玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆及其表達(dá)載體構(gòu)建

曹路遙，周　巖*，魏琦超，陳燕繪，陳亞東，2，藺一帆，田瑞婷

(1.河南科技學(xué)院 生命科技學(xué)院/現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.河南省華隆生物技術(shù)有限公司，河南 新鄉(xiāng) 453003)

光合作用是地球碳-氧平衡的重要媒介，是植物賴以生存的基礎(chǔ)，也是決定作物產(chǎn)量高低的重要因素之一。作物中 90%以上的干質(zhì)量來源于光合作用，但是農(nóng)作物的光能利用效率比較低，目前高產(chǎn)的稻麥類作物的光能利用率僅為 1%～1.5%[1]，因此，改善作物的光合性能從而提高作物的生物產(chǎn)量成為作物遺傳改良的研究重點(diǎn)。

有研究發(fā)現(xiàn)，在C3植物中導(dǎo)入C4光合途徑中的關(guān)鍵酶，有提高C3植物葉片光合效率的作用，進(jìn)而可以使產(chǎn)量增加[2-4]。C4光合途徑中有許多酶的參與，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)是其中的一個關(guān)鍵酶，該酶不僅可以通過固定大氣中的CO2為植物光合作用提供碳源，還可以回補(bǔ)三羧酸循環(huán)的草酰乙酸和蘋果酸，促進(jìn)N素同化，協(xié)調(diào)細(xì)胞的代謝活動，調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)的離子平衡和pH值[5]。

目前，該基因不僅從不同C4植物中克隆出來，并且已經(jīng)利用重組DNA技術(shù)成功導(dǎo)入到水稻、油菜、小麥、馬鈴薯等C3植物中，取得了一定的研究進(jìn)展[6-10]。Ku等[11]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功將玉米的pepc基因?qū)氲剿局腥ィ@得了轉(zhuǎn)pepc基因水稻，其光合生理性狀和種子的產(chǎn)量都得到提高。張艷等[12]將高粱C4型全長pepc基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入大豆中，獲得了轉(zhuǎn)基因植株，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)T0代植株和T1代植株的凈光合速率較對照相比分別提高了37.4%和20.7%，且凈光合速率增幅越大則單株產(chǎn)量增加也越多。馬宏敏[13]以轉(zhuǎn)甘蔗pepc基因的秈稻植株和非轉(zhuǎn)基因的植株為研究材料，發(fā)現(xiàn)在光合效率和產(chǎn)量相關(guān)性狀方面，轉(zhuǎn)甘蔗pepc基因植株都有較大提高，可以實(shí)現(xiàn)增產(chǎn)目的。張桂芳等[14]首次將含有稗草根型的pepc基因?qū)λ具M(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因水稻的PEPC活性最高,為對照的 5.85 倍，植株葉片的凈光合速率(Pn)較對照相比提高了20.00%。尹吳等[15]發(fā)現(xiàn)，與對照相比，轉(zhuǎn)玉米pepc基因的楊樹表現(xiàn)出較強(qiáng)的光利用能力，其羧化能力和酶活性與對照相比最高可分別增加62.3%和38.6%。吳瓊等[16]發(fā)現(xiàn)，與對照周麥19相比，轉(zhuǎn)玉米pepc基因的小麥在單穗質(zhì)量、千粒質(zhì)量、收獲指數(shù)等方面得到顯著提高。

表達(dá)載體構(gòu)建的方法有很多，例如傳統(tǒng)酶切連接法、一步克隆法等。傳統(tǒng)載體構(gòu)建的方法是利用多克隆位點(diǎn)，經(jīng)過限制性內(nèi)切酶和連接酶構(gòu)建載體，中間需要一系列的酶切、連接、轉(zhuǎn)化、回收工作，此種方法雖然簡便，但是比較繁瑣，且費(fèi)時費(fèi)力，不適合構(gòu)建長片段、多片段拼接的復(fù)雜載體。另外，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因序列較長，即使克隆成功，也不容易連入表達(dá)載體[17]。Gateway克隆技術(shù)是Invitrogen公司開發(fā)的一套分子克隆新技術(shù)，主要通過運(yùn)用BP和LR 2個重組反應(yīng)來構(gòu)建載體，首先需要把目的基因?qū)氲饺腴T載體(Entry Vector)上，然后就可以不用限制性內(nèi)切酶，單靠重組酶和載體上的特定重組位點(diǎn)就可以快速高效地將目的基因克隆到Gateway目標(biāo)載體(Destination Vector)上。由于Gateway克隆技術(shù)的適應(yīng)性、高效性和兼容性等特點(diǎn)，使得該技術(shù)成為最廣泛應(yīng)用和效率最高的重組克隆技術(shù)[18]。本研究利用同源克隆和RT-PCR技術(shù)從玉米自交系品種 ZD410 中成功克隆出C4途徑關(guān)鍵酶pepc基因的cDNA全長，并對其氨基酸序列進(jìn)行同源性檢索分析，證實(shí)其屬于PEPC大家族；利用Gateway克隆技術(shù)成功構(gòu)建了含pepc目的基因的表達(dá)載體 pEXPR-PEPC；通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花絮浸染法對模式植物擬南芥進(jìn)行轉(zhuǎn)化，經(jīng)PCR及RT-PCR檢測，初步證實(shí)獲得27株轉(zhuǎn)pepc基因陽性植株。并對pepc基因克隆和載體構(gòu)建中存在的問題進(jìn)行討論，以期為C4途徑關(guān)鍵酶pepc基因的高表達(dá)克隆載體的構(gòu)建及農(nóng)作物的高光效基因工程育種和抗逆性育種研究提供參考。

1　材料和方法

1.1　供試材料

1.1.1植物材料供試植物材料為玉米自交系品種 ZD410(河南科技學(xué)院生命科學(xué)院陳士林教授提供)、野生型擬南芥(ArabidopsisthalianaL，河南科技學(xué)院作物基因組學(xué)與遺傳改良實(shí)驗室保存)，本研究試驗材料均種植于光照培養(yǎng)箱(16 h 12 000 lx 光照和 8 h 黑暗)。

1.1.2菌株及質(zhì)粒pEASY-Blunt Zero 克隆載體和 Trans1-T1 Phage Resistant Chemically 感受態(tài)細(xì)胞均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，Gateway 入門載體 pENTR-VIR、表達(dá)載體pDEST-COT及農(nóng)桿菌菌株GV3101pMP90均由本中心實(shí)驗室保存。

1.1.3主要試劑植物總 RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒以及膠回收試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司；KAPA HiFi HotStart DNA Polymerase 購自 Kapa Biosystems 公司；Taq DNA Polymerase 購自天根生化科技(北京)有限公司；NotⅠ-HF、XmaⅠ、T4 DNA聚合酶均購自 NEB 公司；Gateway LR Clonase Ⅱ enzyme mix 購自 Invitrogen 公司；引物合成和測序由上海立菲生物技術(shù)有限公司(北京)完成；其他試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.2　試驗方法

1.2.1玉米葉片總RNA的提取和cDNA的合成取0.1 g新鮮的幼嫩玉米葉片迅速置于液氮中研磨，按照TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit說明書提取玉米葉片總RNA；以總RNA為模板，按TaKaRa PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，產(chǎn)物于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的全長克隆根據(jù)NCBI網(wǎng)站上已發(fā)表的玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因的cDNA 全長序列(登錄號：AY103747)，運(yùn)用軟件 Primer 5.0 設(shè)計 PEPC 全長特異性引物、β-actin內(nèi)參引物。

pepc:5-CGCTTCCGTGCTTAGCTTCCCG-3,

5-GAGAAGCCGCCTAGCCAGTGTT-3;

β-actin:5-ATGTTTCCTGGGATTGCCGAT-3,

5-CCAGTTTCGTCATACTCTCCCTTG-3。

以 cDNA 為模版進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)， 25 μL 反應(yīng)體系如下：PCR grade water 15.25 μL、5×KAPA HiFi Fidelity 5.00 μL、10 mmol/L dNTP Mix 0.75 μL、上下游引物(10 μmol/L)各0.75 μL、cDNA模板2.00 μL、KAPA HiFi HotStart DNA Polymerase 0.50 μL。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性20 s；61 ℃復(fù)性15 s；72 ℃延伸3 min；總共32個循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，目的條帶用 TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit 切膠回收，連接 pEASY-Blunt Zero 克隆載體，轉(zhuǎn)化 Trans1-T1 Phage Resistant Chemically 感受態(tài)細(xì)胞，待抗性平板上長出菌落后挑單菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，提質(zhì)粒后進(jìn)行 PCR 檢測，陽性菌液送去測序。

1.2.3植物表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

1.2.3.1構(gòu)建含pepc目的基因的入門載體在全長pepc基因兩側(cè)分別引入NotⅠ和XmaⅠ酶切位點(diǎn)，重新構(gòu)建含NotⅠ和XmaⅠ酶切位點(diǎn)的目的基因質(zhì)粒(命名為pEASY-PEPC)，pEASY-PEPC和pENTR-VIR分別用NotⅠ和XmaⅠ雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收pEASY-PEPC的3 000 bp目的條帶和原入門載體pENTR-VIR4 000 bp條帶，用T4 DNA聚合酶連接即成為新的入門載體，重新命名為pENTR-PEPC(圖1)。

圖1　玉米pepc基因入門載體構(gòu)建示意

1.2.3.2利用Gateway克隆技術(shù)構(gòu)建含目的基因的表達(dá)載體將測序正確的重組質(zhì)粒pENTR-pepc和保存菌種pDEST-cot進(jìn)行LR反應(yīng)，得到表達(dá)載體pEXPR-pepc。5 μL反應(yīng)體系如下：滅菌ddH2O 1.30 μL、pENTR-pepc質(zhì)粒DNA 1.25 μL、pDEST-cot質(zhì)粒DNA 0.45 μL、TE buffer(pH值8.0)1.00 μL、Gateway LR Clonase Ⅱ enzyme mix 1.00 μL。在微型離心管中加入上述液體，輕微混合后，置于恒溫金屬浴上25 ℃反應(yīng)1 h，然后向混合液中加入1 μL Proteinase K solution，置于恒溫金屬浴上37 ℃反應(yīng)10 min，得到重組表達(dá)載體pEXPR-pepc(圖2)。

圖2　pepc全長基因表達(dá)載體構(gòu)建示意

1.2.3.3重組表達(dá)載體pEXPR-pepc的分子生物學(xué)檢測以重組質(zhì)粒pEXPR-pepc為模板，用含酶切位點(diǎn)的pepc全長目的基因檢測引物鑒定重組子，陽性重組子送去測序。

1.2.4重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101pMP90感受態(tài)細(xì)胞及鑒定取1 μL測序鑒定正確的pEXPR-pepc重組質(zhì)粒加入100 μL GV3101pMP90感受態(tài)，冰浴30 min；然后置于-70 ℃冰箱冷凍10 min；42 ℃水浴熱激90 s；冰浴2 min；在超凈工作臺中加500 μL不添加任何抗生素的YEB 液體培養(yǎng)基，180 r/min 28 ℃復(fù)蘇3 h；將復(fù)蘇后的菌液均勻涂布于含有 Kan、Rif和Gent(終質(zhì)量濃度都為50 mg/L)的 LB 固體培養(yǎng)基上，37 ℃過夜倒置培養(yǎng)；菌落出現(xiàn)后，挑單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)并進(jìn)行 PCR 檢測。

1.2.5農(nóng)桿菌介導(dǎo)的擬南芥轉(zhuǎn)化

1.2.5.1農(nóng)桿菌浸染液的制備挑取單菌落接種于10 mL含相應(yīng)抗生素的YEB 培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，再次加入100 mL YEB，在相同條件下培養(yǎng)到OD600值大于或等于1；將培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌菌液4 000 r/min離心15 min，沉淀用制備好的懸浮液懸浮，調(diào)整OD600到0.8～1.0。懸浮液配方如下(500 mL)：MSB5 1.1 g、蔗糖25 g、6-BA 2.5 μL(2 mg/mL)、Silwet L-77 100 μL，調(diào)整pH值到5.7。

1.2.5.2花序浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥在進(jìn)行轉(zhuǎn)化的前一天將擬南芥用營養(yǎng)液澆透，選取同一時期花蕾較多的擬南芥進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化時將野生型擬南芥的所有花序放入制備好的農(nóng)桿菌浸染液中浸泡30 s；然后將花盆側(cè)放到鋪有濕潤報紙的塑料托盤上；用黑色塑料袋對其進(jìn)行遮光保濕16 h；后轉(zhuǎn)移至光照培養(yǎng)箱中恢復(fù)至正常培養(yǎng)；1周后觀察植株長勢，可對生長強(qiáng)壯的植株重復(fù)進(jìn)行一次轉(zhuǎn)化，以提高轉(zhuǎn)化率；轉(zhuǎn)化5～6周后，為了加速擬南芥種子的成熟可適量少澆營養(yǎng)液，待植株枯黃以后，即可收取種子。

1.2.5.3轉(zhuǎn)pepc基因的擬南芥陽性植株的篩選將收獲的T1代擬南芥種子放入50 mL離心管中，加入適量滅菌的0.1%的瓊脂糖，均勻混合后放入4 ℃冰箱春化 2～3 d；將春化后的種子混合液用移液槍吸取，均勻滴至營養(yǎng)基質(zhì)上(丹麥營養(yǎng)土、蛭石1∶)，放入光照培養(yǎng)箱進(jìn)行正常培養(yǎng)；對長出4片真葉的幼苗先用10 000倍Basta溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%)均勻噴灑植株葉片，間隔1周左右再用5 000倍Basta溶液噴灑2遍；待擬南芥植株抽薹以后，對具有Basta抗性的植株葉片進(jìn)行PCR檢測。

1.2.5.4轉(zhuǎn)pepc基因的擬南芥陽性植株的PCR檢測跨啟動子和目的基因序列設(shè)計檢測引物，對經(jīng)過 3 遍Basta溶液篩選后仍能正常生長的擬南芥植株葉片組織直接進(jìn)行PCR鑒定。詳細(xì)引物信息及擴(kuò)增體系如下：

NJS：5-CCTACACGCTGAAGCGGATAAGG-3,

NJA：5-TTATTAGTTCGCCGCTCGGTGTGTCG-3。

20 μL反應(yīng)體系如下：滅菌ddH2O 7.60 μL、2×Phire Plant PCR Buffer 10.00 μL、上下游引物(10 μmol/L)各1.00 μL、Phire Hot Start Ⅱ DNA Polymerase 0.40 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性5 s；58 ℃復(fù)性10 s；72 ℃延伸25 s；總共40個循環(huán)；72 ℃再延伸1 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.2.5.5轉(zhuǎn)pepc基因的擬南芥陽性植株的RT-PCR檢測根據(jù)全長基因序列設(shè)計檢測引物，對PCR檢測的擬南芥陽性植株提取植物總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進(jìn)行RT-PCR鑒定。詳細(xì)引物信息及擴(kuò)增體系如下：

NJS1：5-TCGTCTTCACCGCGCATCCCAC-3,

NJA1：5-CACGCCCTTCCATACAGTCTCA-3。

25 μL反應(yīng)體系如下：滅菌ddH2O 19.50 μL、10×TaqBuffer 2.50 μL、dNTP Mixture 0.50 μL、上下游引物(10 μmol/L)各0.50 μL、DNA Polymerase 0.50 μL、樣品 1 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s,55 ℃復(fù)性30 s,72 ℃延伸1 min,總共32個循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

2　結(jié)果與分析

2.1　葉片總RNA及目的基因RT-PCR產(chǎn)物檢測

玉米葉片總RNA采用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，結(jié)果表明(圖3),提取的葉片總RNA明顯可見28S和18S 2條帶，帶型清晰，完整性良好，紫外分光光度計檢測OD260/280在1.8～2.1。以 cDNA為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示,在3 kb左右處有1條亮帶，與預(yù)期片段長度一致(圖4)。

圖3　玉米葉片總RNA的凝膠電泳結(jié)果

M：Marker DL5000(下同)； 1：β-actin 750 bp； 2：PCR products圖4　玉米pepc cDNA的PCR產(chǎn)物電泳分析

2.2　回收全長目的基因轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞及陽性菌落的PCR檢測

切膠回收全長目的基因RT-PCR產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化Trans1-T1 Phage Resistant Chemically感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化后的菌液均勻涂布在含有Amp的平板上，37 ℃過夜倒置培養(yǎng)，有白色菌落出現(xiàn)(圖5)。從LB平板上挑取白色單菌落轉(zhuǎn)移到含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中，200 r/min、37 ℃過夜擴(kuò)大培養(yǎng)，提質(zhì)粒后(圖6)，以質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR鑒定。如圖7所示質(zhì)粒PCR產(chǎn)物大小與目的片段大小一致，初步斷定為目的基因重組子，將重組質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果正確的菌液送去測序，以確定全長目的基因序列。

圖5　LB固體培養(yǎng)基上的玉米pepc重組子

圖6　重組質(zhì)粒的電泳分析

圖7　重組質(zhì)粒的PCR電泳

2.3　玉米pepc全長基因克隆序列分析

測序結(jié)果顯示，玉米pepc基因全長cDNA序列為2 952 bp，包括完整的開放閱讀框2 913 bp，共編碼970個氨基酸，此外還包括5′非編碼區(qū)序列 29 bp和3′非編碼區(qū)序列13 bp；用 ProtParam(physico-chemical parameters of a protein sequences，http://web.expasy.org/protparam/)在線程序?qū)υ撔蛄羞M(jìn)行分析，結(jié)果表明，該基因分子質(zhì)量約為 108.179 ku，分子式為 C4675H7304N1344O1547S34，PI為5.73，不穩(wěn)定系數(shù)為37.19，脂肪系數(shù)為46.66；其含量較高的氨基酸有Thr(15.9%)、Glu(8.2%)、Ala(7.3%)、Arg(6.9%)、Gly(6.8%)；對該蛋白質(zhì)進(jìn)行疏水性分析，顯示出該P(yáng)EPC蛋白質(zhì)具有較強(qiáng)的親水性；跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示該蛋白質(zhì)不存在跨膜區(qū)。

運(yùn)用 NCBI 上的 BLast軟件對其氨基酸序列進(jìn)行同源性檢索分析，在多個數(shù)據(jù)庫中顯示檢索的序列大多為pepc基因，且具有極高的同源性。篩選出幾種典型C4植物的pepc基因氨基酸序列，用DNAMan軟件對其進(jìn)行多序列比對分析。其中氨基酸序列同源性由高到低依次是甘蔗(Saccharumofficinarum)、高粱(Sorghumvalgare)、谷子(Setariaitalica)、稗草(Echinochloacrugalli)，其對應(yīng)同源率分別達(dá)到達(dá)到 79.71 %、79.09 %、73.71 %、71.09 %。

2.4　玉米pepc全長基因表達(dá)載體的構(gòu)建

首先在全長目的基因兩端分別引入NotI和XmaI酶切位點(diǎn)，通過NotI和XmaI雙酶切、連接改造原有入門載體(圖8、圖9)，構(gòu)建含pepc基因全長的入門載體，命名為 pENTR-pepc(圖10)；菌液PCR及測序鑒定結(jié)果正確。入門載體pENTR-pepc和原有目的載體pDEST-cot進(jìn)行LR反應(yīng)，得到新的含pepc基因全長的表達(dá)載體pEXPR-pepc，菌液PCR及測序鑒定結(jié)果正確(圖11)。

1：pEASY-pepc質(zhì)粒DNA； 2：pEASY-pepc雙酶切產(chǎn)物；3：pENTR-vir質(zhì)粒DNA； 4：pENTR-vir雙酶切產(chǎn)物圖8　NotⅠ和XmaⅠ雙酶切

5：pENTR-vir雙酶切膠回收產(chǎn)物； 6—7：pEASY-pepc雙酶切膠回收產(chǎn)物圖9　雙酶切膠回收電泳結(jié)果

8—9：入門載體PCR圖10　入門載體PCR檢測結(jié)果

10—11：表達(dá)載體PCR圖11　表達(dá)載體PCR檢測結(jié)果

2.5　農(nóng)桿菌GV3101pMP90感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化及鑒定

pEXPR-pepc重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化GV3101pMP90感受態(tài)細(xì)胞(圖12)，挑取轉(zhuǎn)化后的單菌落接種于含有Kan、Rif和Gent的LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min振蕩下過夜培養(yǎng)，pepc全長基因引物對菌液進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果顯示，能擴(kuò)增出來3 000 bp左右目的基因條帶(圖13)，說明重組質(zhì)粒pEXPR-pepc已成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101pMP90。

圖12　農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化

1—2：根癌農(nóng)桿菌PCR圖13　重組質(zhì)粒導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌的PCR撿測

2.6　轉(zhuǎn)pepc基因的擬南芥陽性植株的篩選與鑒定

對經(jīng)過3遍Basta溶液篩選后仍能正常生長的擬南芥植株葉片組織直接進(jìn)行PCR鑒定，如圖14所示，轉(zhuǎn)pepc基因擬南芥陽性植株和pepc大腸桿菌質(zhì)粒DNA同樣都能擴(kuò)增出1 000 bp左右片段；對經(jīng)過PCR鑒定的陽性植株提RNA，進(jìn)行RT-PCR檢測，如圖15所示，轉(zhuǎn)基因植株和質(zhì)粒DNA同樣都能擴(kuò)增出200 bp左右目的條帶；初步證明玉米pepc基因經(jīng)過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花絮浸染法已成功轉(zhuǎn)入擬南芥。

M1：Marker DL 5000； 1、2：轉(zhuǎn)基因擬南芥PCR結(jié)果； 3：質(zhì)粒 DNAPCR結(jié)果； 4：非轉(zhuǎn)基因擬南芥PCR結(jié)果圖14　轉(zhuǎn)pepc基因擬南芥的PCR檢測

M2：Marker DL 500； 5.質(zhì)粒DNA PCR結(jié)果； 6：非轉(zhuǎn)基因擬南芥RT-PCR結(jié)果； 7—9.轉(zhuǎn)基因擬南芥RT-PCR結(jié)果圖15　轉(zhuǎn)pepc基因擬南芥的RT-PCR檢測

3　結(jié)論與討論

植物表達(dá)載體的構(gòu)建在植物基因工程中占據(jù)重要地位，而選擇合適的表達(dá)載體對外源基因的轉(zhuǎn)化和表達(dá)非常重要，本研究采用Gateway入門載體載體pENTR-vir、pDEST-cot成功構(gòu)建了含有C4植物pepc基因表達(dá)載體pENTR-pepc，使用草銨膦作篩選標(biāo)記，在T35S啟動子下表達(dá)pepc基因，為pepc基因表達(dá)提供了一個高效的載體，回避了在傳統(tǒng)的表達(dá)載體構(gòu)建中酶切位點(diǎn)選擇的局限性。同時由于具有致死基因ccdB，使未成功重組載體的大腸桿菌無法生長，有效減少了假陽性菌株，為后期篩選工作節(jié)省了時間。表達(dá)載體中有抗草銨膦篩選基因(PPT)，在對轉(zhuǎn)pepc基因擬南芥陽性植株篩選時，對長出4片真葉的幼苗間隔1周左右用適當(dāng)草銨膦溶液噴灑，未成功轉(zhuǎn)基因的擬南芥黃化死亡，轉(zhuǎn)基因擬南芥則不受影響，從而很大程度地減少了工作量[19]。

擬南芥是典型的模式植物，因此,玉米C4型pepc基因在擬南芥基因組中的表達(dá)與光合效應(yīng)分析更具有代表性。目前，對擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化最普遍的是利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序浸染法，而侵染過程的很多方面直接影響著轉(zhuǎn)化的成功率。首先是轉(zhuǎn)化緩沖液的成分。在轉(zhuǎn)化緩沖液中，添加蔗糖不僅可以為農(nóng)桿菌提供轉(zhuǎn)化能量，而且可以使花粉內(nèi)外壓強(qiáng)保持一致。陳軍等[20]在油菜花藥的培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，蔗糖濃度高低對花粉小孢子活力也有很大的影響。另外蔗糖還能在一定程度上誘導(dǎo)vir基因的表達(dá)，這將可以提高農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化效率[21]。為了使農(nóng)桿菌可以更好地吸附在植物表面，并且可以順利進(jìn)入植物組織細(xì)胞中去，一般還應(yīng)在轉(zhuǎn)化緩沖液中添加一定濃度的表面活性劑如Silwet L-77[22]。有研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化擬南芥時添加Silwet L-77 的適宜濃度為0.05%[23]，濃度過高對結(jié)實(shí)率有顯著的抑制作用，且轉(zhuǎn)化不穩(wěn)定。其次是農(nóng)桿菌的侵染濃度。Clough等[24]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)農(nóng)桿菌侵染液的OD600為0.8時轉(zhuǎn)化效果最好，濃度過高會影響擬南芥花絮的生長，過低則會降低轉(zhuǎn)化效率。但有些研究者發(fā)現(xiàn)，侵染液濃度OD600在0.15～1.74時對轉(zhuǎn)化效率影響不大[25]。最后是侵染的時間和次數(shù)。一般來說侵染時間過長可能會降低花絮的成活率，從而使結(jié)籽率相應(yīng)降低，影響后續(xù)試驗；侵染時間過短則會降低轉(zhuǎn)化的成功率。還有研究發(fā)現(xiàn)，間隔一段時間對擬南芥進(jìn)行重復(fù)侵染可以獲得較高的轉(zhuǎn)化率[25]。本次試驗過程中，采用的浸染緩沖液配方為2.2 g/L MSB5、50 g/L蔗糖、0.044 μmol/L 6-BA和 200 μL/L silwetL-77，pH 值為 5.7，OD600為1.0左右，選取生長健壯，且同一時期花蕾較多的擬南芥進(jìn)行第一次轉(zhuǎn)化，1周后觀察植株長勢，對生長強(qiáng)壯的植株重復(fù)進(jìn)行一次轉(zhuǎn)化，該方法不僅轉(zhuǎn)化率比較高，而且轉(zhuǎn)化效果最好。本研究為進(jìn)一步分析玉米C4型pepc基因在C3植物中的表達(dá)分析奠定了研究基礎(chǔ)。