SIRT3與NANOG在前列腺癌中表達情況的初步研究

李榮，全亦周，夏偉梁上海交通大學生物醫(yī)學工程學院(上海，200030)

前列腺癌是男性常見的惡性腫瘤，在北美等發(fā)達國家前列腺癌發(fā)病率和死亡率占據(jù)男性惡性腫瘤的第一位和第三位[1]。隨著我國國民生活水準的提高、 飲食變化及壽命的延長，前列腺癌新增患者每年以6～7萬人次的速度增加[2]。隨著病程惡化，部分病人發(fā)生前列腺癌轉(zhuǎn)移。腫瘤干細胞依賴于活躍的基因網(wǎng)絡，通過對稱分裂使其具有自我更新能力，也可通過隨機事件或者響應環(huán)境信號進行不對稱分裂或分化[3]； 有科研人員認為，腫瘤干細胞是腫瘤生長和進化的驅(qū)動程序，可維持腫瘤細胞增殖和腫瘤進程的惡化[4]，提出腫瘤干細胞可能是腫瘤的源頭細胞，也是治療腫瘤的重要靶點。因此針對前列腺癌的研究，很多研究人員將關(guān)注點放在前列腺癌干細胞上，以期更好地探索前列腺癌的發(fā)生發(fā)展進程，最終為患者提供更好的治療效果[5]。

目前，報道較多的腫瘤干細胞的標志物為CD44，OCT4，NANOG等[6]，在前列腺癌干細胞研究中，Gong等[7]提出NANOG可能有助于前列腺癌干細胞維持自我更新，可作為未來前列腺癌干細胞分離和鑒定的一個標志； Jeter等[8]提出NANOG可促進前列腺癌干細胞特性，促進前列腺癌對雄激素缺乏的抵抗力。此外，本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)一種依賴于 NAD+的組蛋白去乙?；?，SIRT3，可在前列腺癌中抑制PI3K-Akt通路引起c-MYC的不穩(wěn)定，抑制前列腺癌細胞增殖[9]。

因此，本研究在前列腺癌細胞系和前列腺癌病人樣本中檢測SIRT3與NANOG表達水平，挖掘二者相關(guān)性，以期SIRT3能夠為未來前列腺癌干細胞的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人源前列腺癌細胞系LNCap，22RV1，C42B，DU145和PC3由ATCC中心提供。前列腺癌病人樣本石蠟切片由蕭山第一人民醫(yī)院提供。

DMEM培養(yǎng)基購于美國Hyclone公司，胎牛血清購于美國Gibco公司，驢血清和二抗購于美國Jackson Lab公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒和蛋白酶抑制劑購于美國Thermo公司，SIRT3和NANOG抗體購于美國Cell Signaling公司，H2O2購于上海生工生物技術(shù)有限公司，DAPI和抗熒光淬滅封片劑購于中國碧云天公司，RIPA細胞裂解液購于美國Millipore公司，NC膜購于美國GE公司。

1.2 方法

1.2.1基因芯片數(shù)據(jù)庫挖掘

本研究涉及的基因芯片數(shù)據(jù)庫主要為Oncomine和cBioportal，根據(jù)腫瘤種類搜索分析相關(guān)基因表達情況和相關(guān)性。

1.2.2免疫熒光染色

前列腺癌病理石蠟切片經(jīng)過二甲苯和梯度酒精脫蠟后，在濕盒里滴加3 % H2O2于組織上避光孵育10 min，PBS清洗三次。使用10 %驢血清封閉1 h后，一抗4 °C孵育過夜； 第二天回收一抗，室溫孵育熒光二抗和DAPI 1 h。在方形載玻片上滴加適量抗熒光淬滅劑，蓋上圓玻片，用透明指甲油封片，室溫下晾干，拍照分析。

1.2.3細胞培養(yǎng)

將人源前列腺癌細胞系培養(yǎng)在含10 %胎牛血清和1 %青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基里，將細胞培養(yǎng)皿放置在含37 °C，5 % CO2的恒溫培養(yǎng)箱里。

1.2.4免疫蛋白印跡(Western Blot)

RIPA裂解細胞后收集細胞蛋白樣本，使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取30 μg蛋白，加入適量6 × Loading Buffer，95 °C熱激變性5 min后進行SDS-PAGE電泳分離。電泳分離后將蛋白樣品轉(zhuǎn)移至0.45 μm NC膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將NC膜放入含有5 %脫脂奶粉的1 × TBST溶液中封閉1 h。加入相應一抗，搖床4 °C孵育過夜，第二天回收一抗，用1 × TBST溶液清洗三次； 加入對應二抗，搖床室溫孵育1 h，用1 × TBST溶液清洗三次。配置顯影液將其加到NC膜上，并在凝膠成像系統(tǒng)中曝光顯色，再進行后續(xù)分析。

1.2.5數(shù)據(jù)分析

使用Image J進行免疫蛋白印跡定量分析，使用Graphpad Prism和SigmaPlot進行數(shù)據(jù)分析，組內(nèi)比較時使用t檢驗，相關(guān)性分析使用回歸分析，P<0.05認為具有統(tǒng)計學意義，*代表P<0.05,**代表P<0.01,***代表P<0.001。

2 結(jié)果

(1)通過挖掘腫瘤基因芯片數(shù)據(jù)庫Oncomine檢測前列腺癌病人樣本， 本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)相比于正常前列腺組織， SIRT3在前列腺癌病人樣本中表達較低[9]； 本研究使用同樣方法檢測NANOG在前列腺癌病人樣本中表達情況。如圖1， 本研究發(fā)現(xiàn)相比于正常前列腺組織， NANOG在前列腺癌病人樣本中mRNA水平較高， 其中正常前列腺人群樣本為29， 前列腺癌病人樣本為131。此外， 我們調(diào)研文獻發(fā)現(xiàn)Miyazawa等[10]在前列腺癌病人樣本中通過免疫組織化學染色檢測NANOG表達情況：發(fā)現(xiàn)相比于正常組織， NANOG在前列腺癌病人樣本中表達較高， 見圖1。

(2)本研究繼續(xù)挖掘腫瘤基因芯片數(shù)據(jù)庫cBioportal檢測SIRT3和NANOG在前列腺癌病人樣本中表達情況， 如圖2所示。

二者在mRNA水平上表達呈一定程度負相關(guān)關(guān)系， 經(jīng)回歸分析R值為-0.47。此外， 通過免疫熒光染色在前列腺癌病理石蠟切片中檢測SIRT3和NANOG表達， 如圖3所示。我們發(fā)現(xiàn)在正常前列腺組織中SIRT3表達較高， 而在前列腺癌病人組織中NANOG表達較高。進一步揭示SIRT3與NANOG表達在前列腺癌組織中呈負相關(guān)的關(guān)系。

圖1 Oncomine數(shù)據(jù)庫中NANOG在正常前列腺和前列腺癌病人樣本中mRNA表達水平(Taylor Prostate Statistics，n=160，**P<0.01，Student's t-test)。Fig.1 The mRNA level of NANOG in prostate gland and prostate carcinoma samples selected from oncomine (Taylor Prostate Statistics, n=160, **P<0.01, Student's t-test).

圖2 SIRT3和NANOG在前列腺癌病人樣本中mRNA表達水平相關(guān)性(Neuroendocrine Prostate Cancer (Trento/Cornell/Broad 2016)，cBioportal數(shù)據(jù)庫，n=45，Regression Analysis)

圖3 SIRT3和NANOG在前列腺組織以及前列腺癌樣本中的表達情況(Bar=50 μm)

(3)更深入地研究，在前列腺癌細胞系LNCap，22RV1，DU145，PC3和C42B中通過Western Blot檢測SIRT3和NANOG本底蛋白表達水平，如圖4所示。經(jīng)過線性回歸分析，SIRT3和NANOG本底蛋白表達水平呈負相關(guān)關(guān)系，且R2為0.357 5，如圖4(b)所示，經(jīng)線性回歸分析，二者具有一定相關(guān)性。

圖4 SIRT3和NANOG在前列腺癌細胞系中蛋白表達情況Fig.4 The protein level of SIRT3 and NANOGin prostate cancer cells

3 討論

將腫瘤干細胞進行體外移植可產(chǎn)生相同的癌組織， 因此腫瘤干細胞是形成不同分化程度的腫瘤細胞和促進腫瘤細胞增殖的根源， 腫瘤干細胞理論認為， 腫瘤組織是不均一的， 腫瘤組織中只有很少一部分腫瘤細胞具有治瘤的潛能[11]。而前列腺癌臨床特征為前列腺組織不均一、 激素治療可殺死大部分癌細胞而總有一小部分癌細胞存活下來， 隨著時間推移， 這些存活下來的細胞可長出新的具有耐藥性和高轉(zhuǎn)移潛力的腫瘤細胞[12]。因此前列腺癌干細胞為臨床上經(jīng)雄激素治療無效后, 產(chǎn)生的雄激素非依賴性和前列腺癌復發(fā)轉(zhuǎn)移等現(xiàn)象提供了合理的解釋， 針對前列腺癌干細胞的研究和治療也顯得尤為重要。

前列腺癌干細胞標志物是存在于干細胞表面和細胞內(nèi)的抗原小分子。近年來， 科研人員提出腫瘤干細胞標志物NANOG在前列腺癌進程中扮演重要角色。Miyazawa等在前列腺癌病人樣本中通過免疫組織化學染色檢測四種腫瘤干細胞表面標志物——NANOG， OCT4， CD133和NESTIN， 發(fā)現(xiàn)NANOG表達最高， 并且隨著Gleason分級越高NANOG表達越高[10]； Jeter等[13]提出NANOG可通過動態(tài)抑制AR/FOXA1信號軸重組前列腺癌細胞去勢抵抗。此外， 結(jié)合本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)SIRT3破壞癌基因c-MYC穩(wěn)定性抑制前列腺癌細胞增殖， 其中c-MYC已被報道參與調(diào)控前列腺癌干細胞進程：Li等[14]提出SREBP-2與c-MYC相互作用激活c-MYC轉(zhuǎn)錄活性促進前列腺癌細胞干性維持， 進而促進腫瘤轉(zhuǎn)移； Yun等[15]提出DAB2IP可抑制c-kit-PI3K-Akt-mTOR通路上調(diào)c-MYC蛋白表達， 進而激活ZEB1調(diào)節(jié)前列腺癌細胞干性特性； Vyas等[16]提出c-MYC參與萊菔硫烷抑制前列腺癌干細胞特性維持的過程。而作為調(diào)控干細胞的重要基因， c-MYC和NANOG二者之間亦有諸多報道：Marzi等[17]提出NANOG， KLF4和 c-MYC轉(zhuǎn)錄回路參與肝癌細胞重編程進程； c-MYC和NANOG都可參與誘導形成多功能干細胞[18-19]?；诖?， 本研究通過挖掘基因芯片數(shù)據(jù)庫和應用免疫熒光染色和免疫蛋白印跡等實驗方法檢測分析前列腺癌病人樣本和前列腺癌細胞系里SIRT3與NANOG表達情況， 分析揭示二者表達負相關(guān)的關(guān)系， 提示SIRT3可能參與前列腺癌干細胞干性維持、 體內(nèi)成瘤等眾多進程， 為未來臨床治療前列腺癌提供新的思路。在后續(xù)的實驗中需進行深入的功能研究， 探索SIRT3在前列腺癌干細胞臨床應用中的價值。

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