和免疫應(yīng)答方面起重要作用[9]。淋巴細(xì)胞在腫瘤發(fā)生的免疫應(yīng)答中起重要作用，可能是通過P-gp介導(dǎo)細(xì)胞因子釋放所致，包括分泌IL-2、IL-4和γ-干擾素[10]。

自從ABCB1基因被發(fā)現(xiàn)后，大量的病例對(duì)照研究報(bào)道了ABCB1 rs1045642與癌癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系，但結(jié)論并不一致[2～4]。ABCB1 rs1045642多態(tài)并不改變P-gp的氨基酸序列，但會(huì)對(duì)P-gp表達(dá)和功能產(chǎn)生影響。T等位基因會(huì)使癌細(xì)胞P-gp的表達(dá)或活性減弱，CC基因型比其他基因型更易使藥物外流，因而免于細(xì)胞毒性。研究[11]顯示，rs1045642 T等位基因的保護(hù)作用可能與P-gp的功能有關(guān)，可影響c-Myc、cyclin D1的功能并解除抑制細(xì)胞凋亡途徑。rs1045642 TT基因型伴有P-gp低表達(dá)，對(duì)毒素外流作用減弱，導(dǎo)致突變劑或毒素在細(xì)胞內(nèi)濃度升高，DNA損傷、突變?cè)黾幼罱K導(dǎo)致疾病進(jìn)展。Jamroziak等[12]發(fā)現(xiàn)，rs1045642 T等位基因增加兒童急性淋巴細(xì)胞白血病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，可能是因?yàn)榛蚨鄳B(tài)性使ABCB1基因表達(dá)發(fā)生量變所致。Taheri等[4]發(fā)現(xiàn)，TT基因型乳腺癌患者ABCB1表達(dá)明顯低于CC和CT基因型，T等位基因攜帶者發(fā)生乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)增加1.5倍。Oliveira等[13]發(fā)現(xiàn)，rs1045642多態(tài)與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)和進(jìn)展沒有相關(guān)性。另有文獻(xiàn)報(bào)道，在伊朗人群中TT基因型與胃癌的發(fā)生有明顯相關(guān)性[3]。在結(jié)直腸癌患者中T等位基因攜帶者更多，TT基因型是結(jié)腸癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素[14]。

上述結(jié)果可能是由于ABCB1表達(dá)多樣化和組織特異性所致。實(shí)驗(yàn)中P-gp檢測方法和遺傳背景不同都會(huì)影響結(jié)果。本研究對(duì)ABCB1 rs1045642多態(tài)性與食管癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果沒有發(fā)現(xiàn)TT基因型與食管癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有相關(guān)性。在健康人群中，CC基因頻率在希臘人群為0，波蘭人群為42%，中國為25%，印度為18%。rs1045642多態(tài)基因頻率與研究地區(qū)的種族明顯相關(guān)[3]。本研究對(duì)照組CC基因頻率為36.6%，比中國人群略高。盡管觀察組CC基因頻率高于對(duì)照組，但CC基因型與食管癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)沒有明顯相關(guān)性。一項(xiàng)前瞻性病例對(duì)照研究顯示，在丹麥人群中ABCB1 rs3789243多態(tài)與結(jié)直腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)存在正相關(guān)[15]，但把挪威和丹麥研究數(shù)據(jù)結(jié)合起來卻發(fā)現(xiàn)rs3789243多態(tài)與結(jié)直腸癌發(fā)生并不相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)rs3789243、rs4148737多態(tài)與食管癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無明顯相關(guān)性，得出與其他研究不一致的結(jié)論可能與腫瘤或疾病、種族不同有關(guān)。

目前,單倍型多態(tài)性對(duì)腫瘤發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)和臨床預(yù)后的潛在影響知之甚少。其他健康人群的單倍型分析提示，rs1045642多態(tài)位點(diǎn)和ABCB1基因的其他多態(tài)位點(diǎn)存在強(qiáng)連鎖不平衡[16]。rs1045642位點(diǎn)可能通過單倍型與ABCB1其他突變點(diǎn)的連鎖不平衡對(duì)治療反應(yīng)產(chǎn)生影響。本研究分析ABCB1基因單倍型在癌癥發(fā)生中的作用，發(fā)現(xiàn)rs1045642 C-rs3789243 T-rs4148737 A單倍型攜帶者更不易患食管癌，這個(gè)結(jié)果提示這些多態(tài)位點(diǎn)相互作用并導(dǎo)致食管癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的降低。

本研究仍有許多局限性，如研究樣本量小，對(duì)混雜因素調(diào)整不充分，研究目標(biāo)均來自食管癌高發(fā)的安陽地區(qū)，不能代表整個(gè)中國人群。

綜上所述，安陽地區(qū)ABCB1 rs1045642、rs3789243、rs4148737多態(tài)與食管癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)沒有明顯相關(guān)性，但是rs1045642 C-rs3789243 T-rs4148737 A單倍型可能是食管癌的保護(hù)因素之一，下一步還需要更深入、大樣本、不同種族人群的研究驗(yàn)證這一結(jié)論。