日本血吸蟲SjELAV-like 1的克隆、表達(dá)及功能分析

許蓉，張媛媛，李肖純，程貴鳳，何川川，郭露，李浩，劉金明，古少鵬，金亞美

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日本血吸蟲的克隆、表達(dá)及功能分析

許蓉1,2，張媛媛1,2，李肖純2,3，程貴鳳1,2，何川川2，郭露2，李浩2，劉金明2，古少鵬1，金亞美2

（1山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山西太谷 030801；2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學(xué)重點開放實驗室，上海 200241；3上海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200234）

【目的】克隆和表達(dá)日本血吸蟲胚胎致死異常視覺基因1（），分析其在日本血吸蟲體內(nèi)的表達(dá)情況及定位，探究該基因?qū)θ毡狙x形態(tài)和生殖發(fā)育的影響?！痉椒ā坷肦ACE技術(shù)擴(kuò)增5′/3′末端，獲得基因序列提交至NCBI，Gene Bank登錄號：MG515727，構(gòu)建該序列的重組表達(dá)質(zhì)粒 pET28-，并在大腸桿菌BL21中利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，收集不同誘導(dǎo)時間的菌體，SDS-PAGE法進(jìn)行蛋白電泳。利用His鎳柱親和層析法純化大量表達(dá)所得重組蛋白，用純化重組蛋白免疫小鼠制備多克隆抗體，用于Western blotting 分析蟲體內(nèi)該天然蛋白的免疫原性，以及間接免疫熒光檢測該蛋白在蟲體內(nèi)的分布情況。小鼠腹部貼片法感染日本血蟲尾蚴，收集不同發(fā)育階段混合蟲體和合抱分開的雌、雄蟲體，以單釘螺逸出的尾蚴感染小鼠獲得25 d單性雌、雄蟲體，通過熒光定量 PCR分析該基因的表達(dá)情況。通過尾靜脈注射小干擾RNA（siRNA）于感染小鼠體內(nèi)，使該基因表達(dá)沉默，篩選最佳干擾效果的siRNA，用于長期RNA干擾（RNAi）試驗，分析其對日本血吸蟲雌蟲產(chǎn)卵及卵胚孵化的影響。利用掃描電鏡和透射電鏡觀察RNAi對蟲體體被結(jié)構(gòu)及雌、雄蟲生殖器官的影響。【結(jié)果】獲得的1 797 bp的SjELAV-like 1基因序列含有poly A尾，其中編碼序列為1 533 bp，編碼510個氨基酸。重組質(zhì)粒pET28-在誘導(dǎo)4 h時表達(dá)量最高，主要以包涵體的形式存在，利用純化蛋白獲得了優(yōu)質(zhì)多抗，獲得的重組蛋白具有良好的免疫原性，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)SjELAV-like 1蛋白主要分布在蟲體體被。熒光定量分析發(fā)現(xiàn)在不同時期雌、雄蟲體內(nèi)均有表達(dá)，在雄蟲體內(nèi)表達(dá)穩(wěn)定，但在雌蟲體內(nèi)隨著發(fā)育成熟其表達(dá)水平呈下降趨勢；在不同感染狀態(tài)的雌、雄蟲體內(nèi)，與正常發(fā)育雌蟲相比，該基因在發(fā)育阻遏雌蟲體內(nèi)高表達(dá)，而在雄蟲體內(nèi)無明顯差異。RNAi試驗中，與NC組相比，長期干擾組小鼠肝減卵率、雌蟲對肝卵貢獻(xiàn)減少率和卵胚減孵化率分別為58.27%（＜0.05）、40.59%（＜0.01）和74.58%（＜0.01）；電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，干擾組蟲體體被結(jié)構(gòu)改變，雄蟲體表粘附的泡狀物消失，立體的褶脊結(jié)構(gòu)塌陷，整齊排列的條索狀皮脊變的疏松，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)消失，雌蟲體壁表面組織間隙增寬，分布于其上的體棘減少、變鈍，雄蟲精母細(xì)胞數(shù)目減少，其內(nèi)的染色質(zhì)減少，細(xì)胞腫大，細(xì)胞間隙增寬，雌蟲卵黃細(xì)胞中卵黃球減少，其中包含的卵黃滴也減少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫大，皮質(zhì)顆粒排列散亂?！窘Y(jié)論】成功克隆和表達(dá)了在日本血吸蟲發(fā)育阻遏雌蟲中高表達(dá)的部分SjELAV-like 1基因序列，且該基因主要在蟲體體被表達(dá)。該基因沉默使肝臟荷卵數(shù)、雌蟲對肝卵貢獻(xiàn)率和卵胚孵化率均顯著降低，并改變蟲體體被結(jié)構(gòu)，抑制生殖腺的正常發(fā)育，提示該基因?qū)θ毡狙x的生殖發(fā)育有重要的作用。

日本血吸蟲；；原核表達(dá)；免疫定位；RNA干擾；電鏡

0 引言

【研究意義】血吸蟲?。⊿chistosomiasis）是一種分布廣泛、危害嚴(yán)重的人畜共患寄生蟲病，在76個國家和地區(qū)呈地方性流行；血吸蟲性成熟雌蟲產(chǎn)生的大量蟲卵沉積在宿主肝臟和腸系膜靜脈形成肉的芽腫是導(dǎo)致宿主損傷的根本原因，大量蟲卵排出體外又造成血吸蟲病的傳播和流行[1-3]。血吸蟲雌雄合抱是雌蟲性成熟和產(chǎn)卵的前提，只有與雄蟲合抱的雌蟲才能發(fā)育成熟，而未與雄蟲合抱的雌蟲生長緩慢，生殖系統(tǒng)處于發(fā)育阻遏狀態(tài)，不能正常產(chǎn)卵[4]。合抱的雌雄蟲分離后，雌蟲慢慢變小，生殖器官逐漸萎縮退化，重新回到發(fā)育阻遏狀態(tài)[5-7]。因此，從控制血吸蟲雌蟲的生殖發(fā)育來防治血吸蟲病具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】（embryonic lethal abnormal vision）-是一類家族基因，該家族成員最早在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，因胚胎期致死及視覺異常表型而得名。該家族基因編碼RNA結(jié)合蛋白，通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)影響mRNA的轉(zhuǎn)運、定位和翻譯，控制蛋白的時空表達(dá)，并調(diào)控RNA與蛋白質(zhì)的結(jié)合及其相互作用，決定基因的表達(dá)水平及終產(chǎn)物，進(jìn)而發(fā)揮不同的生物學(xué)功能[8-9]。是該家族成員之一，在果蠅神經(jīng)元中通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制限制神經(jīng)突觸的生長，對神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和維持有重要作用[10-11]。人類中與同源的基因在細(xì)胞中廣泛表達(dá)，通過與ARE（AU-rich element）元件結(jié)合來調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性，它的異常表達(dá)導(dǎo)致生長發(fā)育異常、自身免疫和腫瘤等疾病的發(fā)生[12-14]。對胚盤的形態(tài)學(xué)發(fā)生和血管形成以及胎兒的維持也有重要作用，該基因缺失將導(dǎo)致胚胎致死或發(fā)育異常[15]。果蠅中與同源的，不僅對神經(jīng)元成熟有重要作用，還與卵母細(xì)胞的分化有關(guān)，該基因突變導(dǎo)致卵子缺陷，引起雌性不孕[16]?！颈狙芯壳腥朦c】在分析日本血吸蟲由單性感染和混合感染而來的25 d雌蟲的轉(zhuǎn)錄組差異時發(fā)現(xiàn)，在25 d發(fā)育阻遏雌蟲體內(nèi)高表達(dá)，這預(yù)示該基因可能對日本血吸蟲的生長發(fā)育有重要的影響。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究以日本血吸蟲發(fā)育阻遏雌蟲體內(nèi)高表達(dá)的為研究對象，克隆、表達(dá)該基因，分析其重組抗原的免疫原性及SjELAV-like 1蛋白的分布情況，并分析該基因在蟲體內(nèi)的差異表達(dá)，評估該基因沉默對日本血吸蟲形態(tài)和生殖發(fā)育的影響，為進(jìn)一步研究該基因的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

本研究于2016年8月至2017年10月完成，完成地點為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學(xué)重點開放實驗室。

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 Ex Taq HS、T4DNA Ligase、pGEM T-easy載體、限制性內(nèi)切酶R I 和I 、DNA Marker、SMARTer?RACE 5′/3′ Kit、Prime-ScriptRTreagent Kit with gDNA Eraser、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ購自TaKaRa生物工程有限公司；DNA膠回收試劑盒、質(zhì)?；厥赵噭┖匈徸訟xygen生化科技有限公司；弗氏完全佐劑和不完全佐劑購自 Sigma 公司；硝酸纖維素膜（Whatman）購自北京經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)有限公司；HRP-goat anti-mouse IgG購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色試劑盒購自天根（北京）生化科技有限公司；DAPI Stock Solution、Alexa Fluor?488 goat anti-mouse IgG（H+L）、TRIzol?reagent購自上海英濰捷基生物公司；4%多聚甲醛、50%戊二醛；所有引物合成及測序均由上海英駿生物技術(shù)公司完成，所有小干擾RNA（siRNA）均有上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。

1.1.2 菌種、質(zhì)粒、血清和實驗動物 日本血吸蟲中國大陸株尾蚴由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所釘螺室提供。pET28a質(zhì)粒由農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學(xué)重點開放實驗室保存，大腸桿菌BL21、DH5α購自上海全氏金生物有限公司；6 周齡雄性BABL/c小鼠購自斯萊克實驗動物有限公司；日本血吸蟲全蟲可溶性蛋白抗血清由農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學(xué)重點開放實驗室制備。

1.2 方法

1.2.1 蟲體的收集 BABL/c小鼠以腹部貼片法[17]，在感染后7、14、18、21、25、28、35、42 d剖殺，以肝門靜脈灌注法收集蟲體；并分別收集18、21、25、28、35、42 d合抱分開的雌、雄蟲體。以單釘螺逸出的尾蚴感染小鼠，25 d后剖殺，結(jié)合形態(tài)觀察，分別收集雌、雄蟲體，單性感染雌蟲較正常發(fā)育雌蟲小，雄蟲無明顯差異。所收集蟲體均用PBS洗滌3次，于液氮罐中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SjELAV-like 1基因序列的獲得與分析

1.2.2.1 SjELAV-like 1基因序列的獲得 根據(jù)前期研究發(fā)現(xiàn)的在Gene DB中登錄的發(fā)育阻礙雌蟲高表達(dá)的部分基因序列（Sjp_0001640），利用Primer5.0設(shè)計5′和3′RACE引物（表1）。TRIzol 法提取日本血吸蟲總RNA，用分光光度計測定濃度，根據(jù)SMARTer?RACE 5′/3′Kit說明書進(jìn)行5′和3′端的擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物回收與pGEM T-easy 載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，挑選單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，菌液PCR 鑒定陽性克隆，抽提質(zhì)粒測序。

1.2.2.2 生物信息學(xué)分析 利用在線工具ORF finder（www.ncbi.nlm.nih.gov/go rf/gorf.html）分析獲得的基因序列，找出編碼序列；利用 ProtParam 工具（http://web.expasy.org/protparam/）計算編碼蛋白質(zhì)的理論分子量、等電點、氨基酸組成等；利用SignalP 3.0 （www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）在線分析該蛋白有無信號肽；利用 TMHMM 服務(wù)器（www.cbs.dtu.dk/ services/TMHMM-2.0/）分析編碼蛋白有無跨膜結(jié)構(gòu)；采用NCBI服務(wù)器中的CDD（www.ncbi.nlm.nih.gov/ structure/cdd/cdd.shtml）程序進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析。通過NCBI中的Blast功能進(jìn)行同源性分析。

1.2.3 重組質(zhì)粒pET28-的構(gòu)建及表達(dá)

1.2.3.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)獲得的SjELAV-like 1基因序列的編碼區(qū)，利用Primer 5.0設(shè)計上下游引物（表1），根據(jù)Prime-Script? RT reagent Kit with gDNA Eraser（Takara）試劑盒說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得日本血吸蟲cDNA，以之為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用R I和I限制性內(nèi)切酶對純化回收的PCR產(chǎn)物和pET28a載體進(jìn)行雙酶切，在T4DNA Ligase的作用下連接轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中，菌液PCR 鑒定陽性克隆，抽提其重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定并測序。

1.2.3.2 在大腸桿菌中的表達(dá) 將測序正確的陽性克隆接種于LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，待菌液OD600至 0.8 時，加入終濃度為1 mmol·L-1的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，分別收集0、1、2、3、4、6、8 h的菌體蛋白，以確定最佳誘導(dǎo)時間；大量表達(dá)重組蛋白經(jīng)3次凍融，超聲破碎后，分別收集上清和包涵體；將包涵體洗滌溶解后，用His-bind鎳柱親和層析法純化蛋白，梯度透析進(jìn)行蛋白復(fù)性，SDS-PAGE 電泳分析收集的菌體蛋白和純化的重組蛋白。

1.2.4 重組蛋白rSjELAV-like 1多克隆抗體的制備 將50 μg純化的重組蛋白rSjELAV-like 1與等量完全弗氏佐劑乳化，皮下注射免疫小鼠，增強(qiáng)免疫用不完全弗氏佐劑，每次免疫間隔2周，共免疫3次。第3次免疫后7 d，眼眶采血，低速離心分離得小鼠抗rSjELAV-like 1血清。

1.2.5 Western blotting檢測 將IPTG誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)4 h后的菌體蛋白或日本血吸蟲全蟲可溶性蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，低溫轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（NC）上，以日本血吸蟲全蟲可溶性蛋白免疫小鼠血清或小鼠抗rSjELAV-like 1血清作為一抗，正常小鼠血清作為對照，4℃孵育過夜，以HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG作為二抗，室溫孵育45 min，增強(qiáng)型HRP-DAB顯色觀察。

表1 本研究中的引物

a引物序列下劃線分別為R I和I限制性內(nèi)切酶酶切位點

The underlines ofa wereR I andI restriction enzyme cutting sites

1.2.6 熒光定量PCR 分別提取不同時期、不同狀態(tài)的蟲體總RNA，測定濃度，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit說明書反轉(zhuǎn)錄為 cDNA。根據(jù)基因序列設(shè)計并合成上下游引物-b，預(yù)期擴(kuò)增片段長度108 bp，并以為內(nèi)參，預(yù)期擴(kuò)增基因片段長度為234 bp，引物使用濃度為10 pmol（表1）。按照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ說明書，采用熒光染料法進(jìn)行熒光定量PCR，每個反應(yīng)均做三孔重復(fù)。利用ABI 7500 Software v2.0.5軟件分析結(jié)果。

1.2.7 間接免疫熒光試驗 取日本血吸蟲成蟲，制成8 μm的冰凍切片，于4℃用丙酮固定30 min后，用5% BSA封閉 2 h。以小鼠抗rSjELAV-like 1血清作為一抗，正常小鼠血清作為對照，4℃孵育過夜，Alexa Fluor?488 goat anti-mouse IgG作為熒光二抗，室溫孵育45 min，10 μg·mL-1DAPI室溫避光復(fù)染 5 min，置熒光顯微鏡下觀察。

1.2.8 RNAi試驗

1.2.8.1 siRNA的篩選 根據(jù)SjELAV-like 1基因序列設(shè)計siRNA S1和S2，長度為21 nt，同時設(shè)陰性對照siRNA NC，由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成（表1）。12只BALB/c小鼠，隨機(jī)平均分為4組，S1、S2、NC和PBS組，按1.2.1中的方法感染小鼠，感染后22 d，小鼠尾靜脈注射1OD S1、S2、NC或等體積的PBS。48 h后剖殺小鼠，肝門靜脈灌注法沖蟲并收集蟲體，提取各組蟲體總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以之為模板，qRT-PCR檢測干擾效果。

1.2.8.2 siRNA長期干擾 8只BALB/c小鼠，隨機(jī)平均分為2組，小鼠感染后14 d，選擇干擾效果好的siRNA，小鼠尾靜脈注射1OD siRNA或NC，每4 d干擾一次，共干擾7次，至41 d時收集蟲體并計數(shù)，qRT-PCR檢測干擾效果。

1.2.8.3 肝組織蟲卵計數(shù) 收集肝臟并稱重，加入PBS，用勻漿機(jī)混勻后，定容至20 mL，取1 mL肝臟勻漿液，加入等體積10 % NaOH（W/V），56℃水浴鍋中消化2 h，消化完全后混勻取5份50 μL 樣品，鏡檢計數(shù)蟲卵，計算減卵率。

肝減卵率=（對照組平均每克肝臟荷卵數(shù)-處理組平均每克肝臟荷卵數(shù)）/對照組平均每克肝臟荷卵數(shù)×100%

1.2.8.4 毛蚴計數(shù) 取4 mL 肝臟勻漿液于細(xì)頸平底燒瓶中，加入去氯水，并用一薄層棉花覆蓋在液面下5 cm處，28℃孵化4 h后收集棉花上層清液，轉(zhuǎn)移至15 mL 離心管中，加入50 μL碘酊染液固定毛蚴，4 000×離心5 min，吸去上清，定容至2 mL，混勻取5份100 μL 樣品，鏡檢計數(shù)尾蚴，計算減孵化率。

減孵化率=（對照組平均孵化率-處理組平均孵化率）/對照組平均孵化率×100%

1.2.9 電鏡觀察

1.2.9.1 掃描電子顯微鏡（SEM）觀察 將長期干擾試驗中收集的雌、雄蟲體用PBS洗滌后，4℃置于4%戊二醛中固定24 h。固定好的標(biāo)本經(jīng)0.1 mol·L-1PBS漂洗3次（15 min/次），1%鋨酸固定2 h，0.1 mol·L-1PBS漂洗3次（15 min/次），30%、50%、70%、80%、90%系列濃度乙醇脫水分別20 min，100%乙醇脫水2次（20 min/次），真空干燥，用離子濺射儀噴金后，用JEOL JSM-6380LV電鏡對蟲體作掃描電鏡觀察。

1.2.9.2 透射電子顯微鏡（TEM）觀察 取上述固定后的雌、雄蟲體，經(jīng)PBS洗滌后，1%鋨酸固定2 h，依次在50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇、90%乙醇+90%丙酮（1﹕1）、90%丙酮、100%丙酮中脫水20 min，純丙酮：包埋液按3﹕1、1﹕1和1﹕3，室溫分別浸泡2 h、4 h和37℃過夜；將蟲體置入包埋液中，60℃烘箱內(nèi)24 h；LEICA-UC7型超薄切片機(jī)切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛雙染，F(xiàn)EI-T12型透射電鏡觀察。

1.2.10 統(tǒng)計學(xué)分析 采用 SPASS 22.0軟件（IBM）對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。對有3個數(shù)值以上的樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，求標(biāo)準(zhǔn)差；對兩組以上數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗，分析各組數(shù)據(jù)之間的差異是否顯著。

2 結(jié)果

2.1 SjELAV-like 1基因序列的獲得與分析

通過5′RACE及3′RACE擴(kuò)增獲得長為1 797 bp 的基因序列，序列分析發(fā)現(xiàn)，該序列有終止碼，含有poly A尾，其中編碼區(qū)1 533 bp，編碼510個氨基酸，理論分子量為55.2 kD，等電點6.63。該序列編碼的多肽含12個N端糖基化位點和RRM保守結(jié)構(gòu)域，無信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域。NCBI核苷酸比對結(jié)果顯示該基因與埃及血吸蟲（Gene Bank登錄號：XM_012944479.1）和曼氏血吸蟲（Gene Bank登錄號：XM_018799857.1）分別有89%和87%的同源性，故將其命名為，并提交至NCBI，Gene Bank登錄號：MG515727。

2.2 SjELAV-like 1的克隆、表達(dá)及純化

PCR擴(kuò)增已知編碼區(qū)，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示單一目的條帶，與已知序列大小相符（圖1）。SDS-PAGE 結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒在大腸桿菌 BL21中成功表達(dá)，4 h達(dá)到最高表達(dá)量，且表達(dá)的蛋白主要以包涵體的形式存在；用His-bind鎳柱親和層析法獲得較純的重組蛋白，分子量約為55.2 kD左右，與預(yù)期大小相符（圖 2）。

2.3 SjELAV-like 1蛋白的免疫原性檢測

以全蟲可溶性蛋白抗血清為一抗，western blotting分析重組蛋白SjELAV-like 1在大腸桿菌中的表達(dá)，結(jié)果顯示在55.2 kD 位置出現(xiàn)單一條帶（圖3-A），且與重組蛋白分子量大小相符，表明重組蛋白具有良好的免疫原性。利用本研究中制備的重組蛋白抗血清，以正常小鼠血清為對照，western blotting 分析全蟲可溶性蛋白，結(jié)果顯示，以小鼠抗rSjELAV-like 1血清作為一抗，110 kD處有一明顯的識別條帶（圖3-B），說明該蛋白在日本血吸蟲體內(nèi)的分子量為110 kD左右，大于預(yù)測分子量，這可能是糖基化位點增加其分子量，該蛋白無信號肽，也可能是由于未獲得該基因的5′末端；陰性對照組在110 kD 處未有條帶出現(xiàn)，表明重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性。

M：DL2000 DNA marker；1：SjELAV-like 1 PCR 產(chǎn)物

Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of PCR products ofgene

M：蛋白 marker；1，2，3，4，5，6：IPTG誘導(dǎo)0，1，2，3，4，6 h后重組蛋白SjELAV-like 1的表達(dá)；7：上清；8：包涵體；9：純化的重組蛋白SjELAV-like 1

2.4 熒光定量分析SjELAV-like 1表達(dá)情況

結(jié)果表明，在日本血吸蟲不同時期中均有表達(dá)，25 d時表達(dá)量較高（圖4-A）。在不同時期合抱分開的雌、雄蟲體內(nèi)，該基因在雌蟲體內(nèi)18 d時表達(dá)量最高，隨后呈下降趨勢，而在雄蟲體內(nèi)的表達(dá)量相對穩(wěn)定（圖4-B）。在不同感染狀態(tài)的25 d 雌、雄蟲體內(nèi)，的表達(dá)在單性感染的25 d發(fā)育阻遏雌蟲體內(nèi)顯著高于混合感染的25 d正常發(fā)育雌蟲（＜0.01），而在雄蟲體內(nèi)無此差異表達(dá)現(xiàn)象（圖4-C）。

（A）重組蛋白SjELAV-like 1免疫原性分析。M：預(yù)染蛋白marker；1：IPTG誘導(dǎo)前的表達(dá)；2：IPTG誘導(dǎo)4 h后的表達(dá)。（B）重組蛋白SjELAV-like 1反應(yīng)原性分析。M：預(yù)染蛋白marker；1：小鼠抗rSjELAV-like 1血清為一抗；2：正常小鼠陰性血清為一抗

A. 在不同發(fā)育階段的表達(dá)。7，14，18，21，25，28，35和42 d：在8個時期蟲體內(nèi)的表達(dá)；B. 在不同時期和性別的表達(dá)。18，21，25，28，35和42 d：在6個時期合抱分開的雌、雄蟲體內(nèi)的表達(dá)；C. 在不同感染階階段和性別的表達(dá)。25ds：在單性感染的25d 蟲體內(nèi)的表達(dá)；25dm：在混合感染的25 d 蟲體內(nèi)的表達(dá)

2.5 SjELAV-like 1在蟲體內(nèi)的定位

冰凍切片（8 μm）用小鼠抗rSjELAV-like 1血清或小鼠陰性血清作為一抗，熒光顯微鏡下可觀察到Alexa Fluor?488標(biāo)記的山羊抗小鼠 IgG 二抗發(fā)出的綠色熒光，DAPI復(fù)染細(xì)胞核后發(fā)出的藍(lán)色熒光，免疫熒光染色結(jié)果表明SjELAV-like 1蛋白主要分布在蟲體表膜，蟲體實質(zhì)也有少量分布（圖5）。

2.6 siRNA干擾試驗

通過小鼠尾靜脈注射不同的siRNA，利用qRT- PCR分析各組中相對內(nèi)參基因的表達(dá)量時發(fā)現(xiàn)，S2相對PBS組和NC組，的表達(dá)下降75%左右，而S1無顯著性差異（圖6-A）。S2長期干擾發(fā)現(xiàn)，S2組相對NC組，的表達(dá)下降70%左右（圖6-B）。與NC組相比，干擾組小鼠肝臟減卵率達(dá)58.27%（＜0.05），雌蟲對肝臟卵貢獻(xiàn)率降低40.49%（＜0.01），蟲卵減孵化率達(dá)74.58%（＜0.01）（表2）。

2.7 電鏡觀察RNAi結(jié)果

2.7.1 SEM 小鼠體內(nèi)干擾后，收集各組蟲體，利用掃描電鏡觀察干擾對蟲體形態(tài)學(xué)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干擾組（圖7-a-d）與對照組（圖7-e-h）相比，蟲體結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化。正常血吸蟲雄蟲的抱雌溝起始部腹側(cè)由突起的褶脊和凹陷組成，其上分布有許多小的泡狀物，呈細(xì)顆粒狀，而干擾后，血吸蟲突起的褶脊塌陷，稍有萎縮，凹陷不明顯，失去立體結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)扁平狀，表面小顆粒泡狀物消失（圖7-a，e）；正常雄蟲的抱雌溝中段背側(cè)體壁表面平整無褶嵴，條索狀皮嵴緊密聯(lián)結(jié)，排列整齊，其中有半圓形感覺乳突存在，而干擾后，血吸蟲條索狀皮嵴間隙增大，表面呈不規(guī)律的凹凸?fàn)睿▓D7-b，f）；正常雄蟲的后段體壁表面無褶嵴，布滿凹陷，其中分布有蒂乳突，排列成網(wǎng)格狀，而干擾后，蟲體體壁突起腫脹變平，排列不規(guī)則，有部分融合，大部分網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)消失（圖7-c，g）；正常血吸蟲雌蟲中段體壁表面幾乎無褶脊，其中分布有小而短的體棘，而干擾組雌蟲表皮間隙稍有增大，表面體棘變少變鈍（圖7-d，h）。

a，b：小鼠抗rSjELAV-like 1血清為一抗；c，d：正常小鼠陰性血清為一抗。t：體被；p：實質(zhì)。與對照組相比，試驗組特異性熒光主要分布于蟲體體被，少量分布于蟲體內(nèi)部實質(zhì)組織，試驗組箭頭所指熒光為蛋白分布的部位

表2 RNA干擾后的肝臟減卵率和卵胚減孵化率

*.＜0.05；**.＜0.01

A. 最佳干擾效果siRNA的篩選；B. S2體內(nèi)長期干擾。PBS：空白對照；NC：陰性對照siRNA；S1：siRNA 1；S2：siRNA 2

2.7.2 TEM 將干擾后收集的蟲體用于觀察雌、雄蟲體的生殖腺，透射電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，干擾組（圖8 a-c）與對照組（圖8 d-f）相比，雌、雄蟲體的生殖細(xì)胞明顯發(fā)生了改變。正常雄蟲睪丸內(nèi)精母細(xì)胞（s）排列整齊緊密，呈規(guī)則的圓形或橢圓形，細(xì)胞核圓，核周圍有染色質(zhì)（c），S2干擾后，精母細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞間隙（is）增大（圖8-a，d），且細(xì)胞腫大呈不規(guī)則的長橢圓形或梭形，大部分染色質(zhì)消失（圖8-b，e）；正常雌蟲卵黃腺內(nèi)有卵黃細(xì)胞（vc），成熟卵黃細(xì)胞內(nèi)含有卵黃滴（vd）、卵黃球（vg）和脂滴（l），卵黃滴包含于卵黃球內(nèi)，數(shù)目較多，呈大小較均一的卵圓形，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（er）結(jié)構(gòu)清晰，有規(guī)律的分布于細(xì)胞間質(zhì)，皮質(zhì)顆粒（cg）排列整齊，而干擾后的卵黃細(xì)胞，卵黃球數(shù)目減少，其包含的卵黃滴較少，且大小不一，形狀不規(guī)則，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，界限模糊，且皮質(zhì)顆粒在細(xì)胞內(nèi)分布不規(guī)律（圖8-c，f）。

3 討論

家族基因編碼的RNA結(jié)合蛋白存在于大多數(shù)真核細(xì)胞中，它在基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中起重要作用，其通過可變性剪接和多聚腺苷酸化決定mRNA的時空表達(dá)，從而發(fā)揮它們的生物學(xué)功能[18]。研究還發(fā)現(xiàn)，RNA結(jié)合蛋白在細(xì)胞代謝過程中起著重要作用，它通過調(diào)控RNA調(diào)節(jié)子引起基因表達(dá)水平變化或突變，導(dǎo)致炎癥、癌癥等疾病的發(fā)生[19-20]。人類中與同源的在機(jī)體各組織中廣泛存在，有研究揭示：HuR蛋白在細(xì)胞分裂、細(xì)胞衰老、免疫細(xì)胞激活及肌肉分化等生命活動中起重要的調(diào)控作用，其功能異常與炎癥、腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[21]。

筆者前期研究發(fā)現(xiàn)在日本血吸蟲25 d發(fā)育阻遏雌蟲體內(nèi)高表達(dá)，提示該基因?qū)θ毡狙x雌蟲的生長發(fā)育有一定的影響（未發(fā)表）。qRT-PCR對在日本血吸蟲不同時期、不同狀態(tài)，qRT-PCR對在日本血吸蟲不同時期、不同狀態(tài)表達(dá)情況分析發(fā)現(xiàn)，該基因在不同時期雄蟲體內(nèi)的表達(dá)沒有明顯差異，應(yīng)屬于組成型表達(dá)，其在雄蟲體內(nèi)的表達(dá)情況也說明了這一點；但在雌蟲體內(nèi)，隨著其生殖發(fā)育的完善該基因的表達(dá)逐漸下降，該基因在發(fā)育阻遏雌蟲體內(nèi)的表達(dá)顯著高于同時期正常發(fā)育的雌蟲，這預(yù)示著該基因產(chǎn)物可能有抑制雌蟲成熟的作用。由于在雌蟲體內(nèi)該基因的表達(dá)逐漸下降，在發(fā)育早期，其在雌蟲體內(nèi)的含量高于雄蟲，成熟后，其在雄蟲體內(nèi)的含量高于雌蟲，可以推測，其在不同發(fā)育階段的表達(dá)量早期取決于雌蟲，后期由雄蟲決定。在正常發(fā)育進(jìn)程中，基因和蛋白的表達(dá)差異取決于其發(fā)育的需要，在雌蟲體內(nèi)差異表達(dá)的表象，說明該基因應(yīng)對血吸蟲雌蟲的生長發(fā)育有重要的影響。

a-d：S2干擾；e-f：陰性對照。a，e：抱雌溝起始部腹側(cè)體壁；b，f：雄蟲中段背側(cè)體壁；c，g：雄蟲后段體壁；d，h：雌蟲中段體壁。b：泡狀物；fr：褶脊；sr：皮脊；ns：網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；bs：體棘；sg：體表間隙。與對照組相比，干擾組抱雌溝起始部腹側(cè)體表泡狀物消失，褶脊塌陷（a，e），體壁背側(cè)中段條索狀皮脊排列疏松（b，f），體壁后段網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)消失（c，g），雌蟲體壁中段體表組織間隙增大，體棘減少、變鈍（d，h）

a-c： S2干擾；d-f:陰性對照。a，b，d，e：雄蟲精母細(xì)胞；c，f：雌蟲卵黃細(xì)胞。s：精母細(xì)胞；is：細(xì)胞間隙；c：染色質(zhì)；er：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)； vc：卵黃細(xì)胞；vg：卵黃球；vd：卵黃滴； l：脂滴；cg：皮質(zhì)顆粒；n：細(xì)胞核。與對照組相比，干擾組精母細(xì)胞數(shù)目少（a，d），且細(xì)胞內(nèi)染色質(zhì)減少（b，e），卵黃細(xì)胞內(nèi)卵黃球少，卵黃球內(nèi)卵黃滴少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫大，皮質(zhì)顆粒排列散亂（c，f）

血吸蟲不僅可以通過體被從宿主體內(nèi)獲取營養(yǎng)，而且直接與宿主免疫系統(tǒng)接觸，誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫應(yīng)答，許多表膜及表膜相關(guān)抗原是宿主保護(hù)性免疫反應(yīng)的靶點，研究已發(fā)現(xiàn)多種膜表面蛋白可作為疫苗分子[22-25]。成熟期雌蟲大部分位于雄蟲抱雌溝內(nèi)，因此，雄蟲體被蛋白是激發(fā)宿主免疫系統(tǒng)的主要來源。本研究發(fā)現(xiàn)SjELAV-like 1蛋白主要定位于日本血吸蟲體被，且具有良好的免疫原性；在雄蟲體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)，在蟲體成熟后期主要來自于雄蟲，這些皆為作為候選疫苗分子的研究提供理論依據(jù)。

RNAi是發(fā)生在mRNA水平上的一種基因沉寂現(xiàn)象，即將外源性雙鏈RNA引入細(xì)胞后引起細(xì)胞內(nèi)與其同源的mRNA特異性降解，使該基因在RNA水平上被關(guān)閉而致其不表達(dá)[26]。篩選良好干擾效果的siRNA是進(jìn)行干擾試驗的關(guān)鍵，本研究中選取的S2對的表達(dá)具有顯著的沉默效果。由于在14 d時的表達(dá)水平明顯升高，選擇在14 d時進(jìn)行干擾。qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)干擾后蟲體的表達(dá)顯著降低，且干擾后肝臟減卵率、雌蟲對肝卵貢獻(xiàn)率和卵胚孵化率均顯著降低，說明該基因?qū)θ毡狙x雌蟲的生殖發(fā)育有重要作用。

血吸蟲體被在攝取營養(yǎng)和免疫防御等方面有很重要的作用，它是蟲體和宿主物質(zhì)交換的場所，也是宿主對血吸蟲感染免疫應(yīng)答最直接的部位[27]。血吸蟲在宿主體內(nèi)生長發(fā)育過程中，不同發(fā)育階段蟲體都會出現(xiàn)一些體被蛋白的更換，每個階段都呈現(xiàn)一些特異性或差異表達(dá)的蟲體抗原，使宿主的免疫應(yīng)答難以發(fā)揮免疫殺傷作用[28]。本研究通過特異性靶向干擾SjELAV-like 1基因的表達(dá)，結(jié)果造成蟲體結(jié)構(gòu)異常，會影響蟲體從宿主獲取營養(yǎng)。蟲體體壁結(jié)構(gòu)的改變及體被抗原的改變，能夠使其免疫逃避機(jī)制紊亂，宿主或可通過機(jī)體的免疫應(yīng)答對蟲體產(chǎn)生一定的殺傷作用。

血吸蟲在宿主體內(nèi)營雌雄合抱生活，在合抱的雌、雄蟲之間具有營養(yǎng)性和信號性物質(zhì)的交換，雄蟲為雌蟲提供營養(yǎng)或能夠調(diào)節(jié)雌蟲的生長、代謝、性成熟的物質(zhì)，因此，控制血吸蟲雌雄合抱是控制血吸蟲病的一種策略[29-30]。本研究通過雌雄合抱數(shù)目計數(shù)發(fā)現(xiàn)，實驗組和對照組無顯著性差異，可能與所用實驗動物數(shù)目較少有關(guān)，也可能是該基因沉默并不影響雌雄合抱。血吸蟲雌雄合抱，一般是前后端分別相對應(yīng)的位置，這可能是雌、雄蟲通過體被分布的感覺乳突或分泌型泡狀物結(jié)構(gòu)以識別合抱正確的位置，與雄蟲直接接觸的雌蟲出現(xiàn)卵黃腺及卵巢的發(fā)育，促使卵黃細(xì)胞和卵細(xì)胞的形成[31]。的干擾導(dǎo)致雄蟲體被結(jié)構(gòu)異常，可能會使其感覺乳突、信號性感受器不敏感，影響其對雌蟲識別與信息傳遞，即使合抱的雄蟲可能也無法提供雌蟲生殖發(fā)育所需的物質(zhì)，從而導(dǎo)致雌蟲卵黃腺發(fā)育不良，卵黃細(xì)胞中的卵黃球及卵黃球內(nèi)的卵黃滴減少，且大小不一。皮質(zhì)顆粒廣泛存在于動物界的雌性生殖細(xì)胞中，與受精卵的形成有關(guān)[32-33]。研究發(fā)現(xiàn)，血吸蟲雌雄合抱后的雌蟲卵黃細(xì)胞中出現(xiàn)典型的皮質(zhì)顆粒[34]。皮質(zhì)顆粒呈圓形，一般在同一區(qū)域成串排列，干擾組卵黃細(xì)胞中的皮質(zhì)顆粒大小不一，形狀不規(guī)則，排列無規(guī)律，與對照組有明顯區(qū)別。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是參與細(xì)胞生命活動的重要細(xì)胞器，而干擾后卵黃細(xì)胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，界限不清。血吸蟲雄蟲精母細(xì)胞有較多染色質(zhì)均勻分布，與細(xì)胞分裂、增殖有關(guān)，而干擾組雄蟲精母細(xì)胞中絕大多數(shù)染色質(zhì)消失，且細(xì)胞數(shù)目減少、異常腫大，排列疏松、間質(zhì)增寬。

4 結(jié)論

成功克隆、表達(dá)了SjELAV-like 1基因，該基因沉默引起日本血吸蟲形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變和生殖細(xì)胞亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生病理性變化，表明該基因表達(dá)水平的降低對日本血吸蟲生殖發(fā)育有阻礙作用，可為其作為抗血吸蟲病候選疫苗的分子或藥物靶標(biāo)提供理論依據(jù)。

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（責(zé)任編輯 林鑒非）

Cloning, Expression and Function Analysis of

XU Rong1,2, ZHANG YuanYuan1,2, LI XiaoChun2,3, CHENG GuiFeng1,2, HE ChuanChuan2, GUO Lu2, LI Hao2, LIU JinMing2, GU ShaoPeng1, JIN YaMei2

(1College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi;2Shanghai Veterinary Research, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Animal Parasitology, Ministry of Agriculture, Shanghai 200241;3College of life science, Shanghai Normal University, Shanghai 200234)

【Objective】Cloning and expressing ofembryonic lethal abnormal vision like 1(SjELAV- like 1) gene and analyzing the expression status in different stages and at different infected conditions as well as its distributions in the worms of(). This study also intend to explore the effects ofon the morphology and reproductive development of【Method】 The RACE technique was used to amplify the 5′/3′ end of thegene, the obtained sequence was submitted to NCBI, Gene Bank accession number: MG515727. The recombinant plasmid pET28-was constructed and expressed inBL21 by IPTG induction, then the products were collected at different time. The SDS-PAGE was used for protein analysis. His-tagnickel column affinity chromatography was used to purify the recombinant protein. The purified recombinant protein was used to immune mouse to obtain the polyclonal antibody, which was used to analyze the immunogenicity of the recombinant protein by western blotting and detect the distributions of SjELAV-like 1 protein inby indirect immunofluorescence assay. The mice infected by cercaria ofin the abdomen were used to collect mixture and the females and males separated by paired worms at different stages. The mice infected by cercaria escaped from the single nails were used to collect the unisexual worms at the 25th day. The expression level ofwere detected by quantitative real-time PCR (qRT-PCR). The gene silence was performed by tail vein injection of small interference RNA(siRNA) in infected mice. The long-term RNA interference(RNAi) assay was performed to analyze the effects ofgene silence onthe spawning and egg hatching of females.The tegument structures and reproductive organs of the females and males ofwere observed by scanning electron microscopy and transmission electron microscopy after RNAi.【Result】In this study, a 1 797 bp sequence ofwas obtained, whose coding region was 1 533 bp encoding 510 amino acids. The expression of the recombinant plasmid reached its highest after 4 h of IPTG induction and it mainly existed in the form of inclusion bodies. High quality polyclonal antibody was obtained against the purified protein. SjELAV-like 1 protein was mainly located in the tegument of the worms.was expressed in all stages ofand the expression was stable in males but gradually became less in females as the maturing of the worms. Expression ofwas higher in development impaired females compared with the normal worms. In the RNAi assay, the long-term interference group showed that liver egg burden,liver egg burden by per female and egg hatching rate in interference group were reduced by 58.27% (＜0.05), 40.59% (＜0.01) and 74.58% (＜0.01) compared with NC group, respectively. Electron microscopy observation found that the tegument structures of the worms in interference group were obviously different from that in NC group. The surface bubble adhere to the surface of males disappeared, the three-dimensional fold ridge collapsed, the funicular surface ridge arranged loosely and the network structure of the body wall disappeared. The body surface gap increased and the spines on the body wall of the female were dull. The number of spermatocyte in the males was decreased and the intracellular chromatin was reduced, while the cells were swollen and the intercellular space was widen. In females ofthe vitelline globules in vitelline cells were decreased, in which the vitelline droplets were also reduced, the endoplasmic reticulum was swollen and the cortical particles were scattered.【Conclusion】Part sequence ofwas successfully cloned and expressed, which was robustly expressed in development impaired females.was mainly expressed in the tegument of.silence led to decrease of liver egg burden, liver egg burden by per female and egg hatching rate.silence also altered the tegument structures of the worms and hindered its development of reproductive glands. These all suggested thatplay an important role in the development of the reproduction of

;; prokaryotic expression; immunolocalization; RNAi; electron microscope

2017-12-28；

2018-04-16

國家自然科學(xué)基金（31672245）、上海市自然科學(xué)基金（16ZR1444100）

許蓉，Tel：18235412515；E-mail：363793516@qq.com。

古少鵬，Tel：13834838308；E-mail：shpgu@163.com。 通訊作者金亞美，Tel：18621919182；E-mail：yameijin@shvri.ac.cn

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.13.015