小麥分離蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及功能特性研究

溫青玉，張康逸*，楊　帆，盛　威，康志敏，高玲玲

(1.小麥和玉米深加工國家工程實驗室，河南 鄭州 450001；2.河南省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)副產(chǎn)品加工研究中心，河南 鄭州 450002)

小麥蛋白質(zhì)是新型植物蛋白質(zhì)資源，其能量和營養(yǎng)價值明顯優(yōu)于大多數(shù)植物蛋白質(zhì)，是優(yōu)質(zhì)價廉的天然氮源[1]。我國小麥資源豐富，2016—2017年產(chǎn)量約12 889萬t，居世界前列。目前，小麥的加工研究主要集中于面粉的開發(fā)利用及面制品品質(zhì)的改良方面[2-4]，對小麥分離蛋白質(zhì)功能特性的研究還鮮有報道。為此，以中筋小麥為原料，分離蛋白質(zhì)，對蛋白質(zhì)的成分、氨基酸組成及功能特性進行分析，研究蛋白質(zhì)的溶解度、持油性、起泡性及泡沫穩(wěn)定性、乳化性及乳化穩(wěn)定性，為小麥分離蛋白質(zhì)下一步的開發(fā)提供基礎數(shù)據(jù)和理論支撐。

1　材料和方法

1.1　試驗材料

中筋小麥品種為百農(nóng)201。大豆色拉油從市場購買，石油醚(30～60 ℃)、濃硫酸、濃鹽酸(體積分數(shù)36%～38%)、無水乙醇、硼酸、甲基紅指示劑、溴甲酚綠指示劑、氫氧化鈉、無水亞硫酸鈉、氯化鈉、磷酸二氫鉀、十二烷基硫酸鈉等均為分析純。

試驗儀器：DHG-9240A鼓風干燥箱購自上海精宏實驗設備有限公司，SOX500脂肪測定儀購自山東海能科學儀器有限公司，TC-4-10陶瓷纖維爐購自北京中興偉業(yè)儀器有限公司，JW1042低速離心機購自安徽嘉文儀器裝備有限公司，K110全自動凱氏定氮儀購自山東海能科學儀器有限公司，A300全自動氨基酸分析儀購自德國曼默博爾公司。

1.2　樣品脫脂處理

參照Macritchie等[5]的方法，略有改動。青麥仁冷凍干燥后，用多功能粉碎機粉碎成粉末，過孔徑0.25 mm篩。

稱取一定量小麥粉和氯仿在室溫下按照1∶2混合，電子攪拌器攪拌5 min，用布氏漏斗抽濾懸浮液，殘余小麥粉重復此程序3次。脫脂小麥粉于室溫通風櫥中晾干至無氯仿氣味。

1.3　小麥分離蛋白質(zhì)的制備

參考Hettiarachchy等[6]方法，略有改動。取脫脂后的100 g小麥粉與0.5 mol/L 氯化鈉溶液按1∶0的比例混合，室溫攪拌1 h，待粉末充分潤濕后用1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至9，繼續(xù)攪拌30 min并保持溶液pH值不變。而后在4 000 r/min轉速下離心30 min，收集上清液，對殘渣進行再次提取后與第一次收集的上清液合并，余下殘渣棄去。上清液用1.0 mol/L 鹽酸調(diào)pH值至蛋白質(zhì)的等電點，室溫攪拌30 min，靜置20 min，在4 000 r/min轉速下離心30 min，棄去上清液，收集沉淀，冷凍干燥后得到分離蛋白質(zhì)。

1.4　測定項目及方法

1.4.1小麥基本成分蛋白質(zhì)含量的測定方法參照GB/T 5009.5—2016；淀粉含量的測定方法參照 GB/T 5009.9—2016；脂肪含量的測定方法參照GB/T 5009.6—2016；膳食纖維含量的測定方法參照GB/T 5009.88—2014；灰分含量的測定方法參照GB/T 5009.4—2016。

1.4.2小麥分離蛋白質(zhì)的純度以脫脂后的小麥粉為原料，利用等電點離心沉淀法制備分離蛋白質(zhì)，通過蛋白質(zhì)純度計算公式進行計算。計算公式如下：

(1)

式中：m為得到的蛋白質(zhì)的質(zhì)量(g)，ω1為得到的蛋白質(zhì)中蛋白質(zhì)含量(%)，M為提取蛋白質(zhì)消耗的小麥粉質(zhì)量(g)，ω2為提取蛋白質(zhì)消耗的小麥粉中蛋白質(zhì)含量(%)。

1.4.3小麥分離蛋白質(zhì)的組成成分根據(jù)Osborne[7]的分類法，小麥中所含的蛋白質(zhì)可分為清蛋白、球蛋白、麥醇溶蛋白及麥谷蛋白。

清蛋白含量的測定：稱取1 g小麥蛋白質(zhì)置于燒杯中，加入20 mL蒸餾水攪拌均勻，45 ℃攪拌2 h，在4 000 r/min條件下離心20 min，收集上清液，于25 mL容量瓶中定容，然后用凱氏定氮法分析蛋白質(zhì)含量。沉淀用蒸餾水洗滌后作為后續(xù)試驗的原料。

球蛋白含量的測定：向清蛋白提取后的沉淀中加入10 mL 5%亞硫酸鈉溶液，45 ℃攪拌1.5 h，在4 000 r/min條件下離心20 min，收集上清液，于25 mL容量瓶中定容，然后用凱氏定氮法分析蛋白質(zhì)含量。沉淀用蒸餾水洗滌后作為后續(xù)試驗的原料。

麥醇溶蛋白含量的測定：在球蛋白提取后的沉淀中加入8 mL 70%乙醇溶液，50 ℃攪拌20 min，在4 000 r/min條件下離心20 min，殘渣進行再次提取，合并2次離心獲得的上清液，于25 mL容量瓶中定容，然后用凱氏定氮法分析蛋白質(zhì)含量。沉淀用蒸餾水洗滌后作為后續(xù)試驗的原料。

麥谷蛋白含量的測定：向麥醇溶蛋白提取后的沉淀中加入8 mL 0.04% 氫氧化鈉溶液，50 ℃攪拌1.5 h，在4 000 r/min條件下離心20 min，收集上清液，于25 mL容量瓶中定容，然后用凱氏定氮法分析蛋白質(zhì)含量。

1.4.4小麥分離蛋白質(zhì)的氨基酸組成及含量準確稱取一定質(zhì)量的樣品(100 mg)置安瓿瓶中并加入鹽酸(6 mol/L)10 mL，用氮吹儀吹氮5 min左右。用手持式噴燈封口，確認密封后置110 ℃烘箱中水解24 h。冷卻至室溫后開封，將水解液轉移至50 mL燒杯中，用超純水沖洗水解管3次，氫氧化鋰調(diào)節(jié)濾液至pH值為2.2后轉移至50 mL容量瓶中，用超純水沖洗燒杯3次，合并濾液，用超純水定容至50 mL。取容量瓶中溶液樣品，用超純水按1∶稀釋，用0.22 μm有機濾膜過濾，置于A300全自動氨基酸分析儀自動進樣器上進樣分析。

1.4.5小麥分離蛋白質(zhì)等電點參考郭娜等[8]的方法，準確稱取青麥仁分離蛋白質(zhì)9份，用去離子水配制10 g/L蛋白質(zhì)溶液20 mL，用1.0 mol/L 鹽酸和氫氧化鈉調(diào)溶液pH值分別為4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8，然后磁力攪拌1 h，4 000 r/min轉速下離心20 min，稱沉淀質(zhì)量，以pH值為橫坐標、沉淀質(zhì)量為縱坐標，繪出沉淀質(zhì)量—pH值的關系圖。沉淀質(zhì)量最大的pH值即為蛋白質(zhì)的等電點。

1.4.6小麥分離蛋白質(zhì)溶解度參考樸金苗等[9]測定方法，將1～2 g小麥分離蛋白質(zhì)溶于100 mL蒸餾水中，而后用0.5 mol/L氫氧化鈉溶液和0.5 mol/L鹽酸分別調(diào)節(jié)pH值至2、3、4、5、6、7、8、9、10，室溫振蕩1 h，4 000 r/min離心20 min，取上清液，用凱氏定氮法測定上清液中氮含量。溶解度表示為上清液中氮含量與樣品中總氮含量的百分比。

1.4.7小麥分離蛋白質(zhì)持水性、持油性參考孫媛[10]的測定方法，稱取0.25 g小麥分離蛋白質(zhì)于離心管中，加入25 mL蒸餾水或大豆色拉油，充分振蕩、混勻后，置于恒溫培養(yǎng)振蕩器中，于40 ℃、120 r/min振蕩30 min。然后在4 000 r/min條件下離心15 min，倒掉上層未吸附的水或大豆色拉油，稱質(zhì)量，計算蛋白質(zhì)樣品的持水性(持油性) 。用大豆蛋白質(zhì)做對照試驗。

(2)

式中：W0為蛋白質(zhì)樣品的質(zhì)量(g)，W1為離心管加樣品的總質(zhì)量(g)，W2為離心后離心管加沉淀的總質(zhì)量(g)。

1.4.8小麥分離蛋白質(zhì)起泡性與泡沫穩(wěn)定性參考李濤[11]的方法，用小麥分離蛋白質(zhì)配制一定質(zhì)量濃度的蛋白質(zhì)溶液100 mL，用迷你輔食料理機攪打1 min后馬上倒入250 mL量筒中，讀取泡沫體積V0后計算起泡性，靜置60 min后讀取體積V60后計算泡沫穩(wěn)定性。

(3)

(4)

蛋白質(zhì)溶液濃度對蛋白質(zhì)起泡性及泡沫穩(wěn)定性的影響：用pH值為7的磷酸鹽緩沖液配制質(zhì)量濃度分別為2、4、6、8、10、12、14 g/L的蛋白質(zhì)溶液，測定蛋白質(zhì)起泡性及泡沫穩(wěn)定性。pH值對蛋白質(zhì)起泡性及泡沫穩(wěn)定性的影響：將質(zhì)量濃度為2 g/L的蛋白質(zhì)溶液分別調(diào)節(jié)pH值至2、4、6、8、10、12，測定蛋白質(zhì)起泡性及泡沫穩(wěn)定性。

1.4.9小麥分離蛋白質(zhì)乳化性與乳化穩(wěn)定性參考Pearce等[12]的方法，用青麥仁分離蛋白質(zhì)配制一定質(zhì)量濃度的蛋白質(zhì)溶液20 mL，與25 mL食用油在迷你輔食料理機中乳化1 min。制備好的乳化液迅速倒入小燒杯中，立即從燒杯底部取100 μL乳化液于試管中，加入 4.9 mL 1 g/L SDS稀釋，混勻后測量500 nm 處的吸光值(A0)。靜置 10 min重新取樣測定吸光值(A10)。

乳化性=A0

(5)

(6)

蛋白質(zhì)溶液質(zhì)量濃度對蛋白質(zhì)乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響：用pH值為7的磷酸鹽緩沖液配制質(zhì)量濃度分別為2、4、6、8、10、12 g/L的蛋白質(zhì)溶液，測定蛋白質(zhì)乳化性及乳化穩(wěn)定性。pH值對蛋白質(zhì)乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響：將質(zhì)量濃度為2 g/L的蛋白質(zhì)溶液分別調(diào)節(jié)pH值至2、4、6、8、10、12，然后測定蛋白質(zhì)乳化性及乳化穩(wěn)定性。

1.5　數(shù)據(jù)處理

所得試驗數(shù)據(jù)均為3次重復的平均值，試驗數(shù)據(jù)采用Origin 8.0進行處理繪圖。

2　結果與分析

2.1　小麥及分離蛋白質(zhì)的組成分析

對小麥的基本成分進行分析發(fā)現(xiàn)，小麥總蛋白質(zhì)含量為11.70%，淀粉含量為59.25%，脂肪含量為1.43%，膳食纖維含量為11.24%，灰分含量為1.48%，其他(水、微量物質(zhì)、礦物質(zhì)等)含量為14.90%。

經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，小麥分離蛋白質(zhì)純度為83.24%，其中，清蛋白含量為60.27%，球蛋白含量為3.68%，麥醇溶蛋白含量為2.91%，麥谷蛋白含量為3.05%，其他蛋白質(zhì)占30.09%。

2.2　小麥分離蛋白質(zhì)的氨基酸組成及含量分析

由表1可知，小麥分離蛋白質(zhì)中氨基酸含量豐富，種類齊全，其中，谷氨酸含量最高，占總氨基酸的39.82%。谷氨酸不僅屬于鮮味氨基酸，在醫(yī)學上谷氨酸還用于治療肝性昏迷，改善兒童智力發(fā)育。小麥分離蛋白質(zhì)中亮氨酸含量也較高，其是支鏈氨基酸，與異亮氨酸和纈氨酸一起合作修復肌肉，控制血糖，并給身體組織提供能量。小麥分離蛋白質(zhì)中必需氨基酸占總氨基酸的比例為29.06%。

根據(jù)FAO(聯(lián)合國糧食組織)/WHO(世界衛(wèi)生組織)計分模式[13],小麥分離蛋白質(zhì)氨基酸評分詳見表2。由氨基酸評分可知，小麥分離蛋白質(zhì)中第一限制性氨基酸為蛋氨酸和半胱氨酸，第二限制性氨基酸為賴氨酸，苯丙氨酸、酪氨酸和亮氨酸含量較高。將雞蛋蛋白質(zhì)中各種氨基酸含量作為評分依據(jù)，小麥分離蛋白質(zhì)氨基酸化學評分詳見表2。由化學評分可知，小麥分離蛋白質(zhì)中第一限制性氨基酸仍為蛋氨酸和半胱氨酸，第二限制性氨基酸仍為賴氨酸。

表1　小麥分離蛋白質(zhì)的氨基酸組成和含量

表2　小麥分離蛋白質(zhì)中必需氨基酸含量及評分

2.3　小麥分離蛋白質(zhì)等電點分析

由圖1可知，小麥分離蛋白質(zhì)在pH值為5.0時的沉淀質(zhì)量最大，可以判定小麥分離蛋白質(zhì)的等電點為5.0。蛋白質(zhì)是兩性物質(zhì)，在等電點時，蛋白質(zhì)分子靜電荷為0，消除了分子間的靜電斥力，此時蛋白質(zhì)間靜電排斥作用最低，蛋白質(zhì)聚集、沉淀。因此，常選取等電點pH值來進行蛋白質(zhì)沉淀純化[14]。

圖1　小麥分離蛋白質(zhì)的等電點

2.4　小麥分離蛋白質(zhì)的溶解度分析

由圖2可知，小麥分離蛋白質(zhì)溶解度隨著pH值的增加先降低后增加，在pH值為6時最低。這是因為在等電點附近，蛋白質(zhì)所帶的正電荷與負電荷平衡，這樣就降低了蛋白質(zhì)分子間的靜電排斥力，從而使蛋白質(zhì)發(fā)生凝聚而沉淀；在非等電點的區(qū)域內(nèi)，蛋白質(zhì)之間的靜電斥力較大，促進了蛋白質(zhì)的解離，從而使蛋白質(zhì)的溶解性升高，當pH值小于2或者大于9時，大部分蛋白質(zhì)處于溶解狀態(tài)。

圖2　小麥分離蛋白質(zhì)在不同pH值下的溶解度

2.5　小麥分離蛋白質(zhì)的功能特性

2.5.1小麥分離蛋白質(zhì)的持水性和持油性蛋白質(zhì)的持水性是指蛋白質(zhì)與水分子的結合能力，在蛋白質(zhì)食品的加工過程中起著非常重要的作用。持油性是指蛋白質(zhì)結合游離脂肪酸的能力，蛋白質(zhì)持油性高，能夠提高食品對脂肪的吸收和保留能力，減少脂肪在加工過程中的損失，進而改善食品風味。由表3可知，小麥和大豆分離蛋白質(zhì)的持水性分別為4.26 g/g和5.95 g/g，持油性分別為5.98 g/g和2.11 g/g；與大豆分離蛋白質(zhì)相比，小麥蛋白質(zhì)持油性較好，持水性稍差，可將其應用到肉制品、烘焙制品、油炸食品等的生產(chǎn)中。

表3　小麥分離蛋白質(zhì)的持水性和持油性　g/g

2.5.2小麥分離蛋白質(zhì)的起泡性與泡沫穩(wěn)定性

2.5.2.1起泡性起泡性是蛋糕、面包、冰淇淋等食品加工過程中非常重要的質(zhì)量控制指標。由圖3可知，小麥分離蛋白質(zhì)的起泡性隨蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的增大而增加，當小麥分離蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度達到8 g/L時，蛋白質(zhì)的起泡性較大；之后隨蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的增大變化較小。這是由于蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度增大，溶解的蛋白質(zhì)增多，蛋白質(zhì)發(fā)泡力呈現(xiàn)增加的趨勢，起泡性也就隨之增強。不同pH值對蛋白質(zhì)起泡性的影響如圖4表示，隨pH值增大，小麥分離蛋白質(zhì)的起泡性先減小后增大，pH值為6時起泡性最小。這是因為蛋白質(zhì)的起泡性與其溶解度有關，蛋白質(zhì)溶解度在pH值為6時最小，可溶性蛋白質(zhì)最少，所以起泡性最小。

圖3　不同質(zhì)量濃度蛋白質(zhì)溶液對蛋白質(zhì)起泡性的影響

圖4　不同pH值對蛋白質(zhì)起泡性的影響

2.5.2.2泡沫穩(wěn)定性泡沫穩(wěn)定性是蛋白質(zhì)產(chǎn)生的泡沫在一定時間內(nèi)維持穩(wěn)定的能力。由圖5可知，隨蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度增加，泡沫穩(wěn)定性增強，當小麥分離蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度達到8 g/L時，泡沫穩(wěn)定性較強；之后隨蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的增大變化較小。不同pH值下蛋白質(zhì)的泡沫穩(wěn)定性如圖6所示，隨pH值增大，蛋白質(zhì)的泡沫穩(wěn)定性先降低后增大，在pH值大于6時，蛋白質(zhì)的泡沫穩(wěn)定性比較高；之后隨蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的增大變化較小。這與pH值為6時蛋白質(zhì)溶解度最小有關，不溶性蛋白質(zhì)越多，蛋白質(zhì)維持泡沫穩(wěn)定的能力越小。

圖5　不同質(zhì)量濃度蛋白質(zhì)溶液對蛋白質(zhì)泡沫穩(wěn)定性的影響

圖6　不同pH值對蛋白質(zhì)泡沫穩(wěn)定性的影響

2.5.3小麥分離蛋白質(zhì)的乳化性與乳化穩(wěn)定性

2.5.3.1乳化性蛋白質(zhì)的乳化性是指蛋白質(zhì)能使油與水形成穩(wěn)定的乳化液的能力。由圖7可知，小麥分離蛋白質(zhì)的乳化性隨蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度增加而增加，當小麥分離蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度達到10 g/L時，蛋白質(zhì)的乳化性較強；之后隨蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的增大變化較小。這是因為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度增大會使油水乳化體系界面膜的厚度增大，膜的強度也因此提高，乳化性也就越來越大。pH值對蛋白質(zhì)乳化性的影響如圖8所示，小麥分離蛋白質(zhì)的乳化性在pH值為6時最差，在pH值12時最大，說明堿性條件下蛋白質(zhì)的乳化性較好。這與蛋白質(zhì)的溶解性有密切關系，許多蛋白質(zhì)均有“等電點附近乳化性差，偏離等電點乳化性增強”的規(guī)律，不溶性的蛋白質(zhì)對乳化作用的貢獻很小。

圖7　不同質(zhì)量濃度蛋白質(zhì)溶液對蛋白質(zhì)乳化性的影響

圖8　不同pH值對蛋白質(zhì)乳化性的影響

2.5.3.2乳化穩(wěn)定性乳化穩(wěn)定性是指乳化液保持明顯穩(wěn)定狀態(tài)并且不產(chǎn)生兩相分層不穩(wěn)定現(xiàn)象的特性。由圖9可知，隨著蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度增大，小麥分離蛋白質(zhì)的乳化穩(wěn)定性增強，當小麥分離蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度達到8 g/L時，蛋白質(zhì)的乳化穩(wěn)定性較強；之后隨蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的增大變化較小。這說明在一定范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度越大，蛋白質(zhì)的乳化穩(wěn)定性就越大。pH值對蛋白質(zhì)乳化穩(wěn)定性的影響如圖10所示，小麥分離蛋白質(zhì)的乳化穩(wěn)定性在pH值為6時最差，pH值低于6時，蛋白質(zhì)的乳化穩(wěn)定性隨pH值的增加而減少；pH值高于6時，蛋白質(zhì)的乳化穩(wěn)定性隨pH值的增加而增加。這是因為pH值首先影響了蛋白質(zhì)的溶解性，而溶解的蛋白質(zhì)的乳化性質(zhì)又依賴于乳化液中的親油-親水基的動態(tài)平衡[15-16]。

圖9　不同質(zhì)量濃度蛋白質(zhì)溶液對蛋白質(zhì)乳化穩(wěn)定性的影響

圖10　不同pH值對蛋白質(zhì)乳化穩(wěn)定性的影響

3　結論

小麥分離蛋白質(zhì)富含賴氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、色氨酸等8種必需氨基酸，其中谷氨酸含量最高，高達39.82%，可以作為營養(yǎng)強化劑加以應用。小麥分離蛋白質(zhì)與大豆分離蛋白質(zhì)相比，持油性較好，持水性稍差，持水性和持油性分別為4.26 g/g和 5.98 g/g。在蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為8 g/L及以上時，分離蛋白質(zhì)擁有良好的起泡性和泡沫穩(wěn)定性，可以將其起泡性應用在蛋糕、蛋奶酥、啤酒泡沫、面包等食品加工中，改善產(chǎn)品的品質(zhì)。小麥分離蛋白質(zhì)在質(zhì)量濃度為8 g/L及以上時，擁有很好的乳化性及乳化穩(wěn)定性，可以改善面制品的品質(zhì)及面筋網(wǎng)絡質(zhì)構。綜合分析，小麥分離蛋白質(zhì)是一種優(yōu)良的植物蛋白質(zhì)資源，和其他谷物混合食用可以起到互補作用，提高營養(yǎng)價值，具有廣闊的應用前景。