葡萄無核性狀的SSR新分子標(biāo)記開發(fā)及應(yīng)用

馬亞茹，馮建燦，劉崇懷，樊秀彩，孫海生，姜建福，張穎

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葡萄無核性狀的SSR新分子標(biāo)記開發(fā)及應(yīng)用

馬亞茹1，馮建燦2，劉崇懷1，樊秀彩1，孫海生1，姜建福1，張穎1

（1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所，鄭州 450009；2河南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，鄭州 450002）

【目的】開發(fā)葡萄無核性狀的SSR新分子標(biāo)記，對葡萄雜種后代進(jìn)行早期無核性狀鑒定，為分子標(biāo)記輔助育種奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā繉δ副尽t地球’與父本‘森田尼無核’及F1代雜交群體的133份葡萄材料進(jìn)行RAD-seq，將測序結(jié)果比對到參考基因組上；運(yùn)用SAMtools軟件生成CaSFS軟件所需的pileup和glf文件，過濾獲得親本之間的有效SNP集；采用窗口滑動的方法，確定每個窗口的基因型，選擇以每15個SNP為一個窗口，每次滑動一個SNP，得到每個個體的基因型并生成bin圖；對生成的bin圖采用擬測交的方式利用Joinmap軟件進(jìn)行連鎖分析，構(gòu)建‘紅地球’與‘森田尼無核’遺傳連鎖圖譜；用WindowQTLCartographer2.0軟件進(jìn)行QTL定位，在定位區(qū)間通過Perl程序語言找到符合SSR特征序列的35個SSR分子標(biāo)記，用Primer premier5.0軟件設(shè)計(jì)35個SSR分子標(biāo)記引物對，通過HRM技術(shù)篩選親本之間在無核性狀上存在差異的SSR分子標(biāo)記，并在131株F1代雜交群體及65個葡萄品種的自然群體中檢測無核分型正確率、無核檢測率、無核保持率?！窘Y(jié)果】在‘紅地球’與‘森田尼無核’構(gòu)建的遺傳連鎖圖譜上，將葡萄無核性狀定位在chr18號染色體上，定位區(qū)間26 835 846—26 960 426，對無核的貢獻(xiàn)率為77.9%，LOD閾值為26.3。親本之間在無核性狀上存在差異的SSR分子標(biāo)記為VvSD10，其在111 bp等位點(diǎn)能對葡萄無核性狀進(jìn)行鑒定，利用分子標(biāo)記VvSD10上的111 bp等位點(diǎn)通過HRM技術(shù)在葡萄F1代雜交群體及自然群體中進(jìn)行葡萄無核性狀的鑒定。結(jié)果表明，分子標(biāo)記VvSD10在F1代雜交群體及自然群體中的無核分型正確率分別為97%、94%，其無核檢測率均為56%，無核保持率分別為77%、85%?！窘Y(jié)論】分子標(biāo)記VvSD10在遺傳群體及自然群體中的無核分型均能提供較高的準(zhǔn)確信息，為無核葡萄的分子標(biāo)記輔助育種奠定了基礎(chǔ)。

葡萄；無核；QTL定位；SSR分子標(biāo)記；輔助育種

0 引言

【研究意義】葡萄（L.）屬于葡萄科葡萄屬漿果，是中國第二大栽培果樹，可以廣泛應(yīng)用于釀酒、鮮食、制汁、制干[1]等工藝。在鮮食葡萄中，無核化已經(jīng)成為消費(fèi)者最喜愛的特性之一。無核葡萄果汁豐富，含糖量高，食用方便，品質(zhì)優(yōu)良，深受廣大消費(fèi)者喜愛。在發(fā)達(dá)國家，消費(fèi)的鮮食和制干葡萄超過50%為無核葡萄[2-3]。在中國，新疆是葡萄主產(chǎn)區(qū)，且大部分是無核葡萄品種[4]，無核葡萄育種成為葡萄育種的主要目標(biāo)之一。在無核葡萄育種過程中，使用最多的是常規(guī)雜交育種，通常使用有核品種做母本，無核品種做父本的雜交組合[5]。但是常規(guī)雜交育種周期長、后代選育率低，極大阻礙了無核葡萄的育種進(jìn)程。近幾年，分子標(biāo)記的不斷發(fā)展，給無核葡萄選育提供了便利[6-7]。利用分子標(biāo)記對雜種后代進(jìn)行早期的無核性狀鑒定，極大地加速了無核葡萄的育種進(jìn)程[8]。【前人研究進(jìn)展】目前，有關(guān)分子輔助育種在葡萄上的應(yīng)用已有部分研究。EMANUELLI等[9]利用SSR標(biāo)記找到了與葡萄中的玫瑰香味相關(guān)聯(lián)的一個候選基因，并將其命名為。CONSTANTINI[10]、MEJIA[11]等在兩個鮮食葡萄品種的163株雜交個體中篩選到了與果粒大小、成熟期、種子數(shù)分別相關(guān)的基因。FISCHER等[12]在‘Regent’בLemberger’的153株雜交個體中定位到與葡萄真菌抗性連鎖的QTL位點(diǎn)。HANANIA等[13]在有核與無核白系的葡萄花朵基因不同表達(dá)的轉(zhuǎn)錄分析中識別到一個葉綠素伴侶蛋白（ch-Cpn21），其沉默表達(dá)導(dǎo)致了煙草與西紅柿種子的敗育，泛激素延伸蛋白（S27a）在控制葡萄組織發(fā)育過程中可能存在某種角色[14]，然而這些基因均不是控制葡萄無核性狀的基因。Cabezas等[15]在‘赤霞珠’ב秋無核’的118株雜交子代中定位到了與葡萄無核性狀相關(guān)聯(lián)的QTL位點(diǎn)SDI（seed development inhibitor），該位點(diǎn)位于葡萄chr18染色體，與該位點(diǎn)緊密連鎖的在198 bp等位點(diǎn)上能對后代的無核性狀進(jìn)行有效的分離，表型變異解釋率為50%。MEJIA等[16]研究發(fā)現(xiàn)在SDI位點(diǎn)存在一個（[17]、[18]），該基因位于下游463 bp處。葡萄與擬南芥的序列同源性較高，擬南芥MADS-box家族中的MADS5參與調(diào)控種子的生長發(fā)育[19-20]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，在葡萄無核育種中被廣泛應(yīng)用。然而，在本研究的F1代雜交群體中的分型正確率只有45%，不能作為輔助育種的有效工具?；赗AD-seq測序利用高密度連鎖圖譜，較為準(zhǔn)確地定位到了無核性狀的QTL，并結(jié)合高分辨率熔解曲線（HRM）開發(fā)了一個新的用于葡萄無核性狀的SSR分子標(biāo)記VvSD10，該標(biāo)記位于葡萄內(nèi)部，能夠更好地連鎖基因的分離?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究在前人研究結(jié)果基礎(chǔ)上，在母本‘紅地球’與父本‘森田尼無核’兩親本及F1代雜交群體中又重新篩選到了與葡萄無核性狀相關(guān)聯(lián)的SSR分子標(biāo)記VvSD10。用分子標(biāo)記VvSD10在F1代雜交群體以及從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所的國家葡萄品種資源圃隨機(jī)選擇的葡萄自然群體中進(jìn)行鑒定，檢測該分子標(biāo)記在雜交子代及自然群體無核性狀中的分型率及保持率，進(jìn)一步提高和補(bǔ)充前人研究結(jié)果。

1 材料與方法

田間試驗(yàn)于2015—2016年在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所國家葡萄品種資源圃進(jìn)行，其他試驗(yàn)于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所果樹基因資源實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料

以母本‘紅地球’與父本‘森田尼無核’兩親本和131株F1代雜交群體，以及從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所國家葡萄品種資源圃隨機(jī)選取的65個葡萄品種的自然群體為試驗(yàn)材料（表1）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 無核性狀的調(diào)查 葡萄成熟期，調(diào)查F1代雜交群體每個單株的有無核性狀，以種子的有或無作為評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，有種子且發(fā)育良好的單株屬于有核，無核、殘核與軟核的單株均屬于無核。

1.2.2 指標(biāo)的測定方法

無核分型正確率（%）=存在111 bp等位點(diǎn)且表型為無核的葡萄植株個數(shù)/表型為無核的葡萄植株總數(shù)×100；

無核保持率（%）=存在111 bp等位點(diǎn)的植株個數(shù)/葡萄植株總個數(shù)×100；

無核檢測率（%）=存在111 bp等位點(diǎn)且表型為無核的葡萄植株個數(shù)/存在111 bp等位點(diǎn)的葡萄植株個數(shù)×100。

1.2.3 葡萄葉片DNA的提取 采摘F1代雜交群體以及自然群體的無病害的鮮嫩葉片，采用植物基因組DNA提取試劑盒（由洛陽愛森生物科技有限公司提供）提取葉片基因組DNA，濃度用NanoDrop1000檢測（Thermo Scientific），DNA樣本濃度用無菌水統(tǒng)一稀釋至10 ng?μL-1。

1.2.4 分子標(biāo)記遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建 對兩親本及已排除假雜交情況的131株F1代雜交群體進(jìn)行RAD-seq，運(yùn)用SOAP比對軟件將測序序列比對到參考基因組序列上（NCBI-GCF-000003745.3-12X）；根據(jù)比對結(jié)果，運(yùn)用SAMtools軟件生成CaSFS軟件所需的pileup和glf文件,鑒定群體中每個位點(diǎn)的情況，過濾獲得親本之間的有效SNP集；由于SNPs數(shù)量多，采用窗口滑動的方法，選擇以每15個SNP為一個窗口，每次滑動一個SNP，確定每個窗口的基因型，得到每個個體的基因型并生成bin圖；對生成的bin采用擬測交的方式，利用Joinmap軟件進(jìn)行連鎖分析，構(gòu)建‘紅地球’與‘森田尼無核’遺傳連鎖圖譜。

1.2.5 QTL定位 結(jié)合遺傳連鎖圖譜與無核性狀的調(diào)查數(shù)據(jù)，用WindowQTLCartographer2.0軟件進(jìn)行QTL定位。

1.2.6 SSR分子標(biāo)記引物對的設(shè)計(jì) 在QTL定位區(qū)間，用Perl程序語言找到了符合SSR序列特征的35個SSR分子標(biāo)記，利用Primer premier5.0軟件設(shè)計(jì)35個SSR分子標(biāo)記的引物對（引物由上海生工生物有限公司合成）。

1.2.7 SSR分子標(biāo)記的分型與檢測 以兩親本和131株F1代雜交群體以及自然群體的65個葡萄品種的基因組DNA為模板，利用篩選到的分子標(biāo)記引物通過HRM技術(shù)進(jìn)行基因分型分析，以兩親本作為對照樣本，與母本分為一組的樣本為有核，與父本分為一組的樣本為無核。

HRM分析儀器為羅氏Light Cycler?480Ⅱ，試劑為Light Cycler?480 High Resolution Melting Master。反應(yīng)體系為15 μL：1.6 μL濃度為3 μmol?L-1的Mgcl2，7.5 μL 2×HRM Master Mix，SSR上、下游引物各0.8 μL（濃度為10 μmol?L-1），1 μL模板DNA，無菌蒸餾水3.3 μL。

HRM技術(shù)包括PCR和HRM分析過程。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性10 s，62℃復(fù)性15 s，72℃延伸10 s，共48個循環(huán)；升溫和降溫過程溫度變化率分別為4.4和2.2℃?s-1。HRM分析過程為：95℃變性1 min,40℃雜交1 min；65—95℃讀取熔解曲線,溫度變化率為1℃?s-1

2 結(jié)果

2.1 葡萄無核性狀的QTL定位

通過形成的bin圖構(gòu)建‘紅地球’與‘森田尼無核’遺傳連鎖圖譜，并結(jié)合無核性狀調(diào)查數(shù)據(jù)，將葡萄無核性狀定位在chr18號染色體上，定位區(qū)間26 835 846—26 960 426，對無核表型的貢獻(xiàn)率為77.9%，LOD閾值為26.3（表2，圖1）。

2.2 SSR分子標(biāo)記引物對的篩選

根據(jù)已設(shè)計(jì)的35對SSR分子標(biāo)記引物對，在母本‘紅地球’與父本‘森田尼無核’兩個親本中通過HRM技術(shù)篩選親本之間在有無核性狀上存在差異的分子標(biāo)記引物對，命名為VvSD10，其正向引物序列為5′-agagctcatttggattaagagcg agtaattatattgt-3′，反向引物序列為3′-ggaa aaatccatcgctaacaaagtattaattctcttca-5′。同時(shí)，用含有6-FAM熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳（圖2）。結(jié)果顯示，分子標(biāo)記VvSD10在父本‘森田尼無核’中出現(xiàn)了111 bp等位點(diǎn)，在母本‘紅地球’中出現(xiàn)了99 bp與120 bp兩個等位點(diǎn)。

表1 自然群體葡萄品種信息

表2 葡萄無核性狀的QTL定位分析

2.3 分子標(biāo)記VvSD10在不同葡萄群體無核性狀中的分析

基于分子標(biāo)記VvSD10中存在的111 bp等位點(diǎn)（即與父本分為一組）對葡萄F1代雜交群體及自然群體的無核性狀進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，在被檢測的131株F1代雜交群體中，無核性狀的植株有59個，其中存在111 bp等位點(diǎn)且表現(xiàn)無核性狀的植株有57個。由此可知，分子標(biāo)記VvSD10在F1代雜交群體中的無核分型正確率為97%，無核保持率為77%，無核檢測率為56%。在65個葡萄品種的自然群體中，有33株為無核植株，其中存在111 bp且表現(xiàn)無核性狀的有31株。由此可知，分子標(biāo)記VvSD10在自然群體中的無核分型正確率、無核保持率、無核檢測率分別為94%、85%、56%（表3，圖3）。

圖1 葡萄無核性狀定位圖

圖2 分子標(biāo)記VvSD10在母本‘紅地球’（A）與父本‘森田尼無核’（B）中的毛細(xì)管電泳

表3 分子標(biāo)記VvSD10在不同葡萄群體無核性狀中的分析

“+”代表存在111 bp等位點(diǎn)；“-”代表不存在111 bp等位點(diǎn)

“+” represents the existence of 111 bp loci; “-” represents the absence of 111 bp loci

A：重疊區(qū)域代表樣本分型結(jié)果為有核（與母本歸為一組）；B：重疊區(qū)域代表樣本分型結(jié)果為無核（與父本歸為一組）

3 討論

3.1 HRM技術(shù)在科學(xué)研究中的應(yīng)用

高分辨率熔解曲線（High-Resolution Melting，HRM）技術(shù)，是國際上發(fā)展起來的一種基于單核苷酸熔解溫度不同而形成不同熔解曲線的突變掃描和基因分型新技術(shù)。該技術(shù)的原理是利用飽和的熒光染料對PCR產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析，根據(jù)熔解曲線的形狀進(jìn)行基因分型[21-24]。本研究使用了HRM技術(shù)，它是一種有效的、高分辨率的DNA差異檢測技術(shù)，因操作簡便迅速，使用成本低，結(jié)果準(zhǔn)確，實(shí)現(xiàn)了真正的閉關(guān)操作，而受到普遍關(guān)注。目前可以應(yīng)用于基因突變掃描[25]、基因分型[26]、甲基化分析[27]、法醫(yī)學(xué)鑒定[28]等方面。曹春鴿等[29]應(yīng)用HRM技術(shù)對CYP2C19*2和CYP2C19*3進(jìn)行了雙重SNP分型，結(jié)果顯示，64個隨機(jī)DNA樣本的HRM分型結(jié)果與測序結(jié)果一致性達(dá)到100%，與鄧建強(qiáng)等[28]應(yīng)用HRM技術(shù)進(jìn)行法醫(yī)昆蟲種屬鑒定研究中的結(jié)果相似。嘎利兵嘎[30]利用HRM技術(shù)在動物病毒基因分型中的研究及應(yīng)用中，建立了6種常見動物病毒的PCR-HRM檢測方法，成功對6種動物病毒進(jìn)行了基因分型，為動物傳染病分子診斷提供了一種快速、簡單、成本低廉的PCR-HRM檢測方法。在本研究中，應(yīng)用HRM技術(shù)對葡萄無核性狀進(jìn)行基因分型鑒定，篩選出了能檢測葡萄無核性狀的標(biāo)記VvSD10，同時(shí)該標(biāo)記在F1代雜交群體及自然群體中的無核分型正確率分別為97%、94%，提供了較高的準(zhǔn)確信息。

3.2 SSR標(biāo)記在葡萄分子輔助育種中的應(yīng)用

SSR（simple sequence repeats）標(biāo)記是近些年發(fā)展起來的一種以特異引物PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)，是一類由幾個核苷酸為重復(fù)單位組成的串聯(lián)重復(fù)序列，因其具有高多態(tài)性、多等位基因、共顯性遺傳等優(yōu)勢而被廣泛應(yīng)用[31-32]。CABEZAS等[15]利用SSR標(biāo)記方法定位到了與葡萄無核性狀緊密連鎖的，與MEJIA等[11]的研究結(jié)果相似。在CABEZAS等[15]的研究中，在無核葡萄品種‘森田尼無核’中檢測到198 bp與200 bp兩個等位點(diǎn)，在有核葡萄品種‘紅地球’中檢測到200 bp與202 bp兩個等位點(diǎn)。并且，在‘Dona Maria’與‘Muscat of Alexandria’2個有核葡萄品種中也檢測到198 bp等位點(diǎn)。類似報(bào)道中，在‘紅地球’中僅檢測到200 bp一個等位點(diǎn)[33]。本研究中，用在母本‘紅地球’中檢測到200 bp與202 bp兩個等位點(diǎn)，在父本‘森田尼無核’中檢測到200 bp與205 bp兩個等位點(diǎn)，但并未檢測到中的典型等位點(diǎn)198 bp。

KARAAGAC等[33]利用的198 bp等位點(diǎn)對‘Red Globe’בCrimson Seedless’224株雜交個體的有無核性狀進(jìn)行檢測，存在198 bp等位點(diǎn)的有112株，無核保持率為50%；在‘96-71-7’בCrimson Seedless’的126株雜交個體中，存在198 bp等位點(diǎn)的有96株，無核保持率為76%。本研究中，在‘紅地球’ב森田尼無核’F1代雜交群體中的分型正確率僅有45%，遠(yuǎn)不能達(dá)到檢測該群體無核性狀的目的。本研究基于SSR分子標(biāo)記篩選到了與葡萄無核性狀緊密連鎖的SSR分子標(biāo)記VvSD10，其在無核性狀上的典型等位點(diǎn)為111 bp。并且在131株F1代群體中有101株可以檢測到111 bp等位點(diǎn)，保持了77%的無核率，在分子標(biāo)記輔助育種中可以提前舍去23%個體。由于不同遺傳背景的差異，本研究中的分子標(biāo)記VvSD10在不同雜交群體的無核分型率、無核保持率等會有不同。

4 結(jié)論

本研究基于RAD-seq測序方法對葡萄無核性狀進(jìn)行QTL定位，將葡萄無核性狀定位在葡萄Chr18染色體上，定位區(qū)間位于26 835 846—26 960 426，約124 kb。在定位區(qū)間設(shè)計(jì)35對SSR分子標(biāo)記引物，通過高分辨率熔解曲線（HRM）與毛細(xì)管電泳結(jié)合的方法，篩選到了能檢測葡萄無核性狀的SSR分子標(biāo)記VvSD10，該標(biāo)記具有分型明確，表現(xiàn)穩(wěn)定的特點(diǎn)，在遺傳群體和自然群體中的無核分型均能提供較高的準(zhǔn)確信息，可以在育種中提供輔助信息。

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（責(zé)任編輯 趙伶俐）

Development and application of SSR new molecular marker for seedless traits in grape

MA YaRu1, FENG JianCan2, LIU ChongHuai1, FAN XiuCai1, SUN HaiSheng1, JIANG JianFu1, ZHANG Ying1

(1Zhengzhou Fruit Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450009;2College of Horticulture, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002)

【Objective】The objective of this study is to develop a new SSR molecular marker for seedless traits in grape, and to identify the early seedless traits of grape hybrids, and to lay the foundation for molecular marker assisted selection breeding. 【Method】RAD-seq was carried out in 133 grape materials including the female parent ‘Red Globe’, the male parent ‘Centennial Seedless’ and their F1hybrids, and the sequencing results were compared to the reference genome. SAMtools software was used to generate CaSFS software required for pileup and GLF files, and the effective SNP sets between parents were obtained by filtration. A window sliding method was used to determine the genotype of each window, and selected one window per 15 SNP and slided one SNP at a time. The genotype of each individual was obtained and the bin generated. Linkage analysis was carried out based on Joinmap software for generated bin, and genetic linkage map was constructed between ‘Red Globe’ and ‘Centennial Seedless’. The QTL loci was mapped using WindowQTLCartographer2.0 software. 35 SSR molecular markers consistent with the SSR characteristic sequence were identified by Perl programming language in the QTL mapping interval, and then 35 pairs of SSR molecular marker primers were designed. The molecular marker was screened in the differences with the seedless traits between parents by HRM technology, and the accuracy of seedless typing, the rate of seedless detection and the rate of seedless holding were detected in 131 F1hybrid population and natural population including 65 grape varieties.【Result】On the genetic linkage map between ‘Red Globe’ and ‘Centennial Seedless’, the seedless traits of grape were mapped on chromosome 18, and the mapping interval was 26 835 846-26 960 426, and the contribution rate to seedless was 77.9%, and the LOD threshold was 26.3. The molecular marker VvSD10 was screened in the differences with the seedless traits between parents, and there was a 111 bp loci in seedless traits of grape. Identification of seedless traits in grape F1hybrid population and natural population by HRM technology using 111 bp loci on VvSD10 marker, the results indicated that in F1hybrid population and natural population, the correct typing rate of molecular marker VvSD10 was 97% and 94%, respectively, and the rate of seedless detection of both populations was 56%, the rate of seedless holding was 77% and 85%, respectively. 【Conclusion】Seedless typing in grape by molecular marker VvSD10 could provide high accurate information in both genetic and natural populations and laid the foundation for molecular marker assisted breeding program in seedless grape.

L.; seedless; QTL mapping; SSR molecular marker; assisted breeding

2017-11-20；

2018-01-04

國家葡萄產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-29-yc-1）、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（CAAS-ASTIP-2017-ZFRI-02）、果樹（桃、棗、蘋果、葡萄等）優(yōu)異種質(zhì)資源創(chuàng)新和高效育種體系構(gòu)建（151100110900）

馬亞茹，Tel：13223070473；E-mail：1256381782@qq.com。

張穎，Tel：13525530042；E-mail：zhangying05@caas.cn

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.13.017