塞來昔布對(duì)急性出血壞死性胰腺炎炎癥介質(zhì)的影響

李明軒，辛　辰，王忠瓊，△（.西南醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，四川瀘州646000；.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，四川瀘州646000）

重癥急性胰腺炎（SAP）是臨床常見的急腹癥，其起病急、病情重、進(jìn)展快、病死率高、預(yù)后相對(duì)較差。近年來的研究表明，促炎性細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)介導(dǎo)的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)在急性胰腺炎（AP）發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，在胰腺局部和胰腺外臟器功能的損害中扮演重要角色，與全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）乃至多器官功能不全的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[1]。塞來昔布（Celecoxib）是新一代的非甾體解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎藥物，其可選擇性抑制環(huán)氧化酶2（COX-2）的生成和活性，使得前列腺素類物質(zhì)的合成與釋放減少，尤其是前列腺素E2的抑制作用，從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。本研究擬采用急性出血壞死性胰腺炎（AHNP）大鼠模型，觀察其血清中炎癥介質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化，并觀察COX-2特異抑制劑Celecoxib的干預(yù)效應(yīng)，期望對(duì)臨床治療AHNP提供新的思路。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料健康成年SD大鼠，體重100～150 g，由西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。L-精氨酸購自Sigma公司，Celecoxib購自Searle公司，血清一氧化氮（NO）測(cè)試盒（硝酸還原法）購自南京建成生物工程研究所，腫瘤壞死因子α（TNF-α）放射免疫測(cè)試盒購自解放軍總醫(yī)院東亞免疫技術(shù)研究所，BET-32M內(nèi)毒素測(cè)定儀購自天津大學(xué)無線電廠。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組將36只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（S組）、AHNP組和Celecoxib預(yù)處理組（C+AHNP組），每組 12 只，觀察 4 個(gè)時(shí)相點(diǎn)（3、6、12、24 h），每個(gè)時(shí)相點(diǎn)3只。實(shí)驗(yàn)開始前12 h，三組大鼠均嚴(yán)格禁食，但不禁飲。AHNP組：10%戊巴比妥（4 mL/kg）腹腔注射，選擇中上腹正中切口開腹，暴露胰腺和十二指腸，依次找到肝門、膽總管，并用動(dòng)脈夾夾閉，使用4號(hào)半針頭穿刺進(jìn)入膽胰管，距離約0.5 cm，以250 mg/kg的劑量緩慢注入20%的無菌L-精氨酸，并立即夾閉遠(yuǎn)端膽胰管，數(shù)分鐘后可見胰腺組織充血、腫脹，松開動(dòng)脈夾使膽胰管復(fù)通，立即用紗布?jí)浩却┐炭祝闊o膽漏后關(guān)腹。S組：經(jīng)膽胰管逆行注射等量滅菌生理鹽水，其他操作同AHNP組。C+AHNP組：用滅菌注射用水配制成1.0%的Celecoxib溶液，充分混勻后，以100 mg/kg劑量在誘導(dǎo)AHNP前1小時(shí)灌胃，其他操作不變。在相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)處死大鼠。

1.2.2樣本收集及處理

1.2.2.1血液樣本處死大鼠前心臟采血5 mL，以2 000 r/min離心，取得上清液即血清1.5～2.0 mL，-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?。每組自然死亡大鼠不行上述步驟。

1.2.2.2血清NO測(cè)定采用硝酸還原酶法測(cè)定血清NO水平，按操作說明依次加入試劑后，混旋均勻，室溫下靜置15 min，蒸餾水調(diào)零，上機(jī)檢測(cè)（540 nm，0.5 cm光徑）各管吸光度值（OD值）。計(jì)算公式如下：

1.2.2.3血清TNF-α檢測(cè)采用放射免疫分析法（RIA）。使用放射測(cè)定儀計(jì)數(shù)放射性核素標(biāo)記的汞-鉛，即cpm值，通過劑量反應(yīng)曲線（標(biāo)準(zhǔn)曲線）得出樣本抗原含量，cpm值與樣品內(nèi)測(cè)定抗原濃度呈負(fù)相關(guān)。

1.2.2.4血清內(nèi)毒素測(cè)定根據(jù)內(nèi)毒素與鱟試劑反應(yīng)產(chǎn)生凝膠的原理，采用動(dòng)態(tài)濁度法定量檢測(cè)血清內(nèi)毒素含量，通過生成凝膠的時(shí)間（臨界時(shí)間，T）來反映內(nèi)毒素水平。方法如下。（1）實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：為了除去可能存在的外源性內(nèi)毒素，使用250°干烤實(shí)驗(yàn)器具，時(shí)間為2 h。（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)備1支20 EU細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，精確加入1 000μL單層分子水（BET），振蕩混勻15 min，使?jié)舛葹?0.0 EU/mL，依次稀釋成內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為 4.00、1.50、0.50、0.05 EU/mL，每一個(gè)濃度組分別吸取250μL于反應(yīng)試管中，并加入1 500μL鱟試劑，混合均勻，快速插入內(nèi)毒素儀檢測(cè)孔，測(cè)定T。每一濃度作2個(gè)平行試管，設(shè)置BET為陰性對(duì)照。（3）實(shí)驗(yàn)曲線的繪制：取大鼠血漿1 500μL，并加入200μL生理鹽水和200μL Tris-HCl緩沖液混勻，100℃水浴鍋加熱共8 min，3 000 r/min離心8 min，取上清液200μL，加入200μL鱟試劑中，其濃度為0.5 EU/mL，混合均勻后迅速插入內(nèi)毒素儀檢測(cè)孔，測(cè)定T，每一濃度作2個(gè)平行試管。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以表示，采用t檢驗(yàn)；獨(dú)立樣本采用Mann-Whitne檢驗(yàn)及多樣本非參數(shù)比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1各組大鼠血清NO水平的動(dòng)態(tài)變化S組大鼠血清NO水平在3、6 h較高，6 h后緩慢下降；AHNP組大鼠血清NO水平呈逐漸增高趨勢(shì)，12 h前緩慢上升，12 h后明顯增高；在3、6 h均明顯低于其余兩組，12 h的水平與S組相近，但24 h的水平明顯高于S組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；C+AHNP組大鼠血清NO水平在3、6 h與S組相近，但顯著高于AHNP組，12 h后達(dá)到高峰，隨后下降，在24 h與S組接近，同時(shí)顯著低于AHNP組。三組24 h的NO水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1、圖1。

表1　各組大鼠各時(shí)相點(diǎn)血清NO水平比較（±s，μmol/L）

表1　各組大鼠各時(shí)相點(diǎn)血清NO水平比較（±s，μmol/L）

注：與 S 組比較，aP＜0.05；與 AHNP 組比較，bP＜0.05

組別3 h 6 h 12 h 24 h S組AHNP組C+AHNP組n　3　3　3 NO 36.60±3.97 18.86±4.41a35.69±9.81bn　3　3　3 NO 38.30±3.20 24.70±1.62a38.60±4.84bn　3　3　3 NO 34.68±4.14 35.81±1.43a63.06±1.99bn　3　3　3 NO 31.84±1.28 47.85±0.23 33.61±7.38

圖1　各組大鼠各時(shí)相點(diǎn)血清NO的動(dòng)態(tài)變化

2.2各組大鼠各時(shí)相點(diǎn)血清TNF-α水平動(dòng)態(tài)變化AHNP誘導(dǎo)3 h后，血清TNF-α水平顯著增高，呈時(shí)間依賴性；而C+AHNP組在各個(gè)時(shí)相點(diǎn)有所降低，但是其作用強(qiáng)度逐漸加強(qiáng)，6 h最強(qiáng)，12 h后逐漸減弱，見圖2。與S組比較，AHNP組大鼠各時(shí)相點(diǎn)TNF-α水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而C+AHNP組大鼠各時(shí)相點(diǎn)TNF-α水平明顯低于AHNP組，但僅6、12 h時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），3、24 h時(shí)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2、圖3。

表2　各組大鼠各時(shí)相點(diǎn)血清TNF-α水平比較（±s，ng/mL）

表2　各組大鼠各時(shí)相點(diǎn)血清TNF-α水平比較（±s，ng/mL）

注：與 S組比較，aP＜0.05；與 AHNP 組比較，bP＜0.05

組別S組AHNP組C+AHNP組3 h 6 h 12 h 24 h TNF-α 0.47±0.10 2.73±0.17a1.90±0.22n3 3 3 TNF-α 0.45±0.08 1.85±0.14a1.46±0.38n3 3 3 TNF-α 0.47±0.10 2.17±0.11a1.13±0.08bn3 3 3 TNF-α 0.44±0.10 2.61±0.09a1.47±0.22bn3 3 3

圖2　C+AHNP組降低大鼠血清TNF-α水平的動(dòng)態(tài)變化

圖3　各組大鼠血清TNF-α水平的動(dòng)態(tài)變化

2.3各組大鼠血清內(nèi)毒素水平的變化使用線性回歸法分析內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品濃度與反應(yīng)T，設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：lgT=2.835 02+（-0.250 96 lgN），相關(guān)系數(shù)（r）=-0.996 3（要求r＜-0.98），顯示內(nèi)毒素在 0.04～5.00 EU/mL，與 T 呈線性關(guān)系。AHNP組血清內(nèi)毒素水平持續(xù)升高，尤其12 h后上升最明顯，S組與AHNP組各時(shí)相點(diǎn)內(nèi)毒素水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），C+AHNP 組與AHNP組各時(shí)相點(diǎn)內(nèi)毒素水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3、圖4。

表3　各組大鼠各時(shí)相血清內(nèi)毒素水平變化（±s）

表3　各組大鼠各時(shí)相血清內(nèi)毒素水平變化（±s）

注：與S組比較,aP＜0.05

組別S組AHNP組C+AHNP組S組AHNP組C+AHNP組S組AHNP組C+AHNP組S組AHNP組C+AHNP組n3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3時(shí)相點(diǎn)3 h 6 h內(nèi)毒素水平（10-5EU/mL）5.67±0.19 61.94±8.04a54.98±3.81 5.58±0.51 222.82±40.99a249.61±12.95 6.40±0.47 276.57±29.39a222.70±83.68 5.92±0.45 995.24±161.59a847.73±31.92 12 h 24 h T（s）7 957.86±67.343 4 372.89±142.901 4 501.55±79.847 7 997.39±81.442 3 178.98±145.402 3 078.59±40.814 7 724.31±143.321 3 004.21±86.176 3 152.24±28.227 7 874.56±147.339 2 182.53±86.920 2 250.17±38.044

圖4　各組大鼠血清內(nèi)毒素水平比較

3　討　論

AP起病后體內(nèi)胰酶、細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)大量釋放，形成SIRS，抗炎性細(xì)胞因子同步產(chǎn)生，促炎-抗炎平衡紊亂，胰腺彌漫性出血和組織壞死，最終導(dǎo)致病情不斷惡化[2]。有研究認(rèn)為，各種細(xì)胞因子并非直接發(fā)揮作用，而是通過調(diào)節(jié)COX-2的表達(dá)來啟動(dòng)炎性反應(yīng)[3]。因此，如果抑制COX-2，就有可能改變AP體內(nèi)的炎癥介質(zhì)的表達(dá)，改善患者預(yù)后。

NO參與血管炎性反應(yīng)、免疫反應(yīng)，并與炎癥免疫細(xì)胞因子相互調(diào)節(jié)。AP是多種免疫細(xì)胞參與的炎癥免疫反應(yīng)。生理劑量的NO可以舒張血管平滑肌，增加維持胰腺血流灌注，抑制血小板聚集等，而過量的NO直接導(dǎo)致血管難治性擴(kuò)張，胰腺灌注減少，加重胰腺組織損傷。此外，NO也有增加血管通透性的作用，與組織水腫有一定的關(guān)系[4-7]?？梢姡贏P的病情進(jìn)展中，NO表現(xiàn)出雙重生物學(xué)行為[8-10]。本研究觀察了AHNP造模后3、6、12、24 h大鼠血清NO水平的動(dòng)態(tài)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在3、6 h，AHNP組明顯低于S組，但隨后上升顯著，于12 h與后者持平，并繼續(xù)增高，在24 h顯著高于S組，呈現(xiàn)先降低后升高的現(xiàn)象。C+AHNP組在3、6 h與S組血清NO水平十分接近，12 h明顯增高，隨后逐漸下降，24 h接近后者，呈現(xiàn)先升高后降低的雙相變化，提示Celecoxib可通過調(diào)節(jié)NO水平，顯著改善微循環(huán)，增加組織血流灌注，減輕缺血、缺氧性損傷，改善全身炎性反應(yīng)和器官組織損傷。

TNF-α激活巨噬細(xì)胞并促進(jìn)其釋放，在炎癥級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)中發(fā)揮主要作用，是導(dǎo)致AP并發(fā)SIRS的主要促炎性細(xì)胞因子。其結(jié)果是引起代謝亢進(jìn)、微血管損傷、血流動(dòng)力學(xué)障礙等一系列病理生理改變，甚至導(dǎo)致器官衰竭[11-15]。本研究結(jié)果顯示，AHNP誘導(dǎo)后3 h，血清TNF-α水平即顯著增加，并呈進(jìn)行性增高趨勢(shì)；而Celecoxib預(yù)處理后各時(shí)相點(diǎn)血清TNF-α水平均顯著降低，其中以3、6 h的作用強(qiáng)度較高，表明Celecoxib有助于改善全身炎性反應(yīng)、下調(diào)器官功能損傷。

有研究發(fā)現(xiàn)，在SAP發(fā)病早期，因全身大量炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子的釋放，腸道黏膜屏障功能受損，腸源性內(nèi)毒素移位，形成內(nèi)毒素血癥，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞均具有損傷和活化作用，反饋激發(fā)更多炎癥介質(zhì)的釋放，故內(nèi)毒素是加重AP的重要因素[16-18]。本研究結(jié)果顯示，S組大鼠血清內(nèi)毒素水平極低，僅有微量且動(dòng)態(tài)恒定；在AHNP組造模后3 h，血清內(nèi)毒素水平顯著增高，呈持續(xù)增高趨勢(shì)，尤其在12 h增高最為明顯，表明在SAP發(fā)病后相對(duì)較晚時(shí)期，內(nèi)毒素發(fā)揮主要損傷作用。而在炎性反應(yīng)的早期，內(nèi)毒素水平無明顯變化，波動(dòng)較小，因此，Celecoxib對(duì)AP后內(nèi)毒素水平無明顯影響，但是否通過激活某種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮抗炎作用，尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，Celecoxib在AHNP中具有抑制TNF-α、雙向調(diào)節(jié)NO等炎癥介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄與釋放作用，是AP治療的新思路。