膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎炎癥條件下誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與B細(xì)胞的相互作用①

孔 寧 孫 娟 楊懿銘 鄒和建 楊 潔 萬(wàn)偉國(guó)

(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院風(fēng)濕科，上海 200040)

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種可以導(dǎo)致關(guān)節(jié)毀損、多臟器損害的系統(tǒng)性疾病，也是導(dǎo)致勞動(dòng)力喪失的主要免疫性關(guān)節(jié)炎之一；T細(xì)胞和B細(xì)胞均參與了疾病的發(fā)生和發(fā)展[1,2]。B細(xì)胞，作為主要的免疫細(xì)胞之一，除了體液免疫，還在細(xì)胞免疫中發(fā)揮著重要作用。首先，B細(xì)胞可以作為抗原提呈細(xì)胞激活效應(yīng)性T細(xì)胞分泌炎癥因子，并且是效應(yīng)性T細(xì)胞激活增殖的必需條件之一。取自μMT-/-NOD小鼠(缺乏B細(xì)胞的NOD小鼠模型)的T細(xì)胞與NOD小鼠(1型糖尿病的小鼠模型)的T細(xì)胞相比，喪失了對(duì)其自身抗原肽(GAD65)刺激的反應(yīng)能力，不會(huì)進(jìn)展為1型糖尿病[3]，去除B細(xì)胞后，即便有其他抗原提呈細(xì)胞的輔助，T細(xì)胞的增殖能力仍明顯減弱[4]。其次，B細(xì)胞是自身反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞激活的必需條件[5]。已知，RA經(jīng)典的動(dòng)物模型—膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(Collagen-induced arthritis，CIA)的重要發(fā)病機(jī)制之一是淋巴細(xì)胞對(duì)自身抗原Ⅱ型膠原(Collagen Ⅱ，C Ⅱ)的免疫耐受異常，產(chǎn)生了針對(duì)CⅡ的特異性應(yīng)答，抗原特異性的自身反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞被激活，在不同細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下，分化成不同的效應(yīng)性T細(xì)胞，包括Th17細(xì)胞、Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞等，并進(jìn)一步分泌多種炎癥因子，進(jìn)而導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展。尚有研究發(fā)現(xiàn)CD4+T細(xì)胞激活對(duì)B細(xì)胞的依賴(lài)僅表現(xiàn)在自身免疫性應(yīng)答中[6,7]。再者，自身反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞尤其對(duì)表達(dá)共刺激分子(CD80、CD86)和MHC Ⅱ類(lèi)分子的B細(xì)胞的刺激產(chǎn)生應(yīng)答[8-10]。B細(xì)胞被激活后細(xì)胞表面共刺激分子(CD80、CD86)和MHC Ⅱ 類(lèi)分子的表達(dá)會(huì)增加[11]，轉(zhuǎn)而發(fā)揮作為專(zhuān)業(yè)抗原提呈細(xì)胞的功能。

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Tregs)作為發(fā)揮免疫抑制作用的T細(xì)胞亞群，對(duì)維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)發(fā)揮著重要作用，其數(shù)量和/或功能的異常可導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生[12]，包括RA和CIA[13-18]。既往的研究已發(fā)現(xiàn)體外誘導(dǎo)的Tregs(induced T regulatory cells，iTregs)有著與體內(nèi)天然的Tregs(natural T regulatory cells，nTregs)相似的表型和抑制功能，對(duì)CIA小鼠起到預(yù)防和早期治療的作用[19,20]；并且在已發(fā)病的關(guān)節(jié)炎小鼠體內(nèi)，foxp3+細(xì)胞發(fā)生了明顯的擴(kuò)增[19]，但擴(kuò)增的機(jī)制尚不明確。有關(guān)Tregs免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，炎癥環(huán)境下的BAFF轉(zhuǎn)基因小鼠(BAFF，B cell activating factor belonging to TNF family，促進(jìn)B細(xì)胞的成熟，維持B細(xì)胞的存活)體內(nèi)，foxp3+Tregs擴(kuò)增明顯增多；而在B細(xì)胞缺乏的小鼠中，擴(kuò)增現(xiàn)象消失[21]；由此可見(jiàn)，炎癥環(huán)境下體內(nèi)Tregs的擴(kuò)增依賴(lài)于B細(xì)胞。本研究擬探討在CIA小鼠的炎癥環(huán)境下，iTregs與B細(xì)胞間的相互作用，進(jìn)一步理解iTregs對(duì)CIA小鼠的預(yù)防和早期治療作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡雄性DBA1/J小鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)在室溫，相對(duì)濕度(55±10)%，照明/黑暗為12 h/12 h環(huán)境中，自由攝食及飲水。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑 牛Ⅱ型膠原(CⅡ,Chondrex,Redmond,WA,USA)；完全弗氏佐劑(CFA,Difco,Detroit,MI,USA)；不完全弗氏佐劑(IFA,Difco)；CD4+T細(xì)胞分選試劑盒(Miltenyi Biotec Technology & Trading,Shanghai,China)；抗CD25-PE單克隆抗體(BD Biosciences,San Jose,CA,USA)；抗PE的磁珠(Miltenyi)；抗CD62L-PE單克隆抗體、抗CD19-PE單克隆抗體(BD)；10%胎牛血清(Invitrogen,Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USA)；IL-2(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)、TGF-β(R&D Systems)和CD3/CD28單抗偶聯(lián)磁珠(Miltenyi)；CD4-FITC、CD25-PE(BD)和foxp3-APC(eBioscience,San Diego,CA,USA)；CD80-FITC、CD86-FITC、MHCⅡ-FITC和CD19-APC(BD)；羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯(Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester,CFSE，CellTraceTMCFSE Cell Proliferation Kit,Invitrogen,Germany)；CTLA-4-PE(CTLA-4，Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，細(xì)胞T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4，BD)。

1.2方法

1.2.1CIA模型的誘導(dǎo) 牛Ⅱ型膠原(CⅡ)和完全弗氏佐劑按照1∶1 的體積比充分乳化，50 μl乳化液在小鼠尾根部皮下注射；初次免疫后第21天，CⅡ和不完全弗氏佐劑按照1∶1的體積比充分乳化，50 μl乳化液在小鼠尾根部皮下注射，完成CIA模型的誘導(dǎo)。在二次免疫后，隔天，按既定評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[17]進(jìn)行評(píng)分和記錄。

1.2.2細(xì)胞制備 CD4+CD62L+CD25-T細(xì)胞的制備：無(wú)菌分離DBA1/J小鼠的脾臟，研磨得單個(gè)細(xì)胞懸液，裂解紅細(xì)胞，采用CD4+T細(xì)胞分選試劑盒分選得CD4+T細(xì)胞；分選所得的CD4+T細(xì)胞與抗CD25-PE單克隆抗體孵育后，加入抗PE的磁珠，分選出CD4+CD25-T細(xì)胞。CD4+CD25-T細(xì)胞先后加入抗CD62L-PE單克隆抗體、抗PE的磁珠再次孵育后，分選得到CD4+CD62L+CD25-T細(xì)胞。

CIA B細(xì)胞(CIA-B)和正常B細(xì)胞(N-B)的制備：分別無(wú)菌分離DBA1/J小鼠或初次免疫后第35天已有關(guān)節(jié)炎發(fā)作的CIA小鼠的脾臟，研磨得單細(xì)胞懸液，裂解紅細(xì)胞，加入抗CD19-PE單克隆抗體，然后與抗PE的磁珠共孵育后分選出CD19+細(xì)胞。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng) 經(jīng)典iTregs的生成：分離自正常DBA1/J小鼠脾臟的CD4+CD62L+CD25-T細(xì)胞，采用RPMI1640、10%胎牛血清、40 U/ml IL-2、2 ng/ml TGF-β和CD3/CD28單抗偶聯(lián)磁珠(細(xì)胞∶磁珠=4∶1)培養(yǎng)4 d。體外，不同B細(xì)胞誘導(dǎo)Tregs的生成：CD4+CD62L+CD25-T細(xì)胞分別與N-B和CIA-B以 1∶1 細(xì)胞比例在100 U/ml IL-2和5 ng/ml TGF-β條件下共培養(yǎng)3 d；收集細(xì)胞，標(biāo)記CD4-FITC、CD25-PE和foxp3-APC，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+CD25+foxp3+細(xì)胞的百分比。經(jīng)典iTregs與CIA-B細(xì)胞共培養(yǎng)：經(jīng)典iTregs與CIA-B以1∶1比例共培養(yǎng)，同時(shí)加入IL-2(100 ng/ml) 和CⅡ(200 ng/ml) 共培養(yǎng) 3 d，3 d后收集培養(yǎng)的細(xì)胞，分別標(biāo)記CD80-FITC、CD86-FITC、MHCⅡ-FITC和CD19-APC，流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)CD80+CD19+、CD86+CD19+、MHCⅡ+CD19+細(xì)胞的百分比。

1.2.4細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 經(jīng)典iTregs與CIA-B細(xì)胞共培養(yǎng)：iTregs標(biāo)記CFSE，與CIA-B細(xì)胞以1∶1比例共培養(yǎng)；同時(shí)加入IL-2(100 ng/ml) 和CⅡ(200 ng/ml)共培養(yǎng)3 d，3 d后收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CFSE+細(xì)胞的百分比。

1.2.5Transwell實(shí)驗(yàn) 經(jīng)典iTregs與CIA-B以1∶1比例共培養(yǎng)，iTregs置于下層，CIA-B細(xì)胞置于上層；同時(shí)加入IL-2(100 ng/ml)和CⅡ(200 ng/ml) 共培養(yǎng)3 d，3 d后收集培養(yǎng)的細(xì)胞。①標(biāo)記抗CTLA-4-PE，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CTLA-4+細(xì)胞的百分比；②分別標(biāo)記CD80-FITC、CD86-FITC、MHCⅡ-FITC和CD19-APC，流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)CD80+CD19+、CD86+CD19+、MHCⅡ+CD19+細(xì)胞的百分比。

1.2.6抗體染色和流式細(xì)胞儀檢測(cè)

1.2.6.1約1×106的培養(yǎng)細(xì)胞加入抗CD4-FITC和CD25-PE單抗孵育0.5 h后，1×PBS清洗，固定并破膜，加入抗foxp3-APC單抗孵育，1×PBS清洗后上機(jī)檢測(cè)。

1.2.6.2約1×106的培養(yǎng)細(xì)胞分別加入抗CTLA-4-PE單抗孵育半小時(shí)，1×PBS清洗后上機(jī)檢測(cè)；加入抗CD80-FITC和CD19-APC、抗CD86-FITC和CD19-APC、抗MHCⅡ-FITC和CD19-APC抗體，1×PBS清洗后上機(jī)檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1CIA B細(xì)胞(CIA-B)較正常B細(xì)胞(N-B)誘導(dǎo)更多Tregs的生成 已知CIA-B共刺激分子表達(dá)上調(diào)而具有更強(qiáng)的抗原提呈能力，并且在已發(fā)病的CIA關(guān)節(jié)炎小鼠體內(nèi)foxp3+細(xì)胞可以進(jìn)一步擴(kuò)增，由此本研究設(shè)立下述實(shí)驗(yàn)觀察CIA-B對(duì)foxp3+細(xì)胞(Tregs)的誘導(dǎo)作用。將CD4+CD62L+CD25-細(xì)胞分別以CIA-B或N-B作為抗原提呈細(xì)胞，加以IL-2和/或TGF-β共培養(yǎng)3 d，收集培養(yǎng)的細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD25+foxp3+細(xì)胞的表達(dá)。如圖1所示，CIA-B較N-B誘導(dǎo)更多的CD25+foxp3+細(xì)胞的生成[(54.497±1.830)% vs(45.783±0.484)%，P=0.010]。

2.2CIA-B促進(jìn)iTregs的增殖并上調(diào)iTregs細(xì)胞表面CTLA-4的表達(dá) 觀察CIA-B作為抗原提呈細(xì)胞是否可以直接作用于iTregs。將iTregs標(biāo)記CFSE后與CIA-B按細(xì)胞數(shù)1∶1 的比例共培養(yǎng)3 d，實(shí)驗(yàn)分為iTregs組和iTregs+CIA-B組，3 d后收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)iTregs-CFSE的表達(dá)即iTregs的增殖；結(jié)果顯示與CIA-B共培養(yǎng)后，iTregs的增殖明顯增加[見(jiàn)圖2A，(47.920±2.049)% vs(23.960±0.493)%，P<0.000 1]。另一組實(shí)驗(yàn)，將iTregs與CIA-B按細(xì)胞數(shù)1∶1的比例共培養(yǎng)3 d，實(shí)驗(yàn)分為iTregs+CIA-B組和iTregs+CIA-B Transwell組(iTregs+CIA-B T)，3 d后收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CTLA-4的表達(dá)；結(jié)果顯示與CIA-B共培養(yǎng)后，iTregs細(xì)胞表面CTLA-4的表達(dá)上調(diào)，并且該作用通過(guò)iTreg與CIA-B細(xì)胞間的直接接觸而實(shí)現(xiàn)[見(jiàn)圖2B，(76.147±4.338)% vs(5.910±0.565)%，P<0.000 1]。

圖1 CIA-B較N-B誘導(dǎo)更多Tregs的生成Fig.1 CIA-B induced more Tregs production than N-B

圖2 CIA-B促進(jìn)iTregs的增殖并上調(diào)iTregs細(xì)胞表面CTLA-4的表達(dá)Fig.2 CIA-B promoted iTregs proliferation and CTLA-4expression

圖3 iTregs通過(guò)細(xì)胞直接接觸促進(jìn)CIA-B細(xì)胞表面共刺激分子和MHCⅡ類(lèi)分子的表達(dá)Fig.3 iTregs increased the expressions of co-stimulators(CD80,CD86) and MHCⅡ on CIA-B through a cell-contact pathway

表1iTregs通過(guò)細(xì)胞直接接觸促進(jìn)CIA-B細(xì)胞表面共刺激分子和MHCⅡ類(lèi)分子的表達(dá)

Tab.1iTregsincreasedtheexpressionsofco-stimulators(CD80,CD86)andMHCⅡonCIA-Bthroughacell-contactpathway

ItemCIA-BiTregs+CIA-BiTregs+CIA-B TCD8029.235±1.386504.645±90.7771)2)77.818±2.261CD8655.443±4.018950.743±97.1023)4)75.900±0.841MHCⅡ641.930±24.3475170.890±309.5905)6)690.165±42.712

Note：1)CIA-B vs iTregs+CIA-B，P=0.001 9；2)iTregs+CIA-B vs iTregs+CIA-B T，P=0.003 3；3)CIA-B vs iTregs+CIA-B，P<0.000 1；4)iTregs+CIA-B vs iTregs+CIA-B T，P=0.001；5)CIA-B vs iTregs+CIA-B，P<0.000 1；iTregs+CIA-B vs iTregs+CIA-B T，P<0.000 1.

2.3iTregs促進(jìn)CIA-B細(xì)胞表面共刺激分子(CD80，CD86)和MHCⅡ類(lèi)分子的表達(dá) 將iTregs與CIA-B細(xì)胞按照1∶1 的細(xì)胞比例共培養(yǎng)3 d，實(shí)驗(yàn)設(shè)為CIA-B組、iTregs+CIA-B組和iTregs+CIA-B Transwell實(shí)驗(yàn)組(iTregs+CIA-B T)；3 d后，收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)CD80+CD19+、CD86+CD19+、MHCⅡ+CD19+細(xì)胞的表達(dá)情況。結(jié)果如圖3和表1所示，研究發(fā)現(xiàn)與iTregs共培養(yǎng)后，CIA-B細(xì)胞表面共刺激分子(CD80，CD86)和MHCⅡ類(lèi)分子的表達(dá)都顯著升高；在進(jìn)行Transwell實(shí)驗(yàn)將iTregs與CIA-B細(xì)胞隔離開(kāi)共培養(yǎng)后，三者的表達(dá)都顯著回落甚至是接近共培養(yǎng)前的水平。

3 討論

已知，B細(xì)胞通過(guò)B細(xì)胞表面抗原受體和表達(dá)于T細(xì)胞表面的一些分子配體相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)兩者間的相互作用[22]，從而調(diào)控效應(yīng)性T細(xì)胞的激活、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的生成及抑制性免疫應(yīng)答[23]。在這種相互作用中，B細(xì)胞被激活而表達(dá)更多的共刺激分子，或分化成漿細(xì)胞；同時(shí)表達(dá)更多共刺激分子的B細(xì)胞可以作為抗原提呈細(xì)胞通過(guò)提呈特異性抗原而激活自身反應(yīng)性T細(xì)胞[24]。任何對(duì)B細(xì)胞和T細(xì)胞相互作用的影響都可能誘發(fā)自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展[22]。

既往研究發(fā)現(xiàn)，在將iTregs注射入已發(fā)病的CIA小鼠后，iTregs在體內(nèi)明顯擴(kuò)增，但具體機(jī)制不詳[19]；結(jié)合已有的BAFF轉(zhuǎn)基因小鼠研究結(jié)果[21]，推測(cè)在CIA已發(fā)病的關(guān)節(jié)炎小鼠的炎癥環(huán)境下，iTregs的擴(kuò)增也有賴(lài)于B細(xì)胞。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，已發(fā)病的CIA小鼠的B細(xì)胞較正常DBA1/J小鼠的B細(xì)胞誘導(dǎo)更多Tregs細(xì)胞(foxp3+細(xì)胞)的生成。不僅如此，CIA小鼠的B細(xì)胞還可以促進(jìn)iTregs本身的增殖，并通過(guò)細(xì)胞直接接觸的方式上調(diào)iTregs細(xì)胞表面CTLA-4的表達(dá)。

既然B細(xì)胞與T細(xì)胞存在著明確的相互作用，研究隨后觀察了iTregs對(duì)B細(xì)胞的可能作用方式。結(jié)果意外地發(fā)現(xiàn)，iTregs顯著上調(diào)了B細(xì)胞表面共刺激分子(CD80、CD86)和MHCⅡ類(lèi)分子的表達(dá)，這三者代表著B(niǎo)細(xì)胞的激活和抗原提呈能力；這個(gè)作用依賴(lài)于細(xì)胞直接接觸而實(shí)現(xiàn)。

iTregs又是如何避免B細(xì)胞持續(xù)過(guò)度地活化呢？已有研究證實(shí)，Tregs可通過(guò)CD28/CD80/86/CTLA-4平衡直接抑制B細(xì)胞的功能[23]。表達(dá)于B細(xì)胞表面的CD80/CD86可以通過(guò)與兩種表達(dá)于T細(xì)胞表面的受體分子結(jié)合而分別發(fā)揮抑制或促進(jìn)T細(xì)胞功能的作用，這兩種受體分子包括CTLA-4和CD28。CTLA-4又稱(chēng)CD152,是下調(diào)免疫應(yīng)答的一種關(guān)鍵蛋白受體，與CD28共享CD80/CD86分子配體，而CTLA-4與CD80/CD86分子結(jié)合后誘導(dǎo)T細(xì)胞無(wú)反應(yīng)性，參與免疫反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)[25-29]。CTLA-4可表達(dá)于人和小鼠的Tregs表面，是Tregs發(fā)揮免疫抑制功能的重要途徑之一[30-32]。iTregs表面的CTLA-4可以結(jié)合CD80/CD86發(fā)揮對(duì)B細(xì)胞甚至是效應(yīng)性T細(xì)胞的抑制作用；而CD80/CD86則可與T細(xì)胞表面的CD28結(jié)合起到促進(jìn)效應(yīng)性T細(xì)胞增殖的作用；已知CTLA-4可以競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合CD80/CD86。由此可見(jiàn)，iTregs可以通過(guò)上調(diào)B細(xì)胞表面CD80、CD86和MHCⅡ類(lèi)分子的表達(dá)，增強(qiáng)其抗原提呈的能力，進(jìn)而促進(jìn)iTregs本身的增殖并誘導(dǎo)更多Tregs的生成；同時(shí)這些B細(xì)胞可以上調(diào)iTregs表面CTLA-4的表達(dá)，通過(guò)CTLA-4與CD80/CD86的結(jié)合直接抑制B細(xì)胞并可直接和或間接抑制效應(yīng)性T細(xì)胞，而利于免疫抑制功能的發(fā)揮并避免B細(xì)胞的過(guò)度激活。

本研究探討了CIA關(guān)節(jié)炎小鼠炎癥環(huán)境下iTregs與B細(xì)胞的相互作用模式，推動(dòng)了iTregs對(duì)關(guān)節(jié)炎小鼠治療作用機(jī)制的研究，將有助于RA細(xì)胞免疫治療的發(fā)展。

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