臺灣泥鰍奇異變形桿菌的分離與鑒定

孫翰昌 孫沖 劉迪

摘 要：該文從患爛鰓病臺灣泥鰍分離了致病菌，進行生化鑒定及藥敏試驗。結(jié)果顯示，臺灣泥鰍爛鰓病的致病菌初步鑒定為奇異變形桿菌（Proteus mirabilis），而藥敏試驗結(jié)果表明，奧復(fù)星、環(huán)丙氟哌酸抑菌效果最好，其他依次為阿莫西林、氧氟沙星、頭孢西丁、強力霉素、紅霉素、氯霉素、VI、滿、IV、卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素、復(fù)達(dá)新、復(fù)方新諾明、V、酮（先鋒必）、多粘菌素、痢特靈，其余藥物則沒有抑菌效果。

關(guān)鍵詞：臺灣泥鰍；爛鰓??；奇異變形桿菌；抗生素

中圖分類號 S941.42 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2018）07-0025-3

臺灣泥鰍（Paramisgumus dabryanus ssp.）屬鰍科花鰍亞科副泥鰍屬，是大鱗副鰍的改良品種，具有個體大、生長速度快，肉質(zhì)細(xì)嫩鮮美、營養(yǎng)豐富、餌料系數(shù)低等特點[1]。近年來，隨著市場需求量的增加，集約化人工養(yǎng)殖泥鰍業(yè)迅猛發(fā)展。但高密度養(yǎng)殖及飼養(yǎng)管理不當(dāng)容易導(dǎo)致疾病的發(fā)生，給泥鰍行業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。細(xì)菌性疾病是鰍科魚類最常見的一種疾病，主要包括爛鰓病、腸炎病、赤皮病、出血病等[2]。其中細(xì)菌性爛鰓病是對淡水養(yǎng)殖魚類，尤其是對集約化養(yǎng)殖魚類危害最大。目前，已有鯉魚（Cyprinus carpio）[3]、草魚（Ctenopharyngodon idellus）[4]爛鰓病原因及防治的相關(guān)研究，但國內(nèi)未見有關(guān)臺灣泥鰍爛鰓病的病因及防治研究的報道。為此，本研究對臺灣泥鰍爛鰓病致病菌株進行了分離鑒定，并初步研究了27種抗菌藥物對分離菌株的敏感性，以期為該病的診斷和防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 泥鰍 試驗用魚為重慶市永川區(qū)某水產(chǎn)養(yǎng)殖場內(nèi)采集的100尾規(guī)格整齊、體質(zhì)健壯、肌肉豐富、無病無傷、體色鮮亮、生活力強的臺灣泥鰍。25℃暫養(yǎng)7d正常后用于試驗。

1.1.2 實驗藥品及培養(yǎng)基 腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定管及其他細(xì)菌生化鑒定所需試劑購自上海易佰聚經(jīng)貿(mào)有限公司；常規(guī)藥品均為實驗室所有，LB培養(yǎng)基、顯色配培養(yǎng)基均在實驗室配置。

1.2 方法

1.2.1 致病菌提取、分離與鑒定 取典型爛鰓病瀕死臺灣泥鰍，體表用無菌水沖洗，75%酒精消毒，無菌取深層潰爛皮膚，在無菌勻漿玻璃器中研磨，并用無菌水按1∶1比例混合成懸液，涂布于固體培養(yǎng)基，于37℃恒溫箱培養(yǎng)3d，然后進行劃線分離。無菌挑取少量菌種，于LB培養(yǎng)基純化。純化后經(jīng)革蘭氏染色和相關(guān)生理生化鑒定[5]。

1.2.2 感染試驗 分別用2mL、4mL、6mL的無菌水將奇異變形桿菌稀釋成不同濃度梯度菌懸液，用1mL的注射器分別吸取0.2mL、0.4mL、0.8mL，進行肌肉注射，同法注射生理鹽水作為對照組；25℃左右水族箱喂養(yǎng)，觀察記錄臺灣泥鰍發(fā)病情況，解剖瀕死臺灣泥鰍并分離致病菌。

1.2.3 藥物敏感試驗 分離菌株接種平皿培養(yǎng)基，用無菌鑷子取藥敏片均勻貼在培養(yǎng)基表面，37℃培養(yǎng)24h，測定抑菌圈[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定結(jié)果 分離菌株染色觀察結(jié)果表明提取菌株為革蘭氏陰性短桿菌，生化鑒定結(jié)果見表1、表2。本次試驗結(jié)果為AG207，根據(jù)《腸桿菌科菌編碼鑒定的數(shù)碼組合表》[5]比對，初步鑒定AG207為奇異變形桿菌（Proteus mirabilis）。

2.2 感染試驗結(jié)果 肌肉注射菌懸液觀察，第1d，注射0.2mL試驗體死亡；3d后全部試驗體死亡（見表3），且與自然發(fā)病臺灣泥鰍癥狀相似，故再次確定奇異變形桿菌為致病菌。

2.3 藥敏試驗結(jié)果 根據(jù)藥物敏感實驗判定標(biāo)準(zhǔn)[7]判斷：27種藥敏片敏感試驗中，奇異變形桿菌對奧復(fù)星、環(huán)丙氟哌酸、阿莫西林、達(dá)、氧氟沙星、頭孢西丁、強力霉素、紅霉素、氯霉素、VI、滿、IV、卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素、復(fù)達(dá)新、復(fù)方新諾明、V極敏感；對酮（先鋒必）、多粘菌素高度敏感；對痢特靈中度敏感；對苯唑西林、青霉素、萬古霉素、氨芐西林、羧甲司坦、潔霉素c不敏感（見表4）。結(jié)果顯示：奧復(fù)星、環(huán)丙氟哌酸、阿莫西林等18種極敏藥物可作為治療和預(yù)防臺灣泥鰍爛鰓病的參考藥物。

3 討論

本研究鑒定的奇異變形桿菌可感染泥鰍發(fā)生爛鰓病，是導(dǎo)致臺灣泥鰍爛鰓的重要病原。感染試驗發(fā)現(xiàn)，奇異變形桿菌濃度與死亡速度成正比，推斷試驗體死亡可能與該菌的致死性毒素相關(guān)。

奇異變形桿菌引起動物染病死亡病例在水貂（Neovison vison）[8]、雞（Gallus gallus domesticus）[9]、中華鱉（Trionyx Sinensis）[10]等有過報道。不同奇異變形桿菌菌株對藥物敏感程度不同，朱明華等[11]試驗得到奇異變形桿菌對青霉素、紅霉素、四環(huán)素不敏感；陳武[12]試驗得到奇異變形桿菌對慶大霉素、氯霉素、紅霉素不敏感。本研究結(jié)果表明青霉素對奇異變形桿菌沒有抑菌效果，與朱明華等研究一致。奇異變形桿菌敏感藥物有差異可能與物種生活環(huán)境有關(guān)，也可能與不同物種養(yǎng)殖戶用藥導(dǎo)致的耐藥機制有關(guān)。

泥鰍細(xì)菌性疾病發(fā)病原因復(fù)雜，感染速度快，容易給生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟損失。養(yǎng)殖戶常用化學(xué)藥劑進行防治，由于泥鰍屬于高密度養(yǎng)殖，容易造成水質(zhì)惡化，泥鰍免疫力降低，因此，對泥鰍疾病的防治最好采用生物防治，以利于生態(tài)養(yǎng)殖。張濤等[2]認(rèn)為在泥鰍飼料中適量添加中草藥可以提高泥鰍的免疫力。

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（責(zé)編：張宏民）