孟魯司特鈉對ITP模型小鼠T淋巴細(xì)胞亞群及晚期氧化蛋白產(chǎn)物的影響①

邢麗娜 任金海 王 穎 王福旭 溫樹鵬 郭玉潔

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院血液內(nèi)科，石家莊 053600)

特發(fā)性血小板減少性紫癜(Idiopathic thrombocytopenic purpura,ITP)是臨床上常見的出血性疾病，由毛細(xì)血管發(fā)生炎癥反應(yīng)產(chǎn)生病變，屬于自身免疫性疾病[1]。免疫功能紊亂、血小板數(shù)量減少為ITP的主要癥狀，臨床上采用孟魯斯特鈉治療[2,3]。晚期氧化蛋白產(chǎn)物(Advanced oxidation protein products,AOPP) 作為一種具有促炎癥活性的物質(zhì)，能引起巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)TNF-α等促炎性細(xì)胞因子合成、分泌，促發(fā)機(jī)體免疫炎癥反應(yīng)的發(fā)生[4]。目前關(guān)于孟魯斯特鈉對AOPP相關(guān)影響的研究尚未發(fā)現(xiàn)，因此本研究主要通過建立ITP模型小鼠，探討孟魯斯特鈉對機(jī)體免疫的影響與AOPP的影響，以闡明孟魯斯特鈉治療ITP的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 SPF級BALB/c小鼠，體重18～22 g，雄性，購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.1.2試劑 T淋巴細(xì)胞亞群試劑盒與CD3-FITC/CD4-APC/CD8-PE熒光素標(biāo)記的單克隆抗體(北京同生時代生物技術(shù)有限公司)；IL-6、TNF-α試劑盒(上?？道噬锟萍加邢薰?；AOPP試劑盒(北京西美杰科技有限公司)；水為超純水。

1.1.3儀器 酶聯(lián)免疫檢測儀(美國寶特公司)；流式細(xì)胞儀(艾森生物有限公司)；離心機(jī)(湖南湘鑫儀器儀表有限公司)；細(xì)胞分析儀(貝克曼庫爾特公司)。

1.2方法

1.2.1ITP模型的建立[5]于造模第1、3、5、7天腹部注射豚鼠抗BALB/c小鼠血小板血清(APS)，劑量為200 μl/20 g，建立小鼠 ITP 模型。以小鼠外周血小板降低至正常值25% 視為造模成功。

1.2.2動物分組與給藥 將40只雄性BALB/c小鼠隨機(jī)分為4組，分別為對照組、模型組、孟魯司特鈉低劑量組、孟魯司特鈉高劑量組，每組10只。于造模后第8天開始給藥。對照組不作造模處理，灌胃給予等體積生理鹽水；模型組灌胃給予等體積生理鹽水；孟魯司特鈉低劑量組灌胃給予孟魯司特鈉，劑量為3 mg/kg；孟魯司特鈉高劑量組灌胃給予孟魯司特鈉，劑量為12 mg/kg。給藥劑量按成人臨床用量按表面積比等效量計(jì)算，給藥體積為20 ml/kg體重，于每日按時給藥1次，連續(xù)給藥14 d。

1.2.3胸腺、脾臟指數(shù)的測定 各組小鼠于給藥后第15天稱重后，眼眶取血后，處死小鼠，剖開胸腔及腹部，取出胸腺、脾臟，用生理鹽水清洗后，濾紙吸去水分，稱重，分別計(jì)算各組小鼠的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)，公式如下：胸腺指數(shù)=胸腺濕重(mg)/小鼠體重(g)；脾臟指數(shù)=脾臟濕重(mg)/小鼠體重(g)。

1.2.4外周血小板計(jì)數(shù) 分別于造模后第8天，給藥后第15天通過尾靜脈取小鼠外周血，采用細(xì)胞分析儀進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)。

1.2.5外周血T淋巴細(xì)胞亞群的測定 各組小鼠眼眶取血約0.5 ml，加入肝素100 μl抗凝血，加入PBS緩沖液適量，1 500 r/min離心10 min 后，取上層血漿，然后2 500 r/min離心10 min，沉淀分離細(xì)胞，加入PBS緩沖液 0.1 ml制備單細(xì)胞懸液，分別加入CD3-FITC、CD4-APC、CD8-PE 2.5 μl于同一上樣管，同時設(shè)立不加任何抗體的對照組，放置10 min后，加入5 ml紅細(xì)胞溶解液，放置15 min，于2 500 r/min離心20 min，去上清液，加入PBS緩沖液，洗滌細(xì)胞2次，固定，采用流式細(xì)胞儀檢測CD3+、CD4+、CD8+水平。

1.2.6血清IL-6、TNF-α、AOPP的測定 各組小鼠眼眶取血約0.5 ml，靜置15 min，于離心機(jī)2 500 r/min下離心15 min后，分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測IL-6、TNF-α、AOPP水平。于96孔板中，分別加入標(biāo)準(zhǔn)品、樣品稀釋液和待測樣品100 μl，于37℃下放置60 min，洗滌，加入抗小鼠IL-6、TNF-α、AOPP抗體100 μl，37℃ 放置60 min，洗滌，加HRP標(biāo)記的親和素100 μl，于37℃放置30 min，洗滌，加底物工作液(TMB) 100 μl，37℃避光放置15 min，加終止液100 μl。置于酶標(biāo)儀在450 nm 波長下測定吸光度(OD值)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中小鼠IL-6、TNF-α、AOPP含量。

2 結(jié)果

2.1孟魯司特鈉對血小板計(jì)數(shù)的影響 造模后第8天，與對照組小鼠比較，各組小鼠的血小板計(jì)數(shù)均顯著下降(P<0.05)；同一組小鼠給藥后第15天與造模第8天比較，孟魯司特鈉低、高劑量組小鼠的血小板計(jì)數(shù)顯著升高(P<0.05)，且高劑量組小鼠血小板升高程度更明顯；給藥第15天后，與模型組比較，孟魯司特鈉低、高劑量組小鼠血小板計(jì)數(shù)顯著升高，結(jié)果見表1。

2.2孟魯司特鈉對胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)的影響 與對照組比較，模型組小鼠的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，孟魯司特鈉低、高劑量組小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)顯著降低(P<0.05)，結(jié)果見表2。

GroupsnPLT(×109 L-1)8 d afterestablish model15 d afterestablish modelControl group10109.40±34.05 114.85±40.28 Model group1032.78±5.981)29.45±6.321) Low dosage group1028.32±6.901) 64.26±15.921)2)3)High dosage group1029.99±5.371)95.30±20.552)3)

Note：PLT.Platelet count.Compared to control group，1)P<0.05;compared to model group，2)P<0.05;compared to 8th day after building ITP model，3)P<0.05.

GroupsnCD3+CD4+CD8+CD4+/CD8+Control group1065.64±5.3842.37±5.2722.80±3.871.92±0.22Model group1055.77±4.751)29.86±3.951)31.86±4.861)0.94±0.251)Low dosage group1060.20±7.462)36.22±2.402)25.95±3.042)1.43±0.192)High dosage group1062.84±6.222)39.35±4.172)22.96±4.932)1.71±0.312)

Note：Compared to control group，1)P<0.05;compared to model group，2)P<0.05.

GroupsnIL-6(pg/ml)TNF-α(pg/ml)AOPP(pg/ml)Control group1089.09±13.5785.64±11.0968.93±9.36Model group10136.47±10.741)124.42±13.741) 85.23±12.521)Low dosage group10104.84±16.842)110.20±16.752)73.43±8.392)High dosage group1092.11±15.482)90.53±12.742)65.84±9.822)

Note：Compared to control group，1)P<0.05;compared to model group，2)P<0.05.

GroupsnThymus index(mg/g)Spleen index(mg/g)Control group101.82±0.633.54±0.90Model group103.21±0.931)5.10±1.231)Low dosage group101.99±0.682)3.99±1.172)High dosage group101.77±0.722)3.34±1.042)

Note：Compared to control group，1)P<0.05;compared to model group,2)P<0.05.

2.3孟魯司特鈉對外周血T淋巴細(xì)胞亞群的影響 與對照組比較，模型組小鼠CD3+、CD4+、CD4+/CD8+顯著降低(P<0.05)，CD8+顯著上升(P<0.05)；與模型組比較，孟魯司特鈉低、高劑量組小鼠CD3+、CD4+、CD4+/CD8+顯著上升(P<0.05)，CD8+顯著下降(P<0.05)。結(jié)果見表3。

2.4孟魯司特鈉對血清IL-6、TNF-α、AOPP的影響 與對照組小鼠比較，模型組小鼠IL-6、TNF-α、AOPP水平顯著升高(P<0.05)；與模型組小鼠比較，孟魯司特鈉低、高劑量組小鼠IL-6、TNF-α、AOPP水平顯著降低(P<0.05)。結(jié)果見表4。

3 討論

ITP是一種過敏性免疫疾病，主要表現(xiàn)為血小板的減少。本研究中，注射APS建立小鼠ITP模型8 d后，各組小鼠外周血小板數(shù)量均顯著下降，說明該方法可以成功復(fù)制ITP動物模型。脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)可以準(zhǔn)確反映出機(jī)體的免疫能力，通過測定各組小鼠的臟器指數(shù)，結(jié)果表明ITP機(jī)體免疫功能異常，通過服用孟魯司特鈉可恢復(fù)到正常水平。此外，孟魯司特鈉可升高血小板的數(shù)量。

CD3+是成熟T淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志，CD4+為T輔助淋巴細(xì)胞，在機(jī)體免疫中起輔助作用，CD8+T為T殺傷細(xì)胞，起免疫抑制作用。血小板表面膜蛋白被抗原獲取后，專遞給CD4+T細(xì)胞，并活化B淋巴細(xì)胞，產(chǎn)生血小板抗體，因此，輔助T淋巴細(xì)胞在紫癜治療過程中發(fā)揮重要作用[6,7]。通過檢測T淋巴細(xì)胞亞群和細(xì)胞因子，發(fā)現(xiàn)ITP模型小鼠CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平顯著下降，表明ITP導(dǎo)致輔助T細(xì)胞和抑制T細(xì)胞比例失調(diào)，T淋巴細(xì)胞表達(dá)異常，服用孟魯司特鈉能夠使T淋巴細(xì)胞亞群比例恢復(fù)平衡。采用Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果表明血小板數(shù)與CD3+、CD4+呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。

AOPP是一類尿毒癥毒素，是血清白蛋白被自由基和反應(yīng)性氧系氧化后的產(chǎn)物，能夠激活單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，刺激單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-6。IL-6 作為炎癥介質(zhì)及抗原誘導(dǎo)物，可使促進(jìn)抗體分泌，參與自身免疫疾病的發(fā)生和發(fā)展全過程，活化的單核細(xì)胞是其主要來源[8]。此外，IL-6 能通過促進(jìn)B細(xì)胞的成熟而分泌IgG、IgA、IgE等細(xì)胞因子，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)[9]。AOPP還能刺激腫瘤壞死因子(TNF-α)合成、釋放[10]。TNF-α被激活后，激活中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞，增加其細(xì)胞毒性，釋放更多細(xì)胞因子IL-6和其他細(xì)胞炎性因子，加快炎癥進(jìn)程。結(jié)果表明，模型組小鼠AOPP、IL-6、TNF-α水平均顯著升高，服用孟魯司特鈉后顯著下降，相關(guān)性分析結(jié)果顯示AOPP上升與IL-6、TNF-α水平上升呈現(xiàn)正相關(guān)。

ITP主要通過刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，使T淋巴細(xì)胞亞群失衡，積累OAPP，刺激IL-6、TNF-α等炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生，刺激B細(xì)胞產(chǎn)生抗血小板抗體，損傷血小板。孟魯司特鈉可通過免疫調(diào)控作用,修復(fù)機(jī)體免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)機(jī)體對抗原的清除能力，調(diào)整T淋巴細(xì)胞亞群平衡，減少OAPP積累，抑制血小板抗體分泌，減少血小板損傷破壞。此外，降低血清中IL-6、TNF-α等炎性因子的含量，可以進(jìn)一步降低血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性，治療出血癥。

參考文獻(xiàn)：

[1] 石立鵬,劉明懷,彭方毅,等.特發(fā)性血小板減少性紫癜臨床研究進(jìn)展[J].實(shí)用中醫(yī)藥雜志,2016,32(3):294-295.

Shi LP,Liu MH,Peng FY,etal.Clinical research progress of idiopathic thrombocytopenic purpura[J].J Pract Chin Med,2016,32(3): 294-295.

[2] Talaat RM,Elmaghraby AM,Barakat SS,etal.Alterations in immune cell subsets and their cytokine secretion profile in childhood idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP)[J].Clin Exp Immunol,2014,176(2):291-300.

[3] 李玉霞,王朋朋,謝 鶴,等.孟魯司特鈉治療過敏性紫癜患兒療效觀察[J].深圳中西醫(yī)結(jié)合雜志,2016,26(16):82-84.

Li YX,Wang PP,Xie H,etal.Observation of the curative effect of menustrum sodium in children with allergic purpura[J].J Integ Chin Western Med Shenzhen,2016,26(16): 82-84.

[4] Bochi GV,Torbitz VD,Campos LPD,etal.In vitro,oxidation of collagen promotes the formation of advanced oxidation protein products and the activation of human neutrophils[J].Inflammation,2016,39(2):916-927.

[5] 何 昊,徐 玥,秦 蓓,等.免疫性血小板減少性紫癜動物模型建立方法與應(yīng)用評價[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2016,16(10):1971-1974.

He H,Xu Y,Qin B,etal.Establishment method and application evaluation of immune thrombocytopenic purpura animal model[J].Adv Modern Biomed Sci,2016,16(10):1971-1974.

[6] 張 靜,凌 云,曹祥山,等.特發(fā)性血小板減少性紫癜患者CD3+﹑CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞凋亡率的研究[J].臨床血液學(xué)雜志,2009,22(5):460-462.

Zhang J,Lin Y,Cao XS,etal.Pesearch of CD3+,CD4+and CD8+T lymphocyte apoptosis rate in patients with idiopathic thrombocytopenic purpura[J].J Clin Hematol,2009,22(5):460-462.

[7] Xie J,Cui D,Liu Y,etal.Changes in follicular helper T cells in idiopathic thrombocytopenic purpura patients[J].Int J Biol Sci,2015,11(2):220-229.

[8] 張 爽,鄭 冬,馬月輝.IL-6在代謝類疾病及癌癥中的功能研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)進(jìn)展,2015,5(5):347-350.

Zhang S,Zheng D,Ma YH.Research progress in the function of il-6 in metabolic diseases and cancer[J].Biotechnol Progress,2015,5(5):347-350.

[9] Savin VJ,Sharma M,Zhou J,etal.Renal and hematological effects of CLCF-1,a B-cell-stimulating cytokine of the IL-6 family[J].J Immunol Res,2015,2015:714964.

[10] 孫 巖,吳雄飛,金錫御.新的尿毒癥毒素結(jié)合蛋白-晚期氧化蛋白產(chǎn)物結(jié)合蛋白分離成功[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2005,27(22): 2-3.

Sun Y,Wu XF,Jin XY.Successful isolation of new uremia toxin binding protein-late oxidative protein binding protein[J].Third Military Med Univ,2005,27(22): 2-3.