米面制品中蠟樣芽胞桿菌平板計數(shù)法的不確定度評定

薛麗芝

需氧性芽胞桿菌引起的食物中毒早在1906年就有報告（Lubenau）。但直至1950年始，方明確吃甜食后引起蠟樣芽胞桿菌所致的食物中毒腹瀉。在國內(nèi)，1973年首次報告了南京某托兒所兒童因進食泡飯引起的嘔吐型蠟樣芽胞桿菌食物中毒。目前，蠟樣芽孢桿菌所引起的食物中毒在我國細菌性食物中毒中位居前3位。

蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）是一種需氧、能形成芽胞的革蘭氏陽性粗桿菌。該菌在自然界中分布廣泛，污染食品機會較多。蠟樣芽胞桿菌食物中毒所涉及的食品種類繁多，包括乳制品、禽畜肉類制品、蔬菜、湯汁、馬鈴薯泥、豆芽、甜點心、調(diào)味汁、色拉和米飯等。而在我國引起中毒的食品大多與米飯或淀粉類制品有關(guān)。蠟樣芽胞桿菌引發(fā)中毒的食品除米飯微有發(fā)粘和略帶異味外，一般均無腐敗變質(zhì)現(xiàn)象，所以不易被發(fā)現(xiàn)。此外，蠟樣芽胞桿菌造成的食物中毒存在明顯的季節(jié)性，以夏秋季（6～10月）為最多。

測量不確定度是表征合理地賦予被測量之值的分散性，是與測量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)，在化學分析中應用較多，但在微生物檢驗中應用并不多。隨著食品微生物學的發(fā)展，食品中微生物限量指標是評價食品質(zhì)量的重要指標之一。食用食品中含蠟樣芽胞桿菌達105個以上時就可引起食物中毒。在現(xiàn)行食品安全國家標準中許多微生物指標要求檢測結(jié)果為定量報告，如蠟樣芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌等，而蠟樣芽胞桿菌的計數(shù)存在很大的分散性，故做好蠟樣芽胞桿菌計數(shù)不確定度的評定非常重要，也對實驗室提出了更高的要求。

因此，本研究依據(jù)《GB4789.14- 2014食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 蠟樣芽胞桿菌檢驗》對市售20個米面制品制品進行蠟樣芽胞桿菌的測定，將測定結(jié)果取對數(shù)后，依據(jù)《CNAS- GL05測量不確定度要求的實施指南》用合并樣本標準差求蠟樣芽胞桿菌的測定結(jié)果的不確定度，進而說明合并樣本標準差法評定食品微生物學檢驗中蠟樣芽胞桿菌檢驗結(jié)果不確定度是否合適。

檢驗方法和材料

檢驗方法。依據(jù)《GB4789.14- 2014食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 蠟樣芽胞桿菌檢驗》蠟樣芽胞桿菌平板計數(shù)法（第一法）進行檢驗，程序見圖1。

檢驗樣品。本次樣品均為市售米面制品制品，并含可計算得出數(shù)目的蠟樣芽胞桿菌固體樣品，總件數(shù)為20件。

檢驗材料。本次檢驗均采用《GB4789.14- 2014食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 蠟樣芽胞桿菌檢驗》所指定的培養(yǎng)基和器材。

檢驗過程。以無菌操作取一米面制品樣品25g剪碎放于225ml滅菌生理鹽水中，經(jīng)均質(zhì)器10000r/min均質(zhì)1min，做成1： 10稀釋樣液。每遞增稀釋1次，換用1支1mL無菌吸管。選擇3個稀釋度，分別做10倍遞增稀釋的同時，每個稀釋度分別吸取1 mL樣品勻液以0.3mL、0.3mL、0.4mL接種量分別加入3塊MYP平板，然后用無菌L棒涂布整個平板，注意不要觸及平板邊緣。等樣品勻液吸收后翻轉(zhuǎn)平皿，倒置于培養(yǎng)箱，30℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h，如果菌落不典型，繼續(xù)培養(yǎng)24h再觀察，計數(shù)。在MYP 瓊脂平板上，典型菌落為微粉紅色（表示不發(fā)酵甘露醇），周圍有白色至淡粉紅色沉淀環(huán)（表示產(chǎn)卵磷脂酶）。

結(jié)果計算。從平板上挑取5個典型菌落（小于5個全選）進行驗證試驗。根據(jù) MYP 平板上蠟樣芽胞桿菌的典型菌落數(shù)，按照公式（1）計算，最后得出樣品中蠟樣芽胞桿菌菌落數(shù)CFU/g。

公式（1）中：T——樣品中蠟樣芽胞桿菌菌落數(shù)，CFU/g

A——MYP平皿蠟樣芽胞桿菌典型菌落的總數(shù)，個

B——驗證試驗確定的蠟樣芽胞桿菌的菌落數(shù)，個

C——用于驗證試驗的蠟樣芽胞桿菌菌落數(shù)，個

d——稀釋因子

不確定度評定

在食品微生物檢驗中，樣品中細菌分布的均勻性和重復測量帶來的不確定度是影響檢驗結(jié)果準確度的主要原因，而B類不確定度分量對合成不確定度影響較少，所以按照《GB4789.14- 2014食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 蠟樣芽胞桿菌檢驗》操作程序，同一樣品每個稀釋度做兩個平行樣，可以采用合并樣品標準差求檢測結(jié)果的不確定度。

由實驗室內(nèi)相同人員對該類米面制品制品20個樣品在短時間內(nèi)按《GB4789.14- 2014食品安全國家標準食品微生物學檢驗 蠟樣芽胞桿菌檢驗》 進行檢驗，每個樣品做2個平行樣，得到的檢驗結(jié)果及對數(shù)值（見表1）。

根據(jù)貝塞爾公式，可計算出合并樣本的標準偏差：

結(jié)果報告

例如4#樣品在MYP平皿上蠟樣芽胞桿菌計數(shù)平行雙樣結(jié)果分別為43個和46個，稀釋倍數(shù)為100倍，計算出其對數(shù)平均值為3.648，所以該樣品蠟樣芽胞桿菌菌落總數(shù)的對數(shù)值為3.648±0.034，取反對數(shù)，其結(jié)果分布于4111～4808之間，所以該樣品蠟樣芽胞桿菌菌落總數(shù)為4.1×103～4.8×103 cfu/g。例如13#樣品在MYP平皿上蠟樣芽胞桿菌計數(shù)平行雙樣結(jié)果分別為28個和31個，稀釋倍數(shù)為100倍，計算出其對數(shù)平均值為3.469，所以該樣品蠟樣芽胞桿菌菌落總數(shù)的對數(shù)值為 3.469±0.034，取反對數(shù)，其結(jié)果分布于2723～3184之間，所以該樣品蠟樣芽胞桿菌菌落總數(shù)為2.7×103～3.2×103 cfu/g。例如14#樣品在MYP平皿上蠟樣芽胞桿菌計數(shù)平行雙樣結(jié)果分別為53個和52個，稀釋倍數(shù)為10倍，計算出其對數(shù)平均值為2.720，所以該樣品蠟樣芽胞桿菌菌落總數(shù)的對數(shù)值為 2.720±0.034，取反對數(shù)，其結(jié)果分布于485～568之間，所以該樣品蠟樣芽胞桿菌菌落總數(shù)為2.7×103～3.2×103 cfu/g。

討論

從以上計算結(jié)果可知，由于檢驗結(jié)果的散發(fā)性較大，如直接用貝塞爾公式計算合并樣本標準差所得到的不確定度不適合每一個樣本。當檢驗結(jié)果取對數(shù)后，用合并樣本標準差求檢驗結(jié)果的不確定度則使用方便，并且適合于每一個樣本。 隨著檢驗結(jié)果的不斷增加，可隨時加入到合并樣本中，重新計算合并樣本標準差，更新其不確定度的取值范圍。

本實驗不確定度的來源可能還有培養(yǎng)時間，培養(yǎng)溫度，刻度吸管的不確定度等，不確定度因素來源具體分析：

（1）稱量，天平經(jīng)檢定合格，本次不涉及；

（2）培養(yǎng)時間，在正常規(guī)定范圍內(nèi)，不影響；

（3）培養(yǎng)溫度，經(jīng)校正，波幅在正常范圍內(nèi)，不影響；

（4）環(huán)境溫度、濕度，在正常在范圍內(nèi)，不影響；

（5）同一人員多次操作，每次操作可能存在的小誤差；

（6）移液器經(jīng)檢定合格，但取樣時外壁懸掛的液滴量，有一定小差異；

（7）平皿堆疊的厚薄不均導致可能的培養(yǎng)溫度的不均；

本次實驗過程中可能出現(xiàn)誤差的因素，最終體現(xiàn)在蠟樣芽胞桿菌菌落數(shù)的計數(shù)上，最終計數(shù)的蠟樣芽胞桿菌菌落數(shù)已涵蓋上面分析的多個不確定因素造成的誤差，但這些因素對本實驗不確定度影響較小，可以忽略不計。