基于超臨界二氧化碳萃取的復(fù)合技術(shù)在同種異體骨體外處理的應(yīng)用

鮮 海，劉舒云，眭 翔，黃靖香，郝春香，魯曉波，郭全義

（1西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院骨與關(guān)節(jié)外科，四川瀘州 646000；2中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院骨科研究所）

骨缺損，尤其是大段骨缺損的治療，一直是臨床難題之一。臨床常用的方法包括：帶血管蒂骨移植手術(shù)、牽引成骨技術(shù)、誘導(dǎo)膜技術(shù)、鈦網(wǎng)cage技術(shù)、組織工程方法等技術(shù)[1]，常用的材料包括：自體骨[2]、同種異體骨、異種骨、骨水泥、生物陶瓷、組織工程骨等[3-5]。這些技術(shù)及材料有各自的適應(yīng)癥和局限性，在臨床應(yīng)用過(guò)程中，需要結(jié)合骨缺損的位置和大小以及周圍條件選擇。

同種異體骨具有大小和形狀不受限制、生物力學(xué)特性和結(jié)構(gòu)與自體骨相似、制備和保存方便等特點(diǎn)，是目前可用于替代自體骨的良好的骨缺損修復(fù)材料[5]。新鮮的同種異體骨由于其較強(qiáng)的免疫原性，導(dǎo)致臨床排異等問(wèn)題，經(jīng)過(guò)深低溫冷凍、物理或者化學(xué)處理可大大降低其免疫原性。但在同種異體骨脫脂、脫蛋白、滅菌、保存過(guò)程中可能導(dǎo)致骨組織原有的骨誘導(dǎo)活性及其生物力學(xué)性能下降。

超臨界二氧化碳是指二氧化碳在臨界條件下（溫度=31.26℃，壓力=72.9 atm）表現(xiàn)為既不是氣體也不是液體的特殊狀態(tài)，其擴(kuò)散能力及溶解能力增加，具有萃取低分子物質(zhì)的能力。由于其反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)過(guò)程無(wú)毒無(wú)殘留且易于操作，它作為溶劑已被廣泛應(yīng)用于化工[6]、食品工業(yè)[7]、生物學(xué)[8]、藥學(xué)[9]、組織工程[10]等領(lǐng)域。本研究通過(guò)評(píng)估基于超臨界二氧化碳萃取的復(fù)合技術(shù)對(duì)豬股骨松質(zhì)骨空間結(jié)構(gòu)、生物特性、力學(xué)特性等的影響，旨在為同種異體骨修復(fù)材料開(kāi)發(fā)更合理的制備技術(shù)。

1 材料和方法

1.1 原材料的獲取及預(yù)處理

將新鮮市售豬股骨（豬骨獲取時(shí)間小于12 h）剔除骨表面肌肉、肌腱、筋膜、骨膜等軟組織，放入足量的純凈水中清洗浸泡1 h，再放入-80°C冰箱內(nèi)凍存24 h。取出豬骨并在4°C冰箱內(nèi)解凍后，用高精度微型臺(tái)鋸將股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨鋸成10 mm×10 mm×10 mm左右的正方形骨塊，所有制備的豬松質(zhì)骨分裝后放入-40°C冰柜保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器

本實(shí)驗(yàn)所用儀器為Nova2200型超臨界二氧化碳清洗設(shè)備（見(jiàn)圖1），它由增壓泵（外接二氧化碳罐，內(nèi)接反應(yīng)容器）、泄壓閥門以及控制這些設(shè)備的電腦組成。它可通過(guò)主屏幕設(shè)置參數(shù)并控制反應(yīng)容器內(nèi)部壓力和溫度，同時(shí)也可控制運(yùn)行時(shí)間及泄壓速度等，當(dāng)壓力不足時(shí)可自行停止運(yùn)行。目前該機(jī)型已被用于心臟瓣膜[11]、肺基質(zhì)[12]、羊膜[13]、牛皮質(zhì)骨[14]等組織滅菌的研究。

圖1 Nova2200型超臨界二氧化碳清洗設(shè)備

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理方法

根據(jù)動(dòng)物骨的處理方法，將研究分成三組：①非超臨界組（對(duì)照組），即豬股骨松質(zhì)骨經(jīng)過(guò)高壓水槍徹底沖洗，再經(jīng)3%雙氧水脫脂滅菌，制備出豬股骨松質(zhì)骨修復(fù)材料，經(jīng)冷凍干燥后獲得1號(hào)材料；②超臨界復(fù)合超聲波組（實(shí)驗(yàn)組1），即豬股骨松質(zhì)骨依次由超聲波清洗離心、超臨界二氧化碳萃取脫脂以及化學(xué)清洗（過(guò)氧化氫、氫氧化鈉）等組成的復(fù)合清洗技術(shù)處理，制備出的豬股骨松質(zhì)骨修復(fù)材料，經(jīng)冷凍干燥后獲得2號(hào)材料；③超臨界復(fù)合高壓水槍組（實(shí)驗(yàn)組2），即豬股骨松質(zhì)骨依次由高壓水槍沖洗、超臨界二氧化碳萃取脫脂以及化學(xué)清洗（過(guò)氧化氫、氫氧化鈉）等組成的復(fù)合清洗技術(shù)處理，制備出的豬股骨松質(zhì)骨修復(fù)材料，經(jīng)冷凍干燥后獲得3號(hào)材料。其中，超臨界組（實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2）主要清洗步驟依次為：第一步：超聲波清洗離心或高壓水槍清洗；第二步：超臨界萃取脫脂；第三步：化學(xué)清洗（過(guò)氧化氫、氫氧化鈉）等，制備所得的所有骨組織經(jīng)冷凍干燥后分裝備用。在第一步和第二步前后以及冷凍干燥后對(duì)豬股骨松質(zhì)骨進(jìn)行拍照稱重。

1.4 主要的評(píng)價(jià)指標(biāo)

1.4.1 超臨界組（實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2）對(duì)豬股骨松質(zhì)骨清洗效率的評(píng)價(jià)

評(píng)估豬股骨松質(zhì)骨在處理前、處理中及處理后外觀變化和質(zhì)量變化，分析實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2步驟中超聲波清洗離心的方法與高壓水槍的方法的差別。

1.4.2 Micro-CT檢測(cè)豬松質(zhì)骨骨小梁變化及骨組織孔隙率初步評(píng)估

1、2、3號(hào)材料中，每組選取三個(gè)骨塊予以Micro-CT掃描儀（美國(guó)GE Healthcare公司，RS-9系統(tǒng)）掃描。主要參數(shù)設(shè)置為：分辨率45μm，掃描電壓80 kv，掃描電流450 mA，曝光時(shí)間200 ms。所得的圖像先進(jìn)性分類，然后再在各組中選擇興趣區(qū)（region of interest，ROI）:ROI Size X=6.0176，Y=6.017 6，Z=6.017 6。根據(jù)數(shù)據(jù)重建骨組織三維結(jié)構(gòu)圖像觀察最小梁完整性，自動(dòng)圖像分析取得最佳閾值，將所得的圖像結(jié)果予以分析得到骨組織體積分?jǐn)?shù)（BVF），反向（1-BVF）求得骨組織孔隙率大小。此值近似于骨組織孔隙率，可作為評(píng)估骨組織孔隙大小的參考。

1.4.3 壓縮力學(xué)檢測(cè)

1、2、3號(hào)材料及未經(jīng)處理的豬松質(zhì)骨，各取三個(gè)樣品進(jìn)行壓縮力學(xué)測(cè)試。骨組織壓縮檢測(cè)在5969力學(xué)試驗(yàn)機(jī)（美國(guó)INSTRON英斯特郎）上完成，實(shí)驗(yàn)測(cè)試期間載荷通過(guò)載荷傳感器進(jìn)行傳遞。將樣品放在工作臺(tái)上，豬骨以2 mm/min的壓縮速度在近似正方體的骨組織上方施壓，直至骨組織發(fā)生變形破裂停止測(cè)試，得出數(shù)據(jù)。根據(jù)記錄的應(yīng)力-應(yīng)變曲線求出彈性模量。對(duì)各組骨組織的極限強(qiáng)度、最大載荷以及彈性模量進(jìn)行比較分析。

1.4.4 細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)

1、2、3號(hào)材料參照浸提液制備的方法制備浸提液，設(shè)置陰性組作對(duì)照，再按照MTT比色法檢測(cè)各組第1、2、3、4 d的OD值，繪制各組細(xì)胞時(shí)間生長(zhǎng)曲線，比較分析三組處理方法所得骨組織對(duì)細(xì)胞毒性的差異。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

力學(xué)原始數(shù)據(jù)予以O(shè)rigin9軟件處理，GraphPad Prism 6作圖，統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行，計(jì)量資料用x±s表示，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），分類資料用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 超臨界組（實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2）對(duì)異種骨處理效率的評(píng)價(jià)。

從各步驟豬股骨松質(zhì)骨外觀變化來(lái)看，實(shí)驗(yàn)組1及實(shí)驗(yàn)組2兩組方法處理獲得的2號(hào)材料和3號(hào)材料呈白色，未見(jiàn)骨髓及脂肪附著，且骨組織結(jié)構(gòu)較為完整。高壓水槍清洗后的豬骨松質(zhì)骨較超聲波清洗后的骨組織干凈，較少骨髓及脂肪殘留。

從各步驟豬股骨松質(zhì)骨質(zhì)量變化來(lái)看，豬股骨松質(zhì)骨經(jīng)實(shí)驗(yàn)組1及實(shí)驗(yàn)組2兩組方法處理后重量分別下降60.93%和61.96%。其中，超聲波清洗離心、高壓水槍沖洗可豬股骨松質(zhì)骨重量分別下降5.96%和46.63%，高壓水槍沖洗的方法清洗效率高于超聲波清洗離心法（見(jiàn)圖2）。

圖2 實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2處理過(guò)程對(duì)豬股骨的外觀及重量影響

2.2 三組方法對(duì)骨小梁的影響及骨組織孔隙率初步評(píng)估

三組方法處理后的豬松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)明顯破壞。三種方法處理的豬松質(zhì)骨孔隙率進(jìn)行整體比較無(wú)明顯變化,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（見(jiàn)表1，圖3）。

表1 豬股骨松質(zhì)骨孔隙率（x±s）

圖3 1、2、3號(hào)材料經(jīng)Micro-CT掃描獲得骨小梁三維圖像

2.3 三組處理方法對(duì)豬股骨松質(zhì)骨壓縮力學(xué)的影響

未經(jīng)處理的豬股骨松質(zhì)骨（原材料）、1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)材料的壓縮力學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行Origin 9軟件處理；1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)材料的極限強(qiáng)度、最大載荷和彈性模量分別與原材料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），可認(rèn)為對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)1、2組的方法不會(huì)導(dǎo)致豬股骨壓縮力學(xué)發(fā)生改變。四類材料的骨組織極限強(qiáng)度、最大載荷及彈性模量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（見(jiàn)表2）。

2.4 細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)

本實(shí)驗(yàn)對(duì)1、2、3號(hào)材料的細(xì)胞毒性（MTT試驗(yàn)）進(jìn)行了評(píng)價(jià)（見(jiàn)圖4），發(fā)現(xiàn)三組第1、2、3、4 d的OD值與陰性組比較未見(jiàn)組間差異（P＞0.05），無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 原材料及1、2、3號(hào)材料壓縮力學(xué)結(jié)果比較（x±s）

圖4 各組細(xì)胞毒性（MTT試驗(yàn)）結(jié)果

3 討 論

同種異體骨臨床應(yīng)用十分廣泛。在大段骨缺損結(jié)構(gòu)性植骨的患者中發(fā)生骨折的風(fēng)險(xiǎn)仍然較高。在同種異體骨脫脂、脫蛋白、滅菌以及保存的過(guò)程中，物理或者化學(xué)的方法可導(dǎo)致生物力學(xué)的改變或有毒有害試劑殘留?；诔R界二氧化碳萃取的復(fù)合清洗技術(shù)自身有以下優(yōu)點(diǎn)：超聲波清洗離心或者高壓水槍清洗可有效去除骨組織內(nèi)部大部分骨髓及脂肪。有文獻(xiàn)報(bào)道利用高壓脈沖的方式可使同種異體骨的脂肪含量下降95%[15]。該步驟可降低骨組織脂肪負(fù)荷，減少超臨界二氧化碳萃取時(shí)間，節(jié)約成本。同時(shí)，超臨界二氧化碳更容易經(jīng)孔隙進(jìn)入骨組織內(nèi)部，有利于微孔內(nèi)油脂的萃取分離?；瘜W(xué)清洗中，過(guò)氧化氫溶液可以進(jìn)一步氧化脫脂及滅菌，氫氧化鈉可皂化脂肪及脫蛋白。在經(jīng)過(guò)冷凍干燥后的骨組織便于常溫保存。本實(shí)驗(yàn)中超聲波清洗離心或者高壓水槍清洗的步驟顯示出很好的清洗作用同時(shí)不損害豬股骨松質(zhì)骨小梁結(jié)構(gòu)?；诔R界二氧化碳萃取的復(fù)合清洗技術(shù)與對(duì)照組方法相比，均不會(huì)導(dǎo)致豬股骨松質(zhì)骨小梁結(jié)構(gòu)破壞，保留了豬股骨松質(zhì)骨原有的孔隙及孔隙率。周騰[16]利用仿真建模和有限元分析研究發(fā)現(xiàn)多孔支架宏孔和貫通孔的尺寸與成骨性能有顯著關(guān)系，故良好的孔隙結(jié)構(gòu)有利于血管長(zhǎng)入，促進(jìn)骨再生。經(jīng)基于超臨界二氧化碳萃取的復(fù)合清洗技術(shù)處理的骨組織與未處理的骨組織壓縮力學(xué)比較發(fā)現(xiàn)強(qiáng)度極限、最大載荷以及彈性模量未發(fā)生改變。這一點(diǎn)與Mitton等[17]的研究一致。Mitton將人股骨頭分為兩半，一半進(jìn)行超臨界處理，一半凍存，最后進(jìn)行力學(xué)對(duì)比測(cè)試發(fā)現(xiàn)，超臨界二氧化碳萃取技術(shù)不會(huì)導(dǎo)致骨組織力學(xué)改變?；诔R界二氧化碳萃取的復(fù)合清洗技術(shù)處理的骨組織經(jīng)細(xì)胞毒性檢測(cè)（MTT法）提示無(wú)細(xì)胞毒性，可認(rèn)為該技術(shù)不會(huì)導(dǎo)致有毒試劑殘留，處理過(guò)程安全。

基于超臨界二氧化碳萃取的復(fù)合清洗技術(shù)是一種安全、可靠的技術(shù)，它在異種松質(zhì)骨脫脂脫蛋白等處理方面顯示了較好的效果，同時(shí)保留了松質(zhì)骨原有的生物力學(xué)結(jié)構(gòu)，且無(wú)毒性試劑殘留。故該方法亦可用于同種異體骨修復(fù)材料的制備。本實(shí)驗(yàn)在超臨界二氧化碳萃取過(guò)程中添加過(guò)氧化氫提示了較好的脫脂能力。因此，當(dāng)添加合適的夾帶劑可開(kāi)發(fā)超臨界二氧化碳新的功能。目前已有報(bào)道在超臨界二氧化碳中添加乙醇可達(dá)到脫細(xì)胞的目的，已被開(kāi)發(fā)用于豬角膜[18]、老鼠心臟[19]、綿羊主動(dòng)脈[20]等組織的脫細(xì)胞的研究。超臨界二氧化碳技是一種綠色安全的技術(shù)可被進(jìn)一步開(kāi)發(fā)。

4 結(jié) 論

超臨界二氧化碳萃取技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。基于超臨界二氧化碳萃取的復(fù)合清洗技術(shù)脫脂處理后的松質(zhì)骨展示出良好的生物力學(xué)性能及安全性。該技術(shù)中超聲波及高壓槍沖洗步驟可為超臨界萃取減少負(fù)擔(dān)，而且額外的化學(xué)清洗步驟不僅能脫脂還具有滅菌功效，用于同種異體骨脫脂等加工可能降低疾病傳播風(fēng)險(xiǎn)，因此基于超臨界二氧化碳萃取的復(fù)合清洗技術(shù)是一種綠色安全可靠的技術(shù)。

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