壓砂西瓜枯萎病生防木霉菌篩選及其拮抗機(jī)制研究

張麗榮，李　鵬，康萍芝，杜玉寧，陳　杭

(1.寧夏農(nóng)林科學(xué)院 植物保護(hù)研究所/寧夏植物病蟲害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750002；2.寧夏農(nóng)村能源工作站，寧夏 銀川 750002； 3.寧夏農(nóng)林科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究所，寧夏 銀川 750002)

壓砂瓜種植在寧夏已有百余年的歷史。砂田覆蓋栽培是寧夏中部干旱帶農(nóng)民經(jīng)過長期生產(chǎn)實(shí)踐創(chuàng)造出的一種獨(dú)特的旱作農(nóng)業(yè)栽培方式，主要集中分布在中衛(wèi)市南部干旱山區(qū)的香山鄉(xiāng)、興仁鎮(zhèn)及中寧喊叫水鄉(xiāng)等地區(qū)。截至目前，壓砂瓜種植面積已超過6.67萬hm2[ 1]。近年來隨著壓砂瓜栽培面積的不斷擴(kuò)大，壓砂后連片和連年種植單一品種，導(dǎo)致砂田土壤肥力降低，有害病原菌累積，土壤微生物群落單一，致使瓜類枯萎病、立枯病、疫病、猝倒病等土傳病害加劇發(fā)生，以種植9 a的連作地枯萎病發(fā)病尤為嚴(yán)重，病株率高達(dá)18%[2-3]，造成西瓜產(chǎn)量下降和品質(zhì)變劣，已成為限制壓砂瓜產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的瓶頸[4]。

西瓜枯萎病是由半知菌亞門真菌尖孢鐮刀菌西瓜?；?Fusariumoxysporumf.sp.niveum)侵染引起的一種維管束系統(tǒng)病害，也是西瓜生產(chǎn)上毀滅性的病害之一。由于特殊的壓砂地種植模式和砂地環(huán)境等客觀因素限制，傳統(tǒng)的輪作防病措施實(shí)施困難，生產(chǎn)上對枯萎病防治除選用抗病品種外[5-6]，化學(xué)防治仍是一種主要的手段[7-8]，然而長期不合理使用化學(xué)農(nóng)藥帶來農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染，致使病原菌產(chǎn)生耐藥性甚至抗藥性。木霉(Trichodermaspp.)是一類資源豐富且具有重要應(yīng)用價(jià)值的生防拮抗菌，能夠通過各種不同的機(jī)制抑制病原菌的生長，被普遍認(rèn)為是能夠替代多種化學(xué)農(nóng)藥的最具潛力的生防菌[9]，在植物病害生物防治中的應(yīng)用備受關(guān)注。目前利用木霉菌防治植物土傳病害已有大量研究報(bào)道[10-15]，但針對壓砂西瓜枯萎病的研究較少。鑒于此，以引起西瓜枯萎病的尖孢鐮刀菌為標(biāo)靶病原菌，通過對峙培養(yǎng)篩選出6株具有明顯拮抗作用的木霉菌，并對其發(fā)酵液抑菌活性及拮抗機(jī)制進(jìn)行研究，以期為壓砂西瓜土傳枯萎病的生物防治提供理論依據(jù)。

1　材料和方法

1.1　供試材料

病原菌：西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.niveum)WX8-1菌株從中衛(wèi)市香山鄉(xiāng)紅圈村的壓砂西瓜病株分離獲得，經(jīng)柯赫氏法則驗(yàn)證具有致病能力。

木霉菌：從中衛(wèi)市香山鄉(xiāng)壓砂不同作物根際土壤中分離獲得22株木霉菌。

培養(yǎng)基：菌株分離、純化及培養(yǎng)采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)；木霉發(fā)酵培養(yǎng)采用馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB)。

1.2　試驗(yàn)方法

1.2.1木霉對西瓜枯萎病菌的拮抗作用測定采用對峙培養(yǎng)法，將木霉菌與西瓜枯萎病菌在PDA平板上培養(yǎng)5 d后，分別用打孔器切取菌落邊緣直徑0.5 cm菌塊，同時(shí)對峙接種于PDA平板上相距5 cm的兩點(diǎn)上，以只接種病原菌作為對照，每處理重復(fù)3次。25 ℃恒溫培養(yǎng)，每日測量病原菌落生長半徑，觀察記錄木霉菌與病原菌落的相互作用情況，5 d后計(jì)算抑菌率并統(tǒng)計(jì)拮抗系數(shù)。抑菌率=(對照病原菌菌落半徑-木霉菌處理病原菌相向半徑)/對照病原菌菌落半徑×100%。拮抗系數(shù)分級標(biāo)準(zhǔn)[16 ]：Ⅰ.木霉菌絲占平皿的100%，病原菌落萎縮；Ⅱ.木霉菌絲占平皿的比例≥2/3，病原菌落萎縮；Ⅲ.木霉菌絲占平皿的比例<2/3，但≥1/3，病原菌停止生長；Ⅳ.木霉菌絲占平皿的比例<1/3，木霉菌停止生長；Ⅴ.病原菌菌絲占平皿的100%。

同時(shí)將木霉菌和病原菌在PDA平板上純培養(yǎng)，每日測量菌落生長直徑，計(jì)算生長速率，生長速率(cm/d)=菌落平均直徑/生長時(shí)間。

1.2.2木霉發(fā)酵液對西瓜枯萎病菌的抑制作用測定木霉菌發(fā)酵液的制備：木霉菌在PDA平板上培養(yǎng)5 d后，用無菌打孔器切取菌落邊緣直徑0.5 cm的菌塊，分別接種于PDB液體培養(yǎng)基中， 25 ℃、170 r/min搖床上振蕩培養(yǎng)7 d， 4 000 r/min離心6 min，用無菌6層紗布和0.22 μm微孔濾膜去除菌絲體，獲得木霉菌發(fā)酵液，備用。

木霉菌發(fā)酵液的抑菌效果測定：將木霉菌發(fā)酵液與PDA培養(yǎng)基(滅菌后冷卻至45 ℃)按1∶9比例混合后制成平板，用打孔器打取病原菌落邊緣直徑為0.5 cm的菌塊，接種于PDA平板中央，以不含木霉菌發(fā)酵液的PDA平板作為對照。每處理3次重復(fù)，25 ℃恒溫培養(yǎng)，5 d后測量病原菌落直徑，計(jì)算抑菌率。抑菌率=(對照病原菌菌落直徑-木霉菌處理后菌落直徑)/對照病原菌菌落直徑×100%。

1.2.3木霉揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對西瓜枯萎病菌的抑制作用測定采用對扣培養(yǎng)法，在培養(yǎng)皿的蓋和底上倒入PDA培養(yǎng)基制成平板，分別在皿蓋和底上接種直徑為0.5 cm的木霉菌和病原菌塊，兩皿對扣用封口膜密封，以不接木霉只接病原菌塊對扣作為對照。每處理重復(fù)3次， 25 ℃恒溫培養(yǎng)，5 d后測量病原菌落直徑，計(jì)算抑菌率。

1.2.4木霉非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對西瓜枯萎病菌的抑制作用測定采用圓盤濾膜法，在PDA平板上平鋪滅菌雙層硝酸纖維素膜，用無菌打孔器打取菌落邊緣直徑為0.5 cm的木霉菌塊，接入鋪有雙層硝酸纖維素膜的PDA平板中央，25 ℃恒溫培養(yǎng)，待木霉菌長滿培養(yǎng)皿前，用鑷子移去硝酸纖維素膜及附著的木霉菌塊，在PDA平板中央接入病原菌塊，以不含木霉菌代謝物的平板接種病原菌塊作為對照。每處理重復(fù)3次，每天觀察菌落生長情況，5 d后測量病原菌落直徑，計(jì)算抑菌率。

1.2.5木霉與西瓜枯萎病菌相互作用的顯微觀察通過對峙培養(yǎng)從6株木霉菌株中篩選出1株對西瓜枯萎病菌具有較強(qiáng)拮抗作用的菌株Ty3,挑取木霉菌與病原菌交界處菌絲，顯微鏡下觀察木霉菌與病原菌相互作用的方式。

1.3　數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2007軟件處理，利用DPS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，Duncan’s新復(fù)極差法檢驗(yàn)差異顯著性。

2　結(jié)果與分析

2.1　木霉對西瓜枯萎病菌的拮抗作用

經(jīng)對峙培養(yǎng)，從22個(gè)木霉菌株中篩選出6個(gè)對西瓜枯萎病菌具有明顯拮抗作用的菌株。對峙培養(yǎng)3 d，病原菌生長受到抑制，5 d后木霉逐漸包圍病原菌落，不僅能抑制病原菌的生長，并在其上生長、產(chǎn)孢，最后將病原菌落覆蓋(圖1)。由表1可看出，以木霉Ty3菌株抑菌率最高，其次為Ty2、Ty11菌株，對峙培養(yǎng)5 d后對枯萎病菌的抑菌率分別為83.29%、81.43%和79.58%，其拮抗系數(shù)均為Ⅰ級，其他3株木霉菌的抑菌率分別為76.92%、77.98%、78.77%，其拮抗系數(shù)為Ⅰ～Ⅱ級。將6株木霉菌和西瓜枯萎病菌單獨(dú)培養(yǎng)，以Ty3、Ty11菌絲生長速率最快，3 d后木霉菌布滿整個(gè)培養(yǎng)皿，其生長速率為3.09 cm/d，而西瓜枯萎病菌(WX8-1)生長速率為1.47 cm/d，可以看出木霉具有較強(qiáng)的空間競爭力和營養(yǎng)競爭力。

木霉菌株生長速率/(cm/d)病原菌落半徑/cm抑菌率/%拮抗系數(shù)Ty23.040.70cdBC81.43abABⅠTy33.090.63dC83.29aAⅠTy63.010.80bcBC78.77bcABⅠTy82.630.87bBC76.92cCⅡTy113.090.77bcBC79.58abcABⅠTy182.860.83bcBC77.98bcABⅡCK1.473.77aA

注：同列不同大、小寫字母分別表示在0.01、0.05水平上差異顯著，下同。

2.2　木霉發(fā)酵液對西瓜枯萎病菌的抑制作用

由表2可看出，6株木霉菌發(fā)酵液對病原菌絲生長均有不同程度的抑制作用，其中Ty3菌株抑菌率最高，為84.57%，其次為Ty11、Ty6菌株，抑菌率分別為81.89%、80.31%，其他3株木霉菌株的抑菌率分別為76.69%、77.64%、78.74%。

2.3　木霉揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對西瓜枯萎病菌的抑制作用

由表3可看出，6株木霉菌產(chǎn)生的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對病原菌絲生長具有一定的抑制作用。以Ty3、 Ty11菌株對病原菌絲的抑制效果最好，抑菌率分別為59.83%和56.53%，其次為Ty6木霉菌株，抑菌率為54.52%，Ty8、Ty2 菌株抑菌率分別為50.79%、50.22%，以Ty18菌株的抑菌率最低，為48.78%。

表2　6株木霉菌發(fā)酵液對西瓜枯萎病菌的抑制效果

表3　6株木霉菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對西瓜枯萎病菌的抑制效果

2.4　木霉非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對西瓜枯萎病菌的抑制作用

由表4可看出，6株木霉非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對病原菌菌絲生長均具有明顯的抑制作用，以Ty3菌株抑菌作用最強(qiáng)，抑菌率為90.60%，其次為Ty11菌株，抑菌率為89.10%，Ty8菌株的抑菌率最低，為62.99%，其他3株木霉的抑菌率分別為78.36%、84.63%、87.61%。

表4　6株木霉菌非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對西瓜枯萎病菌的抑制效果

2.5　木霉對西瓜枯萎病菌的作用方式

挑取木霉與病原菌絲交界處在顯微鏡下觀察，木霉菌絲可附著或寄生于病原菌菌絲上,吸取菌絲營養(yǎng),使病原菌菌絲變形、斷裂、消解，從而使病原菌菌絲停止生長(圖2)。

圖2　木霉對西瓜枯萎病菌的作用方式觀察結(jié)果

3　結(jié)論與討論

木霉菌作為一類非常重要的生防菌，能夠拮抗多種病原真菌，尤其對土傳病原真菌具有顯著的拮抗作用。姚彥坡等[17]研究結(jié)果表明，木霉屬5個(gè)菌株與草坪鐮刀枯萎病菌對峙培養(yǎng),以哈茨木霉2的拮抗作用最強(qiáng)，其他4個(gè)木霉菌株對草坪鐮刀枯萎病菌也表現(xiàn)出較好的抑制效果。劉愛榮等[18]研究結(jié)果表明，供試的7株哈茨木霉菌與黃瓜枯萎病菌對峙培養(yǎng)6 d，其中TG菌株對枯萎病菌的抑菌率最高，拮抗系數(shù)為Ⅰ～Ⅱ級，TM菌株次之，另有3株木霉與病原菌呈對峙生長。本試驗(yàn)采用平板對峙培養(yǎng)法，從分離的22株木霉菌中篩選出6株對西瓜枯萎病菌具有明顯拮抗作用的菌株，其中以Ty3菌株的拮抗作用最強(qiáng)，抑菌率為83.29%；通過進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，其發(fā)酵液、產(chǎn)生的揮發(fā)性和非發(fā)揮性代謝產(chǎn)物對西瓜枯萎病菌也具有較好的抑菌效果，抑菌率分別為84.57%、59.83%和90.60%。該菌株可作為壓砂西瓜枯萎病生物防治的拮抗菌加以開發(fā)利用。

許多研究發(fā)現(xiàn)，在室內(nèi)篩選出的拮抗木霉菌在田間的防治效果不夠穩(wěn)定。目前生產(chǎn)上使用的木霉菌劑多為活孢子制劑，向土壤中釋放的活體菌種易受各種自然環(huán)境因素的干擾[19]，從而影響木霉在土壤中的定殖存活。本試驗(yàn)研究了6株木霉對西瓜枯萎病菌的拮抗作用，并篩選出對病原菌具較強(qiáng)抑制作用的木霉菌株Ty3，但有關(guān)其在西瓜根圍定殖和對環(huán)境適應(yīng)能力以及田間的生防效果，還有待進(jìn)一步探討和研究。