克癀膠囊體外抑菌作用的研究

馬鴻杰 毛新 鄧若娟 劉傳靈 傅月亮

克癀由三七、黃連、黃芩、黃柏、大黃、白花蛇舌草、山銀花、人工牛黃、皂角刺、人工麝香、石菖蒲、甘草等十六味中藥組成, 經生物發(fā)酵等工藝加工制成膠囊, 具有清熱解毒、化瘀散結、活血利濕、利膽退黃等功效。其中三七為方中君藥, 有文獻報道［1］, 黃連、牛黃、黃芩、麝香、石菖蒲、甘草均能不同程度的抑制細菌生長, 黃連對金黃色葡萄球菌的抑菌作用最強；金銀花對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌均有不同程度的抑制作用［2］；牛黃解毒片對急性滲出性炎癥有明顯抑制作用, 對耐藥金黃色葡萄球菌等有明顯抑制作用、對綠膿桿菌等無明顯影響［3］；馬萬霞等［4］以大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、酵母菌進行體外抑菌試驗,結果表明5種中藥提取液對4種菌的抑菌效果明顯［5-7］?？笋ツz囊是應用中藥發(fā)酵工藝并投入生產的為數(shù)不多的幾個品種之一, 發(fā)酵中藥所包含的成分極其復雜, 對其成分分離純化有較大的難度, 本文為了更加客觀科學的描述克癀膠囊的應用功能, 采用了牛津杯法以及藥敏紙片法體外實驗的方式進一步驗證了克癀膠囊對細菌的抑制作用。

1 材料與方法

1. 1 材料

1. 1. 1 菌種 金黃色葡萄球菌：國家微生物資源平臺,第3代；白色念珠菌：國家微生物資源平臺, 第2代；大腸埃希菌：中國食品藥品檢定研究院第, 第2代；銅綠假單胞菌：中國食品藥品檢定研究院, 第2代。

1. 1. 2 藥物 克癀膠囊(深圳同安藥業(yè)有限公司, 0.4 g/粒)；京制牛黃解毒片(北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠,0.6 g/片)；蒲地藍消炎膠囊(廣東心寶藥業(yè)科技有限公司,0.4 g/粒)；氨芐西林(中國食品藥品檢定研究院, 規(guī)格10 μg/ml)。上述藥品按照2015年版《中國藥典》鑒定合格。

1. 1. 3 試劑與儀器 MH瓊脂培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)；MH肉湯培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)；TSA平板(上海諾狄微生物科技有限公司)；3 ml 0.85%NaCl培養(yǎng)基(bioMerieux sa)；pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)；雙圈定量濾紙(中速)；立式高壓滅菌鍋；生物安全柜；生化培養(yǎng)箱；烘箱；打孔機；電子比濁儀。

1. 2 方法

1. 2. 1 藥液的制備 克黃膠囊抑菌作用初篩試驗濃度：無菌取克癀膠囊16粒, 溶于25 ml pH=7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液中, 浸泡1～2 h, 4000 r/min, 離心30 min后, 無菌取上清液, 濃度為0.256 g/ml；氨芐西林對照品10 μg/ml, 用0.01 mol/L鹽酸、磷酸鹽緩沖液稀釋成1 μg/ml為陽性對照；pH=7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液為陰性對照。

克癀膠囊、蒲地藍消炎膠囊、京制牛黃解毒片藥液對金黃色葡萄球菌抑菌效果對比初篩試驗濃度：分別無菌取克癀膠囊8粒、5片京制牛黃解毒片、6粒蒲地藍消炎膠囊溶于10 ml pH=7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液中, 浸泡1～2 h,4000 r/min, 離心30 min后, 無菌取上清液, 濃度分別為0.32、0.30、0.24 g/ml。用pH=7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液分別對三種藥液進行倍比稀釋, 濃度分別為0.32、0.16、0.08 g/ml, 0.30、0.15、0.075 g/ml, 0.24、0.12、0.06 g/ml。

藥敏紙片法抑菌試驗濃度：上述方法制備克癀膠囊濃度分別為0.40、0.20、0.10、0.05 g/ml；蒲地藍膠囊濃度為濃度為0.32、0.16、0.08、0.04 g/ml；京制牛黃解毒片藥液濃度分別為 0.50、0.25、0.125、0.0625 g/ml。

1. 2. 2 菌懸液的制備 將受試菌種金黃色葡萄球菌(或大腸埃希菌或銅綠假單胞菌或白色念珠菌)接種至9 cm TSA平板 , 于 30～35℃培養(yǎng) 16～18 h ；取 3 ml 0.85%NaCl培養(yǎng)基 , 用無菌棉簽挑取數(shù)個單菌落, 研磨均勻, 滴管反復吹打均勻,用電子比濁儀測量麥氏濃度, 取0.6、0.8、0.7、2.1 MCF濃度的菌懸液, 用平皿計數(shù)得出107cfu/ml菌懸液對應的麥氏濃度。

1. 2. 3 測定平板的制備 取直徑約9 cm的平皿, 倒入20～25 ml溫度＜45℃滅菌的MH瓊脂培養(yǎng)基, 鋪制約4 mm厚的測定板底層, 冷卻凝固后, 用無菌棉拭蘸取107個/ml(對應的麥氏濃度)的菌液(金黃色葡萄球菌或大腸埃希菌或銅綠假單胞菌或白色念珠菌), 在管內壁液面上方旋轉緊壓,將多余菌液擠去, 然后在MH瓊脂培養(yǎng)基表面均勻涂布接種2次, 每次旋轉平板60°以確保接種菌的均勻分布, 最后沿平板內緣涂抹1周。接種好的平板, 可敞開蓋子在室溫下干燥 3～5 min。

1. 2. 4 藥敏紙片擴散法 用打孔機將10張雙圈定量濾紙(中速)打出直徑7 mm空白紙片, 置于玻璃平皿中, 用滅菌袋封好, 121℃滅菌30 min, 取出放置 37℃干燥箱烘干。用鑷子夾取已滅菌紙片, 在每個接種的MH瓊脂培養(yǎng)基平板中貼4個滅菌紙片, 紙片間隔、紙片與培養(yǎng)基邊緣的距離應≥2 cm。

2 結果

2. 1 初篩試驗(牛津杯法)

2. 1. 1 克癀膠囊抑菌作用 在生物安全柜中, 將4個牛津杯均勻放置在4種菌測定平板上, 牛津杯間隔距離應≥2 cm,其中2個牛津杯分別加入200 μl濃度0.256 g/ml的克癀膠囊藥液、1個加入200 μl含1 μg/ml的氨芐西林對照品、1個加入pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液200 μl作為陰性對照。置陶瓦蓋內于37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h, 觀察并測量抑菌圈直徑的大小(抑菌圈越大說明其抑菌作用越強)?？笋ツz囊對金黃色葡萄球菌有一定抑菌效果, 但低于氨芐西林, 對大腸埃希菌或銅綠假單胞菌或白色念珠菌無抑菌作用。見表1。

2. 1. 2 克癀膠囊、蒲地藍消炎膠囊、京制牛黃解毒片藥液對金黃色葡萄球菌抑菌效果初步對比 在牛津杯中分別加入3個不同濃度的克癀膠囊藥液、蒲地藍膠囊藥液、京制牛黃解毒片藥液和pH=7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液(陰性對照)各200 μl。37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后, 觀察各濃度藥液對金黃色葡萄球菌的抑菌性, 測量抑菌圈直徑的大小?？笋ツz囊藥液的濃度對金黃色葡萄球菌抑制有關, 即藥液濃度越高,抑菌能力越強。見表2。

表1 克癀膠囊藥液對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌的抑菌初篩結果(cm)

表2 不同濃度的克癀膠囊、蒲地藍消炎膠囊、京制牛黃解毒片對金黃色葡萄球菌的抑菌性結果(cm)

2. 2 克癀膠囊對金黃色葡萄球菌的MIC值測定

2. 2. 1 藥敏紙片擴散法 平皿1分別加入80 μl的0.16g/ml蒲地藍消炎膠囊藥液、0.40 g/ml克癀膠囊藥液、0.20 g/ml克癀膠囊藥液、pH=7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液(陰性對照)；平皿2分別加入80 μl的0.16 g/ml蒲地藍消炎膠囊藥液、0.20 g/ml克癀膠囊藥；0.10 g/ml克癀膠囊藥液、pH=7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液(陰性對照)。將測定平皿于37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后, 觀察并測量抑菌圈直徑的大小?？笋ツz囊對金黃色葡萄球菌的MIC為0.10～0.20 g/ml。見表3。

2. 2. 2 微量肉湯稀釋法 (96孔板法)0.80 g/ml的克癀膠囊藥液, 用移液槍無菌吸取 100 μl, 注入 96孔細胞培養(yǎng)板, 平行2個孔, 然后加入MH肉湯培養(yǎng)基做連續(xù)4次對倍稀釋, 得出0.40、0.20、0.10、0.05 g/ml的克癀膠囊藥液；制作0.32 g/ml濃度的蒲地藍消炎膠囊藥液作為起始濃度, 同法稀釋得出0.32、0.16、0.08、0.04 g/ml的蒲地藍膠囊藥液作為對照；將以上藥液孔加入含菌量≤100 cfu的金黃色葡萄球菌20 μl/孔,用20 μl菌液代替藥液、加入100 μl MH培養(yǎng)基作為陽性對照, 20 μl MH培養(yǎng)基加入100 μl MH培養(yǎng)基作為陰性對照。置37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后, 置于顯微鏡下觀察是否有菌生長, 每孔分別取30 μl 培養(yǎng)物用 TSA平板上涂布, 于30～35℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48 h, 觀察是否有菌生長?？笋ツz囊對金黃色葡萄球菌的MIC值為0.10～0.20 g/ml。見表4。

表3 不同濃度的克癀膠囊對金黃色葡萄球菌的抑菌作用(cm)

表4 微量肉湯稀釋法對克癀膠囊對金黃色葡萄球菌的MIC值的測定

3 討論

抗生素的應用使人類許多嚴重的細菌感染性疾病得到有效控制。然而由于抗生素的不合理使用導致了大量耐藥性細菌的出現(xiàn), 降低了現(xiàn)有抗生素的應用效率, 耐藥性細菌感染嚴重地威脅著人類的健康［8,9］。研究和開發(fā)抗菌中藥對解決耐藥菌株的產生和抗生素短缺問題具有重要意義, 傳統(tǒng)中藥對常見病原細菌具有一定的抑制作用。但不同中藥對不同細菌表現(xiàn)不同的抑菌作用［10,11］。

實驗結果表明, 克癀膠囊藥液的濃度對金黃色葡萄球菌抑制有關, 即藥液濃度越高, 抑菌能力越強, 其對金黃色葡萄球菌的MIC為0.10～0.20 g/ml。而克癀膠囊對大腸埃希菌或銅綠假單胞菌或白色念珠菌無抑菌作用。通過研究可以看到, 克癀膠囊的對金黃色葡萄球菌的抑菌作用較強, 且隨著濃度的提高, 其抑菌能力越強。而另外2種藥物對金黃色葡萄球菌的的體外抑制作用較弱。目前, 金黃色葡萄球菌耐藥性問題是臨床治療中面臨的一大難題。大量研究報道也指出,黃連對耐甲氧西林的葡萄球菌具有一定的抑菌作用［12,13］, 克癀膠囊成分較為復雜, 如果能夠進一步對克癀膠囊的抑菌機理進行闡述, 將有助于在金葡菌感染中嘗試應用中藥克簧進行治療。在傳統(tǒng)中藥中進行抗菌藥物的發(fā)掘, 將有助于發(fā)揮傳統(tǒng)中藥在臨床抗感染中的應用, 本研究將為克癀膠囊的臨床應用提供科學的的實驗數(shù)據。

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