一種微孔板法檢測食品中添加維生素B12含量的方法

高利海

維生素B 12（V B 12），又稱鈷胺素（Cobalamin），是人體中非常重要的水溶性維生素之一，主要用于嬰幼兒奶粉、谷物食品、保健食品、乳品和功能性飲料等食品中營養(yǎng)強(qiáng)化。目前針對食品中B12檢測方法，國標(biāo)有GB 5009.217《保健食品中維生素B12測定》、GB 5413.14《嬰幼兒食品和乳品中維生素B12測定》，但由于食品成分復(fù)雜、存在多種干擾因素，因此化學(xué)分析法的應(yīng)用受到限制，目前國際仍以微生物法作為首選方法。

雖然微生物法檢測VB12具有較高的靈敏度和精確度，但GB5413.14方法，步驟繁瑣、操作耗時(shí)、檢測周期長、易受外部因素干擾等諸多問題。本文采用德國拜發(fā)公司微孔板法對嬰幼兒配方奶粉、谷物米粉、含乳飲料、功能飲料等食品中添加VB12含量的測定，實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性非常好。

材料與方法

材料與儀器：VitaFast Vitamin B12試劑盒（德國拜發(fā)P1002）、微量移液器20- 200μl；100- 1000μl（eppendorf）、50ml離心管，2.0 ml EP管、一次性無菌注射器（帶0.2μm無菌濾膜）（Axygen）；生物安全柜（賽默飛世爾1374）、酶標(biāo)儀（BioTek Instruments ELX808）、恒溫培養(yǎng)箱（精宏GNP- 9270）、電熱恒溫水浴鍋（精宏DK-8D）

實(shí)驗(yàn)方法。

（1）樣品處理：稱取1g（ml）樣品（精確至0.001g），加40 ml的無菌蒸餾水溶解，放于50 ml帶蓋離心管中，于95℃水浴鍋保溫30min，期間至少搖晃4- 5次。迅速放于4℃冰箱冷卻至30℃以下，用無菌注射器吸取樣品過濾0.45μm濾膜，取所需樣品于2 ml離心管，稀釋至所需倍數(shù)。

（2）制備標(biāo)準(zhǔn)溶液：表1為標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋梯度。按照說明書向B12標(biāo)準(zhǔn)品干粉的小瓶內(nèi)加入適量無菌水，混勻。按表1順序加無菌水、標(biāo)準(zhǔn)品和測定用培養(yǎng)基于2ml EP管，一式3份。測定培養(yǎng)基按照說明書加10ml無菌水，搖勻，95℃水浴5 min，期間振蕩至少5次，迅速放于4℃冰箱冷卻至30℃以下，用0.45um濾膜過濾待用。

（3）樣品檢測：取出所需微孔板條固定于板上，先加150ul培養(yǎng)基至各微孔中，然后依次加150 ul的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品至各微孔中，一式三份。用粘合箔蓋住板條和微孔，用手將粘合箔平壓，使其充分封閉微孔板條。

（4）培養(yǎng)：3 7℃黑暗條件下培育44h- 48h。

（5）測定：將微孔板倒置桌面上，振蕩，使微生物溶解于培養(yǎng)基中。然后將微孔板翻回前置于桌面上，從對角線方向輕扯下粘合箔，務(wù)必另一只手按壓放置在桌面上的微孔板，以防止粘合過緊撕扯帶起微孔板。用酶標(biāo)儀630nm條件下讀取數(shù)值。

結(jié)果與分析

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以維生素B12含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖1，試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線在0.03- 0.18ug/100g范圍內(nèi)線性均良好，相關(guān)系數(shù)為1，檢測限可達(dá)到0.03ug/100g

重復(fù)性：選取配方乳粉（2份）、配方米粉、含乳飲料、功能飲料為試驗(yàn)樣品，每個(gè)樣品作6次平行試驗(yàn)，測試結(jié)果見表2，5種樣品6次平行測試的RSD在3.9%- 6.9%之間，說明重復(fù)性良好。

加標(biāo)回收率：選擇已知維生素B12含量的標(biāo)準(zhǔn)品加入同一乳粉中，加標(biāo)量分別為250.0ng，150.0ng，100.0ng，進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果如表3，回收率為94.2%- 100.8%，試驗(yàn)靈敏度較高。

小結(jié)與討論

應(yīng)用微生物法檢測維生素B12，其準(zhǔn)確度與靈敏度取決于試驗(yàn)中乳桿菌數(shù)量、活力、培養(yǎng)基、樣品處理方式以及人員操作等因素。商品化試劑盒通過一定工藝水平將菌株固定在微孔板上，減少菌株活力、培養(yǎng)基等造成的誤差，但操作中仍需要注意，1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因?yàn)槲⑸锷L是非線性的，隨著VB12濃度增加，吸光度的增長漸緩慢；2.使用Ridawin數(shù)據(jù)處理軟件，采用多項(xiàng)式曲線擬合法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線更符合菌株的實(shí)際生長情況；3.需無菌操作，移液器槍頭、離心管、過濾膜等需提前滅菌，以避免外來微生物的污染。本文采用微孔板法測試5種食品添加的VB12，定量限在0.03- 0.18ug/100g（ml）范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)為1，重復(fù)性試驗(yàn)中，樣品的平行性較好，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.9% - 6.9%，加標(biāo)回收率在94.2% -100.8%，相對繁瑣的國標(biāo)方法，微孔板法是一種操作簡單、快捷、準(zhǔn)確度和重復(fù)性良好，適合各實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用。