雞碳酸酐酶4的生物信息學分析

郭玉琦，劉辰暉，劉桂瓊，姜勛平，劉　耘

(華中農業(yè)大學 動物科學技術學院，湖北 武漢 430070)

目前，在禽類上關于碳酸酐酶4(CAⅣ)的研究仍較少。生物信息學是分子生物學和計算機科學交叉結合產生的新學科，在當今的生命科學研究領域發(fā)揮著越來越重要的作用，利用生物信息學對蛋白質進行序列分析,從而推斷并預測其結構和功能,已成為初步確定蛋白質結構及功能的一種捷徑。本研究采用生物信息學的方法，分析雞CAⅣ蛋白的理化性質、結構特征和功能域，以期為進一步研究和探索CAⅣ的結構和功能奠定基礎。

1　材料和方法

1.1　不同物種CAⅣ氨基酸序列的獲取

利用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫獲得雞、火雞、鵪鶉、珍珠雞、大雁、綠頭鴨CAⅣ的氨基酸序列，編號分別為XP_415893.1、XP010720331.1、XP015736158.1、XP021271433.1、XP013053511.1、XP005014440.1。

1.2　生物信息學分析

用ProtParam(http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)分析雞CAⅣ蛋白的氨基酸組成、原子總數(shù)、摩爾消光系數(shù)等參數(shù)。利用ProtScale(http://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl1)分析雞CAⅣ的疏水性和親水性。用Mega分析雞、火雞、鵪鶉、珍珠雞、大雁和綠頭鴨CAⅣ的氨基酸序列同源性并構建進化樹。

用CFSSP工具(Chou & Fasman Secondary Structure Prediction Server，http://www.biogem.org/tool/chou-fasman/)預測雞CAⅣ蛋白的α螺旋、β折疊和β轉角，用Signal P4.1 Server軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測蛋白質的信號肽，用Protfun 2.2 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun-2.2/)進行功能分類預測和分析，用TMHMM Server v.2.0軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預測蛋白質的跨膜區(qū)域。利用NetNGlyc 1.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)進行糖基化位點預測，用軟件NetPhos 3.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)進行磷酸化位點預測。

用DNASTAR預測CAⅣ的表面可及性、柔韌性和抗原表位，用zhanglab.cn軟件(https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/)預測蛋白質的三維結構。

2　結果與分析

2.1　雞CAⅣ的理化性質分析

雞CAⅣ由316個氨基酸構成，氨基酸種類和含量如表1所示。從表1可以看出，雞CAⅣ的亮氨酸含量最高，其次是絲氨酸，分別為12.3%和8.2%。雞CAⅣ的分子式為C1 653H2 538N424O472S8，總原子數(shù)是5 095個。不穩(wěn)定系數(shù)為44.29，當?shù)鞍踪|的不穩(wěn)定系數(shù)>40時表明該蛋白質是不穩(wěn)定蛋白，所以雞CAⅣ是不穩(wěn)定蛋白。其疏水值為-0.277，為親水性蛋白。

表1　雞CAⅣ氨基酸構成

2.2　不同禽類CAⅣ氨基酸序列同源性比對

根據(jù)CAⅣ蛋白氨基酸序列構建的不同禽類間的進化樹見圖1。從圖1可以看出，水禽和陸禽分別歸為一類，它們在進化上的差異較大，這與動物分類學的分類結果相符。在陸禽中，雞CAⅣ與鵪鶉相距較遠，與火雞CAⅣ分子進化距離最近，親緣關系最密切，說明兩者CAⅣ的氨基酸序列相似度很高，位于同一個進化枝。

圖1　不同禽類的CAⅣ聚類分析

2.3　雞CAⅣ的親水性和疏水性分析

如圖2所示，雞CAⅣ第7位的纈氨酸疏水性最強，得分為3.111，第182位的谷氨酸親水性最強，得分為-2.456。大部分氨基酸疏水性為負值，CAⅣ總體平均疏水性為負值，說明整條鏈呈親水性，該蛋白質為親水性蛋白，這與其理化性質預測結果一致。

圖2　雞CAⅣ的親水性和疏水性分析

2.4　雞CAⅣ的二級結構分析

從圖3可以看出，雞CAⅣ的α螺旋最多，共有221個，主要集中在氨基酸的第14—18、27—32、41—49、86—89、110—111、113—119、124—128、139—147、152—167、188—193、200—209、218—221、270—280、292—299位；β折疊共有132個，大多數(shù)在氨基酸的第3—13、19—26、57—72、230—261、300—314位；β轉角有43個，位置較為分散。

圖3　雞CAⅣ的二級結構預測

2.5　雞CAⅣ的跨膜區(qū)域分析

跨膜結構域是蛋白質與膜相結合的主要部位，一般由20 個左右的疏水氨基酸殘基組成，形成一螺旋，它固著于細胞膜上起“錨定”作用，含有跨膜區(qū)

的蛋白質往往與細胞功能狀態(tài)密切相關。從圖4可以看出，雞CAⅣ蛋白沒有橫貫細胞膜，只有一部分處于細胞膜上，而其余大部分氨基酸位于胞外，因此CAⅣ是膜錨定蛋白。

圖4　雞CAⅣ跨膜區(qū)域預測

2.6　雞CAⅣ的信號肽區(qū)分析

信號肽是蛋白質的一部分，指新合成的肽鏈中用于指導蛋白質跨膜轉移的N末端的氨基酸序列，將蛋白質導向細胞的正確位置并使蛋白質越過細胞器的膜。由圖5可知，雞CAⅣ蛋白分值曲線明顯，剪切位點的C值為0.791，綜合剪切位點的Y值為0.847，標記為信號肽的S值為0.953。具有高C分值同時又是S分值由高轉低的位點最有可能是信號肽的剪切點，從圖5可以看出，剪切點在第18位和第19位氨基酸之間，S值在剪切位點前高于剪切位點之后，因此，CAⅣ蛋白存在信號肽，且N端18～19個氨基酸為信號肽，意味著該段可能與細胞發(fā)生相互作用，這也與上述跨膜分析結果相吻合。

C值表示原始切割位點分值，S值表示信號肽分值，Y值表示結合位點分值

2.7　雞CAⅣ的功能預測

從表2可以看出，雞CAⅣ組成細胞膜的可能性最大，概率為13.146，故CAⅣ蛋白可能為細胞膜的組成成分之一。

表2　雞CAⅣ蛋白功能分類預測

2.8　雞CAⅣ的磷酸化位點分析

蛋白質的磷酸化是其生物合成后活性調節(jié)的一種化學修飾，是控制酶活性的重要步驟，對蛋白質具有重要的生物學意義。由圖6可以看出，雞CAⅣ有22個絲氨酸磷酸化位點，分別在第10、28、35、52、55、83、84、100、138、202、203、212、229、251、256、259、268、285、290、292、293、313位，10個蘇氨酸磷酸化位點，分別在第16、44、61、71、94、101、201、231、232、242位，3個酪氨酸磷酸化位點，分別在78、131、223位，說明這些位點與酶的活性密切相關。

圖6　雞CAⅣ磷酸化位點預測

2.9　雞CAⅣ的糖基化位點分析

由圖7可以得出，在第165位的天冬酰胺可能為CAⅣ蛋白糖基化位點。

2.10　雞CAⅣ的三維結構分析

雞CAⅣ三維結構如圖8所示，該蛋白質有豐富的折疊和螺旋，這些結構對其功能有很重要的作用。

圖7　雞CAⅣ糖基化位點預測

2.11　雞CAⅣ的B細胞抗原表位分析

由圖9可知，雞CAⅣ有多個可能抗原位點，主要位于氨基酸的第28—58、77—117、134—147、192—206、219—240、264—279位，第28—58位和77—117位的表面可及性和柔韌性較高。當抗原指數(shù)>0，親水性>0，表面可及性>1時，這些表面可及

性和柔韌性較高的區(qū)域可能形成抗原表位[12-13]，故CAⅣ在第28—58位和77—117位形成抗原表位的可能性較大。

圖8　雞CAⅣ三維結構模擬

圖9　雞CAⅣ抗原表位、親水性、柔韌性、表面可及性預測

3　結論與討論

雞CAⅣ是親水性蛋白，含有明顯的信號肽，綜合三維結構圖和二級結構分析結果顯示，CAⅣ結構復雜，α螺旋、β折疊、β轉角十分豐富。金屬蛋白酶中與金屬相結合部位的N端和C端結構域含有豐富的α螺旋和β折疊，α螺旋和β折疊之間的狹縫也與催化底物的識別密切相關，嗜熱菌蛋白酶為典型的含鋅金屬蛋白酶，其晶體結構表明N端結構域富含β折疊，C端富含α螺旋，Zn2+位于這2個區(qū)域的狹縫之間[14]。CAⅣ是含鋅金屬蛋白，其結構域中α螺旋、β折疊、β轉角豐富，也具有這樣的狹縫，可能是其能夠與Zn2+相結合的條件之一，因此可進一步從CAⅣ與Zn2+的結合方面研究其功能。

哺乳動物的CAⅣ通過磷脂酰肌醇甘油鍵錨定于質膜上，在哺乳動物的腎臟頂端刷狀緣膜和近端小管基底膜、附睪和輸精管頂膜中均檢測到CAⅣ的表達[17]，說明CAⅣ可能為膜結合蛋白。本研究分析了雞CAⅣ的氨基酸序列，也預測其為膜結合蛋白，因此禽類的CAⅣ也很可能是通過相關的共價鍵與細胞膜結合。

蛋白質的修飾方式有多種，其中磷酸化、糖基化是最普遍、最重要的翻譯后修飾方式[18]，CAⅣ能在細胞間傳遞信號、調控酶活性，離不開蛋白質的磷酸化、糖基化。糖基化賦予蛋白質傳導信號的功能，而且某些蛋白質只有在該位點發(fā)生糖基化后才能正常折疊，糖基化還可調節(jié)許多蛋白質之間的相互作用[19]，影響蛋白質的抗原決定簇、穩(wěn)定性、免疫分子的結構和功能[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，雞CAⅣ只有1個糖基化位點，可能糖基化不是CAⅣ發(fā)揮功能的主要調控信號。磷酸化主要通過三維結構調控蛋白質活性，并在細胞信號轉導過程中起重要作用[21]。本研究發(fā)現(xiàn)CAⅣ有22個絲氨酸磷酸化位點、10個蘇氨酸磷酸化位點和3個酪氨酸磷酸化位點，其中酪氨酸磷酸化在所有位點中比例最低。當細胞中酪氨酸磷酸化水平低時，細胞能較好地對內外刺激做出靈敏反應，因此酪氨酸磷酸化位點對細胞信號調控具有很重要的意義[22]，盡管還需用試驗方法確認真正起作用的磷酸化位點，但這預示著后續(xù)可以從酪氨酸磷酸化位點入手研究CAⅣ的功能。

本研究利用生物信息學方法分析雞CAⅣ的氨基酸序列，研究結果將有利于對雞CAⅣ蛋白的功能進行深入研究，對進一步研究CAⅣ在母雞生殖道長期貯存精子中的作用及基因工程疫苗的制備具有重要的意義。