白藜蘆醇對糖尿病大鼠血管平滑肌細胞凋亡的影響及其機制研究

李 燕 白立煒 王 濤 曹 萌 翟倩倩

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院內分泌科，新鄉(xiāng) 453100)

糖尿病是由多種因素引發(fā)的復雜的慢性疾病，且伴有多種并發(fā)癥。糖尿病患者容易出現(xiàn)高血壓、動脈粥樣硬化、血脂異常、心肌梗死、中風、眼病、腎病及神經(jīng)性疾病等癥狀。隨著生活現(xiàn)代化程度的加大，越來越多的人正遭受糖尿病的折磨，1980年美國患糖尿病的人數(shù)為560萬，2011年就增加到了2 090萬，且糖尿病的發(fā)生帶來了巨大的財政負擔[1]。中國糖尿病的發(fā)病率從1980年的0.9%上升到2010年的11.6%，2013年中國糖尿病患者占全球糖尿病患者的四分之一，且有將近50.1%的人患有前驅糖尿病[2]。國際糖尿病聯(lián)盟估計糖尿病的患病數(shù)將從2011年的3.66億增加到2030年的5.52億[3]。糖尿病治療是醫(yī)療健康事業(yè)的重大課題。白藜蘆醇是一種天然的多酚類物質，可從多種植物中提取[4]。白藜蘆醇在新陳代謝及心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病及癌癥中具有重要的保護作用[5-8]。本文主要研究在高糖高脂喂養(yǎng)下鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)誘導的糖尿病大鼠模型中，白藜蘆醇對血管平滑肌細胞凋亡的調控作用及其分子機制。

1 材料與方法

1.1動物及主要試劑 40只8周齡成熟雄性清潔級大鼠購自四川省醫(yī)學科學院實驗動物研究中心。白藜蘆醇和STZ購自美國Sigma公司。DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清購自賽默飛世爾科技公司。Masson 三色染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9、B淋巴瘤2蛋白(B cell lymphoma 2,Bcl-2)和Bcl-2相關蛋白X (Bcl-2-associated X protein,Bax)及PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT的抗體購自Abcam公司。

1.2方法

1.2.1糖尿病大鼠模型的建立及藥物處理 40只大鼠隨機平均分為4組，分別為對照組(n=10)、對照+白藜蘆醇組(n=10)； STZ誘導的糖尿病組(n=10)、STZ+白藜蘆醇組(n=10)。STZ誘導的糖尿病組和STZ+白藜蘆醇組用高糖高脂飼料和小劑量腹腔多次連續(xù)注射STZ，連續(xù)5 d，每次60 mg/kg，從尾靜脈采集全血分析血糖水平。若血糖水平連續(xù)3 d 超過12 mmol/L則判定為糖尿病。對照組給同等體積檸檬酸鹽緩沖液。在大鼠確診為糖尿病后，白藜蘆醇組立即給予白藜蘆醇灌胃[10 mg/(kg·d)]，并開始從1計數(shù)實驗天數(shù)，對照組和糖尿病組同期均接受同等體積蒸餾水灌胃處理，持續(xù)到第9周時，每組小鼠應用頸椎脫臼法處死，取上腔靜脈血液。

1.2.2實時定量PCR (Quantitative real-time reverse transcription PCR,qRT-PCR) RNA提取試劑盒提取血清中總RNA后反轉成cDNA，以此cDNA為模板進行qRT-PCR。MCP-1上游引物：GCTCGCTCAGCCAGATGCAAT，MCP-1下游引物：TGGGTTGTGGAGTGAGTGTTC。MIF上游引物：GGCCTCACTT-ACCTGCACC，MIF下游引物：ACCATTTATTTCT-CCCGACC。IL-18上游引物：ATATCGACCGAACAGCCAAC，IL-18下游引物：TGGCACACGTTTCTG-AAAGA。根據(jù)SYBR Premix Ex TaqTM說明書進行qRT-PCR，用公式2-ΔΔCt計算相對表達量。

1.2.3蘇木素伊紅(HE)染色和Masson染色 白藜蘆醇處理9周后，頸椎脫臼法處死大鼠后取左心室心肌組織用多聚甲醛進行固定，經(jīng)脫水石蠟包埋后進行切片(4 μm)。切片脫蠟至水后按照蘇木素伊紅(HE)染色液說明書進行蘇木素伊紅(HE)染色。光鏡下觀察心肌纖維化情況。為了進行Masson染色，首先將切片(4 μm)脫蠟至水，然后按照Masson 三色染色試劑盒說明書進行染色，鏡下觀察并拍照。細胞核呈藍色，胞漿、肌肉、紅細胞呈紅色，膠原纖維/蛋白呈藍色。

1.2.4血管平滑肌細胞的原代分離培養(yǎng)及藥物處理 首先取出對照組和STZ誘導的糖尿病組主動脈放入裝有無菌的D-Hank′s液培養(yǎng)皿中進行洗滌。體式顯微鏡下去除血管外膜，縱向切開血管壁，刮除內膜留下中膜，去除中膜外組織雜質。然后將剝離出來的中膜放入DMEM培養(yǎng)基并剪碎，離心去上清，取沉淀加入0.5%EDTA鈉鹽消化30 s，加入DMEM培養(yǎng)基終止消化。最后離心棄上清并用新鮮培養(yǎng)基重懸，再移入培養(yǎng)瓶中貼附于底面。輕輕翻轉培養(yǎng)瓶，置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 h后，組織塊貼壁后翻轉培養(yǎng)瓶，加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液使組織塊全部浸沒在培養(yǎng)液中，繼續(xù)靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)8～12 d后觀察，當80%細胞已融合后便可進行細胞傳代。取生長良好的對照組和STZ誘導的糖尿病組血管平滑肌細胞分別接種于96孔板中培養(yǎng)24 h后，分為對照組、對照+白藜蘆醇組、STZ誘導的糖尿病組、STZ+白藜蘆醇組。對照+白藜蘆醇組和STZ+白藜蘆醇組添加50 μmol/L的白藜蘆醇；對照組和STZ誘導的糖尿病組添加等量的無菌水。處理24 h后進行后續(xù)實驗。

1.2.5流式細胞術分析細胞凋亡 收集各組血管平滑肌細胞，用1×Binding buffer將細胞制成1×106個/ml的懸液。用Annexin V-fluorescein isothiocyan-ate(FITC)，碘化丙啶(Propidium iodide，PI)染色15 min后利用流式細胞儀對染色細胞進行檢測。

1.2.6蛋白印跡 首先收集各組血管平滑肌細胞，PBS洗3次后加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液進行總蛋白提取。然后等量的蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳分離并將蛋白轉至PVDF膜。經(jīng)5%的BSA進行封閉后依次孵育相應的一抗和二抗。最后進行顯色，并統(tǒng)計灰度值計算相對表達量。

1.3統(tǒng)計學分析 用SPSS16.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，兩兩比較用獨立的t檢驗。P<0.05認為存在明顯差異。

2 結果

2.1白藜蘆醇在STZ誘導的糖尿病大鼠模型中對血清細胞因子的影響 利用qRT-PCR檢測糖尿病大鼠血清中細胞因子MCP-1、MIF和IL-18的mRNA水平。如圖1A～C所示，與對照組相比，STZ誘導糖尿病組大鼠血清中MCP-1、MIF和IL-18的mRNA水平明顯升高(P<0.05)。對照組與對照+白藜蘆醇組的MCP-1、MIF和IL-18的mRNA水平無明顯差異。與STZ誘導糖尿病組相比，STZ+白藜蘆醇組血清中MCP-1、MIF和IL-18的mRNA水平明顯降低(P<0.05)。上述數(shù)據(jù)表明，白藜蘆醇可抑制STZ誘導的糖尿病大鼠模型中細胞因子MCP-1、MIF和IL-18表達。

2.2白藜蘆醇在STZ誘導的糖尿病大鼠模型中對心肌纖維化的影響 通過HE染色和Masson染色觀察心肌組織纖維化情況，如圖2所示，對照組與對照+白藜蘆醇組藍色膠原纖維很少，排列規(guī)則；STZ誘導糖尿病組大鼠心肌組織藍色膠原纖維含量明顯增多且排列紊亂，STZ+白藜蘆醇組心肌組織藍色膠原纖維減少，排列趨于規(guī)則。上述結果表明，在STZ誘導的糖尿病大鼠模型中，白藜蘆醇具有抗心肌纖維化的作用。

圖1 qRT-PCR檢測血清中細胞因子的mRNA水平Fig.1 mRNA levels of serum cytokines were detected by qRT-PCRNote: *.P<0.05,#.P<0.05.

2.3白藜蘆醇對STZ誘導的糖尿病大鼠模型中主動脈血管平滑肌細胞形態(tài)及數(shù)目的影響 倒置顯微鏡下觀察從主動脈中分離出的血管平滑肌細胞形態(tài)及數(shù)目。如圖3A所示，白藜蘆醇可改善STZ誘導的糖尿病大鼠模型中血管平滑肌細胞形態(tài)的異常。圖3B顯示，STZ誘導糖尿病組大鼠主動脈血管平滑肌細胞數(shù)目明顯少于對照組(P<0.05)，對照組與對照+白藜蘆醇組血管平滑肌細胞數(shù)目無明顯差異。與STZ誘導糖尿病組相比，STZ+白藜蘆醇組大鼠主動脈血管平滑肌細胞數(shù)目明顯增多(P<0.05)。由此可見，白藜蘆醇可改善STZ誘導的糖尿病大鼠主動脈血管平滑肌細胞形態(tài)及數(shù)目的異常。

圖2 HE和Masson染色分析心肌纖維化水平(×100)Fig.2 Myocardial fibrosis was analyzed by hematoxylin-eosin (HE) staining and Masson staining(×100)

圖3 白藜蘆醇對主動脈的血管平滑肌細胞形態(tài)及數(shù)目的影響Fig.3 Effect of resveratrol on cell morphology and number of vascular smooth muscle cells of aortaNote: *.P<0.05,#.P<0.05.

2.4白藜蘆醇對STZ誘導的糖尿病大鼠模型中血管平滑肌細胞凋亡的影響 運用流式細胞術分析STZ誘導的糖尿病大鼠模型中血管平滑肌細胞凋亡情況。圖4A顯示，STZ誘導糖尿病組細胞凋亡數(shù)最多，STZ+白藜蘆醇組次之，對照組與對照+白藜蘆醇組細胞凋亡數(shù)最少。由圖4B可知，STZ誘導糖尿病組細胞凋亡率明顯高于對照組(P<0.05)。對照組與對照+白藜蘆醇組細胞凋亡率無明顯變化。STZ+白藜蘆醇組細胞凋亡率明顯低于STZ誘導糖尿病組(P<0.05)。由此可見，白藜蘆醇可抑制STZ誘導的糖尿病大鼠血管平滑肌細胞凋亡。

2.5白藜蘆醇對STZ誘導的糖尿病大鼠模型中血管平滑肌細胞凋亡標記蛋白表達的影響 為分析白藜蘆醇對血管平滑肌細胞凋亡標記蛋白表達的影響，蛋白印跡檢測Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9、Bax和Bcl-2的表達。圖5A顯示，在STZ誘導糖尿病組Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9、Bax的表達水平高于其他三組，Bcl-2的表達則低于其他三組。統(tǒng)計灰度值計算相對表達量，如圖5B所示，STZ誘導糖尿病組Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9、Bax的相對表達量明顯高于對照組，Bcl-2的表達低于對照組(P<0.05)。對照組與對照+白藜蘆醇組Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9、Bax和Bcl-2的表達無明顯差異。與STZ誘導糖尿病組相比，STZ+白藜蘆醇組Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9、Bax表達明顯降低，Bcl-2的表達明顯升高(P<0.05)。上述結果進一步表明，白藜蘆醇可抑制STZ誘導的糖尿病大鼠模型中血管平滑肌細胞凋亡。

2.6白藜蘆醇對STZ誘導的糖尿病大鼠模型中血管平滑肌細胞PI3K/Akt信號通路相關蛋白表達的影響 通過蛋白印跡分析平滑肌細胞PI3K/AKT信號通路相關蛋白PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT的蛋白水平。圖6A顯示，PI3K和AKT在各組細胞中的蛋白水平無明顯變化，p-PI3K和 p-AKT在STZ誘導糖尿病組中的表達量最低。如圖6B、C所示，STZ誘導糖尿病組中p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比率明顯低于對照組(P<0.05)。對照組與對照+白藜蘆醇組p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比率無明顯差異。與STZ誘導糖尿病組相比，STZ+白藜蘆醇組p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比率明顯升高(P<0.05)。上述結果說明，在STZ誘導的糖尿病大鼠模型中血管平滑肌細胞p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比率下降，白藜蘆醇處理可抑制p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比率的下降，激活PI3K/AKT信號通路。

圖4 白藜蘆醇對血管平滑肌細胞凋亡的影響Fig.4 Effect of resveratrol on apoptosis of vascular smooth muscle cellsNote: *.P<0.05,#.P<0.05.

圖5 白藜蘆醇對血管平滑肌細胞凋亡標記蛋白表達的影響Fig.5 Effect of resveratrol on expression of apoptosis related proteins in vascular smooth muscle cellsNote: *.P<0.05,#.P<0.05.

圖6 白藜蘆醇對血管平滑肌細胞PI3K/Akt信號通路相關蛋白表達的影響Fig.6 Effect of resveratrol on expression of PI3K/Akt related proteins in vascular smooth muscle cellsNote: *.P<0.05,#.P<0.05.

3 討論

糖尿病主要包括1型糖尿病和2型糖尿病，2型糖尿病約占95%。目前同時治療1型糖尿病和2型糖尿病的藥物主要為胰島素類似物和普蘭林肽，針對2型糖尿病的治療藥物主要包括：二甲雙胍、磺酰脲類藥物、氯茴苯酸類藥物、噻唑烷二酮類藥物、胰高血糖素樣肽1、二肽基肽酶4、鈉依賴的葡萄糖轉運蛋白2及溴麥角環(huán)肽等[9,10]。這些藥物大多數(shù)都為化學合成，副作用較大。尋找天然安全的藥物對糖尿病的治療具有重要意義。越來越多的研究表明許多植物提取物在各類疾病的治療中起著積極作用。

在各類疾病的進程中常常伴有各類細胞因子的變化，許多植物提取物可逆轉細胞因子的變化。有研究顯示白藜蘆醇可減弱草酸誘導的人原發(fā)性腎上皮細胞MCP-1 mRMA水平的升高[11]。Zagotta等[12]發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可降低發(fā)炎的脂肪組織中MCP-1 mRMA的水平。據(jù)報道臥莖景天提取物可抑制馬兜鈴酸誘導的腎小管上皮細胞損傷模型中MIF的表達[13]。有文獻報道在脂多糖誘導的急性肺損傷大鼠模型中，白藜蘆醇可抑制IL-18 mRMA水平的升高[14]。Xiao等[15]發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可抑制糖尿病缺血性急性腎損傷大鼠模型中IL-18 mRMA水平的升高。本研究表明，白藜蘆醇可抑制STZ誘導的糖尿病大鼠血清中MCP-1、MIF和IL-18的mRNA水平的升高。

糖尿病患者常會發(fā)生各種并發(fā)癥，心肌纖維化加劇在這個過程中起著重要作用。許多植物提取物可改善心肌纖維化病變。Chen等[16]發(fā)現(xiàn)在缺血再灌注大鼠模型中芪參益氣滴丸可改善心肌纖維化紊亂。有文獻報道參芪化合物可降低糖尿病大鼠心肌纖維化水平[17]。有研究表明山楂果提取物可減輕肥胖癥大鼠心肌纖維化程度[18]。據(jù)報道隱丹參醌可降低1型糖尿病大鼠模型中心肌纖維化程度[19]。Dong等[20]發(fā)現(xiàn)在缺血再灌注損傷大鼠模型中，白藜蘆醇處理可改善心肌纖維紊亂。本研究結果顯示，在STZ誘導的糖尿病大鼠模型中，白藜蘆醇可改善心肌纖維化加劇。

白藜蘆醇還具有調控細胞凋亡的作用。Sui等[21]發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可抑制H2O2誘導的血管內細胞凋亡。有研究表明白藜蘆醇可抑制丙酮醛誘導的肝癌細胞凋亡，減弱Cleaved caspase-3表達的升高[22]。據(jù)報道白藜蘆醇可抑制β淀粉樣蛋白誘導的神經(jīng)細胞凋亡，減弱Bax表達的升高[23]。有數(shù)據(jù)顯示白藜蘆醇可降低高糖誘導的心肌細胞凋亡，減弱Bax的表達，提高Bcl-2表達[24]。本文結果表明，在STZ誘導的糖尿病大鼠模型中，白藜蘆醇可抑制血管平滑肌細胞凋亡及凋亡標記蛋白Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9和Bax表達，增強Bcl-2表達。

PI3K/AKT信號通路在各類疾病中都發(fā)揮著重要作用。大量文獻報道植物提取物可影響PI3K/AKT信號通路的活化。Ren等[25]發(fā)現(xiàn)從桑葉中提取的多糖可通過激活PI3K/AKT信號通路使高脂喂養(yǎng)STZ誘導的2型糖尿病大鼠肝葡萄糖代謝及胰島素轉運正?；?。有研究發(fā)現(xiàn)在高脂喂養(yǎng)STZ誘導的2型糖尿病大鼠中，決明子可提高AKT磷酸化水平，減輕心肌缺血再灌注損傷[26]。Liu等[27]研究表明在糖尿病大鼠模型中柑橘果膠可通過上調p-AKT表達激活PI3K/AKT信號通路起到抗糖尿病的作用。據(jù)報道在早期腦損傷大鼠模型中，白藜蘆醇可提高AKT磷酸化水平，抑制神經(jīng)細胞凋亡[28]。有數(shù)據(jù)顯示白藜蘆醇可通過激活PI3K/AKT信號通路提高高糖誘導的PC12細胞活力，降低細胞凋亡[29]。Wu等[30]發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可通過PI3K/AKT信號通路減輕糖尿病性心肌病變大鼠模型中心肌細胞的纖維化，抑制心肌細胞凋亡。本文結果顯示，白藜蘆醇可提高STZ誘導的糖尿病大鼠模型中血管平滑肌細胞PI3K和Akt的磷酸化水平，激活PI3K/AKT信號通路，抑制血管平滑肌細胞凋亡。

本研究表明，在STZ誘導的糖尿病大鼠模型中，白藜蘆醇可抑制血清中細胞因子MCP-1、MIF和IL-18的mRNA水平的升高；改善心肌纖維化的加劇；減弱血管平滑肌細胞凋亡及凋亡標記蛋白Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9和Bax表達，提高Bcl-2表達；提高血管平滑肌細胞PI3K和AKT的磷酸化水平。綜上所述，白藜蘆醇可通過激活PI3K/AKT信號通路起到抑制糖尿病平滑肌細胞凋亡的作用。下一步計劃研究白藜蘆醇對眼病、腎病及神經(jīng)性疾病等糖尿病并發(fā)癥的影響，為開發(fā)糖尿病新藥提供理論依據(jù)。

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