馬鈴薯M病毒微滴數(shù)字PCR檢測方法的建立

劉　晗，黃潔芳，向　均，燕照玲，張永江*

(1.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院，北京 100176； 2.吳江出入境檢驗檢疫局，江蘇 吳江 215200；3.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)與信息研究所，河南 鄭州 450002)

馬鈴薯M病毒(Potato virus M, PVM)是乙型線形病毒科(Betaflexviridae)香石竹潛隱病毒屬(Carlavirus)的成員，為正單鏈RNA病毒[1]。PVM主要侵染茄科植物，是馬鈴薯上最常見的病毒之一，極易通過塊莖傳遞給后代，導(dǎo)致馬鈴薯出現(xiàn)葉片斑駁、花葉、卷葉以及植株發(fā)育遲緩等癥狀[2]，造成10%～18%的產(chǎn)量損失；與其他馬鈴薯病毒共同侵染時，可導(dǎo)致馬鈴薯減產(chǎn)20%～30%[3]?？焖贉?zhǔn)確的檢測PVM對馬鈴薯病毒病的防控具有重要的意義[4]，目前用于PVM檢測的方法主要有生物學(xué)測定、血清學(xué)測定、顯微鏡觀察、核酸雜交及PCR技術(shù)等[5-8]。生物學(xué)以及血清學(xué)方法的檢測靈敏度相對較低，耗時長且工作量大[2,9-10]；顯微鏡觀察需要使用電鏡，而電鏡的成本太高從而阻礙了該技術(shù)的應(yīng)用[11-12]；目前使用較多的技術(shù)是核酸雜交及PCR技術(shù)，提高PCR技術(shù)的靈敏度對于馬鈴薯病毒檢測具有重要意義[13-14]。

微滴數(shù)字PCR(Droplet digital PCR, ddPCR)是一種新的高精準(zhǔn)核酸絕對定量檢測技術(shù)[15]。其工作原理是在傳統(tǒng)PCR擴(kuò)增體系的基礎(chǔ)上，將一個大的擴(kuò)增體系分割為多個微滴，不同模板分隔在不同油包水的微滴中，且每個微滴都作為一個獨立的PCR體系。PCR反應(yīng)結(jié)束后，用微滴分析儀檢測每個微滴的熒光信號，出現(xiàn)熒光信號的微滴記錄為1，未檢測到熒光信號的微滴則記錄為0。根據(jù)泊松分布的原理以及出現(xiàn)熒光信號的微滴個數(shù)與比例，即可得出靶分子的起始濃度，從而實現(xiàn)靶分子的絕對定量。ddPCR目前已應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因、地溝油及病原微生物等的檢測[16-20]，但在植物病毒檢測方面的應(yīng)用還很少。本研究將該技術(shù)用于PVM的檢測，建立了PVM的高精準(zhǔn)ddPCR檢測方法，為我國馬鈴薯病毒提供更加靈敏的檢測技術(shù)。

1　材料和方法

1.1　材料

PVM侵染的馬鈴薯葉片、馬鈴薯X病毒(Potato virus X,PVX)侵染的煙草葉片、馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)侵染的煙草葉片、煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)侵染的煙草葉片和黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)侵染的黃瓜葉片樣品均由中國檢驗檢疫科學(xué)研究院保存。

所用主要試劑包括：植物總RNA提取試劑盒(離心柱型，DP432，TIANGEN)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM(Perfect Real Time，RR037A，Takara)、一步法RT-PCR試劑盒(PrimeScriptTM，RR055A，Takara)、一步法實時熒光RT-PCR試劑盒(Perfect Real Time，RR064A，Takara)和數(shù)字PCR Master Mix(Bio-Rad)。

主要試驗儀器包括：實時熒光PCR儀(Roche LightCycler 480Ⅱ)、Bio-Rad數(shù)字PCR反應(yīng)系統(tǒng)(Bio-Rad QX200)、PCR儀(ABI Veriti96)。

1.2　引物和探針

根據(jù)NCBI上PVM 外殼蛋白(CP)基因序列(登錄號：NC_001361.2)，設(shè)計引物、探針(表1)，在NCBI上比對驗證后送往Invitrogen公司合成。

表1　PVM檢測引物及探針序列

1.3　試驗方法

1.3.1樣品總RNA提取按照植物總RNA提取試劑盒說明書提取PVM、PVX、PVY、TMV、CMV陽性材料及陰性對照(健康葉片)的總RNA，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2PVM樣品的RT-PCR檢測以田間采集的感病馬鈴薯葉片樣品提取的總RNA作為模板，用一步法RT-PCR試劑盒進(jìn)行PVM的檢測。設(shè)置空白對照(BC)，以RNase Free dH2O作為模板。檢測體系為：Enzyme mix 2 μL，Buffer 25 μL，PVM-F(10 μmol/L)2 μL，PVM-R(10 μmol/L) 2 μL，模板2 μL，以RNase Free H2O補齊至50 μL。

反應(yīng)程序為：50 ℃ 30 min；95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，54 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35 個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

RT-PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物與1 μL 6×溴酚藍(lán)上樣緩沖液混勻，點入1.5%的瓊脂糖凝膠樣孔內(nèi)；以5 μL DNA Marker(DL2000)作為分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；用1×TAE緩沖液在100 V電壓下電泳30 min。電泳結(jié)束后，將整個凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)上拍照記錄結(jié)果。

1.3.3實時熒光RT-PCR檢測使用一步法實時熒光RT-PCR試劑盒進(jìn)行試驗，反應(yīng)體系為：2×One Step RT-PCR Buffer 10 μL，TaKaRa ExTaqHS 0.4 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix 0.4 μL，PVM-dF(10 μmol/L)0.8 μL，PVM-dR(10 μmol/L)0.8 μL，PVM-dP(10 μmol/L)0.4 μL，模板1 μL，加RNase Free dH2O補齊至20 μL。設(shè)置陰性對照(NC)和空白對照(BC)，分別以健康馬鈴薯葉片提取的總RNA和RNase Free dH2O作為模板。反應(yīng)條件為：42 ℃ 5 min； 95 ℃ 5 s；95 ℃ 5 s，58 ℃ 20 s，40個循環(huán)。

將加入反應(yīng)體系的PCR管放置于實時熒光PCR儀中按反應(yīng)條件進(jìn)行反應(yīng)，儀器收集熒光信號；反應(yīng)結(jié)束后由實時熒光PCR儀自帶軟件對熒光信號進(jìn)行結(jié)果分析并繪制擴(kuò)增曲線；根據(jù)不同引物探針組檢測PVM時是否產(chǎn)生擴(kuò)增曲線來判斷擴(kuò)增效果的優(yōu)劣。

1.3.4ddPCR檢測(1)逆轉(zhuǎn)錄：按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書，用PVM-dR將樣品RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，陰性對照(NC)和空白對照(BC)分別以健康馬鈴薯葉片提取的總RNA和RNase Free dH2O作為模板。

(2)體系配制：總體積為20 μL，包括：2×SuperMix 10 μL，PVM-dF及PVM-dR(濃度均為10 μmol/L)各0.8 μL，探針PVM-dP(10 μmol/L)0.4 μL，cDNA模板 2 μL，加入超純水補齊至20 μL。

(3)微滴生成：將配制完的體系轉(zhuǎn)移至微滴生

成卡的體系加樣孔中，并在反應(yīng)用油加樣孔中加入70 μL的ddPCR反應(yīng)用油；加樣完成后，將微滴生成卡轉(zhuǎn)移至微滴生成器中，啟動儀器生產(chǎn)微滴；微滴生成結(jié)束后，將微滴體系轉(zhuǎn)移至96孔板中，封膜。

(4)擴(kuò)增：將96孔板置于PCR儀中，PCR擴(kuò)增程序為：50 ℃ 5 min；95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，58 ℃ 60 s，40個循環(huán)。

(5)數(shù)據(jù)讀取：擴(kuò)增結(jié)束后，將96孔板取出，置于微滴讀取儀中讀取微滴數(shù)；通過FAM單通道熒光收集單個微滴熒光信號，熒光采集后，通過分析熱點圖確定熒光閾值限以判斷陰性微滴和陽性微滴；根據(jù)是否產(chǎn)生陽性微滴，判斷檢測特異性與靈敏度。

2　結(jié)果與分析

2.1　PVM樣品的RT-PCR檢測

采集田間的馬鈴薯葉片樣品進(jìn)行PVM特異性RT-PCR檢測，結(jié)果如圖1所示，可以擴(kuò)增到416 bp大小的條帶，與預(yù)期目的條帶大小一致。將測序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行比對，與已登錄PVM序列同源性最高達(dá)99%，進(jìn)一步證實了特異性擴(kuò)增的結(jié)果。經(jīng)驗證的樣品用于后續(xù)ddPCR方法的建立。

M:DL2000 Marker; 1、2:PVM樣品; 3:BC

2.2　引物和探針篩選

以實時熒光RT-PCR對設(shè)計的3組引物探針進(jìn)行篩選，每組引物探針設(shè)置2個重復(fù)，結(jié)果如圖2。

1:引物探針組G1; 2:引物探針組G2; 3:引物探針組G3; 4:BC

引物探針組G1的擴(kuò)增效率最高，擴(kuò)增曲線出現(xiàn)最早，G2次之，G3基本沒有擴(kuò)增。因此，選用G1組引物探針進(jìn)行后續(xù)試驗。

2.3　ddPCR特異性分析

以5種可侵染馬鈴薯的病毒 (PVM、PVX、PVY、TMV、CMV)的總RNA為模板，對設(shè)計的ddPCR探針引物進(jìn)行特異性驗證，結(jié)果如圖3所示。陽性微滴信號(閾值線以上)與陰性微滴信號(閾值線以下)區(qū)分明顯；只有PVM能夠產(chǎn)生陽性微滴信號，其他4種病毒、陰性及空白對照無陽性微滴信號產(chǎn)生，與預(yù)期結(jié)果相符。以同一套引物探針對上述5種病毒及2種對照進(jìn)行實時熒光RT-PCR檢測，結(jié)果如圖4所示，只有PVM出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，其他樣品均無擴(kuò)增曲線產(chǎn)生。ddPCR方法的結(jié)果與實時熒光RT-PCR結(jié)果一致，表明所建立的ddPCR方法特異性良好。

A09、B09: PVM; C09、D09: PVX; E09、F09: PVY; G09、H09: TMV; A08、B08: CMV; C08:NC; D08: BC

1: PVM; 2: PVX; 3: PVY; 4: TMV; 5: CMV; 6: NC; 7: BC

2.4　ddPCR靈敏度分析

將PVM的總RNA(質(zhì)量濃度為57 ng/μL)進(jìn)行10倍梯度稀釋后用作模板，進(jìn)行ddPCR方法靈敏度分析，結(jié)果如圖5所示。在107倍稀釋時，仍可檢測到陽性微滴信號，其檢測閾值為5.7 fg/μL。而在實時熒光RT-PCR檢測中，能獲得熒光信號的模板最大稀釋倍數(shù)為105(圖6)。表明前者靈敏度比后者高100倍。

A02、B02：105倍稀釋；C02、D02：106倍稀釋；E02、F02：107倍稀釋；G02、H02：108倍稀釋；C03：NC; D03：BC

1—6：分別為102～107倍梯度稀釋；7：NC；8：BC

3　結(jié)論與討論

隨著馬鈴薯加工業(yè)的不斷發(fā)展，市場上對馬鈴薯的需求持續(xù)增長，馬鈴薯的經(jīng)濟(jì)重要性日漸突出，但病毒的侵染導(dǎo)致馬鈴薯產(chǎn)量及質(zhì)量的下降嚴(yán)重影響了馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[21]。目前已經(jīng)報道的馬鈴薯病毒種類高達(dá)30余種，且通?；旌锨秩炯闹?，尤其是PVM，常與其他病毒混合侵染馬鈴薯，從而導(dǎo)致更大的損失[22]。因此，建立能夠有效區(qū)分馬鈴薯上多種病毒的特異性檢測方法至關(guān)重要。本研究通過設(shè)置均能侵染馬鈴薯的5種病毒、陰性對照及空白對照，對建立的ddPCR方法進(jìn)行特異性分析，并通過實時熒光RT-PCR方法對分析結(jié)果進(jìn)行驗證，兩者結(jié)果一致，僅在攜帶PVM的樣品中檢測到信號，而其他反應(yīng)體系均未檢測到信號。說明建立的ddPCR方法具有良好的特異性。

ddPCR技術(shù)將反應(yīng)體系縮小，通過對每個微滴進(jìn)行檢測，大大提高了檢測的靈敏度。在本研究中，對同一PVM樣品的分析結(jié)果顯示，ddPCR比實時熒光RT-PCR檢測靈敏度高100倍，與ddPCR能夠提高檢測靈敏度的相關(guān)報道一致[23]。同時，ddPCR檢測PVM的試驗過程中無需構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而大大縮短了試驗周期。另外，實時熒光RT-PCR只能實現(xiàn)樣品的相對定量，而ddPCR能夠?qū)崿F(xiàn)樣品的絕對定量[17,24-25]。從這3個方面來看，ddPCR檢測PVM比實時熒光RT-PCR具有更大的優(yōu)勢。

我國已在黑龍江、四川、河南、云南以及青海地區(qū)的馬鈴薯上檢測到PVM，不同地區(qū)PVM的序列存在差異[26]。本研究根據(jù)已經(jīng)報道的PVM外殼蛋白基因保守核苷酸序列設(shè)計用于檢測的引物、探針，并在NCBI中進(jìn)行了保守性比對驗證，從而大大降低了由于不同PVM分離物序列差異造成的假陰性結(jié)果出現(xiàn)的可能性，能夠有效提高檢測的準(zhǔn)確性。為了增加方法的實用性，本研究直接采用田間的馬鈴薯葉片為樣本來建立ddPCR檢測方法，試驗結(jié)果顯示，建立的ddPCR方法可特異靈敏地檢測田間樣品中的PVM，表明建立的方法具有較強(qiáng)的實用性，為馬鈴薯生產(chǎn)中PVM的防治奠定了基礎(chǔ)，同時也為馬鈴薯及其產(chǎn)品的進(jìn)出口檢疫提供更為靈敏的檢測技術(shù)。