肥城桃果實(shí)2-Cys Prx基因克隆、生物信息學(xué)分析及原核表達(dá)

張永淋，高 彬，周 杰，朱樹華

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，山東 泰安 271018)

過氧化物酶(Prxs)是一種基于硫醇的家族過氧化物酶，廣泛分布于從古細(xì)菌到哺乳動(dòng)物等生物體中[1]。Prxs蛋白在活性氧(ROS)和NO信號通路相互作用中扮演著重要角色，它們可以利用含硫醇的蛋白質(zhì)(如硫氧還蛋白Trx)來減少細(xì)胞中通過其催化半胱氨酸殘基產(chǎn)生的過氧化氫(H2O2)、過氧亞硝酸鹽和有機(jī)過氧化物[2-3]。在植物中，Prxs基于它們的基因組序列被分成4個(gè)不同的亞類[4]：1-CysPrx、2-CysPrx(A、B)、PrxⅡ(A-F)和PrxQ，其中，2-CysPrx、PrxQ和PrxⅡE定位于葉綠體，1-CysPrx定位在核，PrxⅡA-D定位于細(xì)胞質(zhì)，PrxⅡF定位于線粒體[5-6]。廣義上，Prxs除了具有眾所周知的過氧化物酶功能之外，還參與了細(xì)胞增殖、分化、凋亡，細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和保護(hù)自由基敏感蛋白等生物功能[7]。

在對酵母和人類細(xì)胞的研究中，氧化處理或熱休克導(dǎo)致2-Cys Prx過氧化，且伴隨著構(gòu)象的形成和高分子量復(fù)合物的形成，這種結(jié)構(gòu)修飾與從過氧化物酶到伴侶活性的功能轉(zhuǎn)換有關(guān)[8-9]。2015年，Awad[10]證明了2-Cys Prx能夠參與細(xì)胞中自由水-結(jié)合水循環(huán)，并保護(hù)光合結(jié)構(gòu)免受氧化應(yīng)激損傷。此外，在對馬鈴薯植物的研究中證明2-Cys Prx的過表達(dá)導(dǎo)致對甲基紫精或高溫的耐受性增強(qiáng)[11]。在對擬南芥的研究中，Cerveau[12]報(bào)道了在生理環(huán)境限制下2-Cys Prx過氧化和寡聚化之間沒有明顯的關(guān)系，這表明2-Cys Prx伴侶功能在植物中是非必需的。此外，Dangoor等[13]發(fā)現(xiàn)了2-Cys Prx能氧化組氨酸豐富的硫氧還蛋白，并在晝夜轉(zhuǎn)化期間傳遞調(diào)節(jié)光合電子傳遞鏈的氧化還原信號。此外，植物2-Cys Prx與一些不屬于Trx超家族的蛋白質(zhì)相互作用產(chǎn)生一種碳代謝的酶：果糖-1，6-雙磷酸酶(FBPase)，參與了葉綠素的合成和親環(huán)素蛋白(Cyp20-3)的折疊[14]。以上研究表明，2-Cys Prx在機(jī)體氧化還原信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面發(fā)揮著重要的作用。

目前，人們對2-CysPrx基因在動(dòng)物、人體及其他植物中氧化還原信號調(diào)控機(jī)制工作已經(jīng)做了很多，而在桃果實(shí)中的研究還很少。本試驗(yàn)以肥城桃果實(shí)為材料，通過PCR技術(shù)和RACE-PCR技術(shù)克隆得到桃果實(shí)2-CysPrx基因全長，對其生物信息學(xué)進(jìn)行了分析，并在DH5α中成功表達(dá)出蛋白，以期深入了解桃果實(shí)2-Cys Prx蛋白結(jié)構(gòu)及功能，從而為揭示2-Cys Prx在氧化還原信號調(diào)控途徑提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 材料及處理

本試驗(yàn)以肥城桃(Prunuspersica(L.)Batsch cv.Feicheng)果實(shí)為材料，桃果實(shí)的處理參照J(rèn)ing等[15]的方法，取樣切塊后液氮冷凍，于-80 ℃保存。

大腸桿菌菌種E.coliDH5α、E.coliBL21表達(dá)載體pET-30a質(zhì)粒由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院化學(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存，克隆載體pMD 18-T Vector購自寶生物公司。本試驗(yàn)所需引物(由華大基因科技公司合成)如表1所示。

表1 PCR引物及序列 Tab.1 PCR primers and sequences

注：CCCAT為NdeⅠ酶切位點(diǎn)，GGGGTACC為KpnⅠ酶切位點(diǎn)。

Note：CCCAT isNdeⅠ restriction site，GGGGTACC isKpnⅠ restriction site.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料處理 參考改良CTAB法[16]提取桃果實(shí)總RNA，并使用超微量紫外分光光度計(jì)測定RNA濃度。使用寶生物公司的PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit合成1st-Strand cDNA。

1.2.2 2-CysPrx基因中間片段序列的克隆 從NCBI中檢索其他植物2-Cys Prx蛋白的mRNA序列，用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)兼并引物，以1.2.1得到的cDNA為模板構(gòu)建PCR標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系擴(kuò)增，將反應(yīng)后的產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，將含有中間片段的凝膠切塊使用Gel Extraction Kit(康為世紀(jì))試劑盒回收DNA。將目的片段連接pMD18-T Vector構(gòu)建克隆載體，轉(zhuǎn)染DH5α。經(jīng)菌液PCR檢測篩選出陽性克隆載體，送出測序。

1.2.3 2-CysPrx基因全長的獲取及生物信息學(xué)的分析 根據(jù)測序所得2-CysPrx基因中間片段，設(shè)計(jì)RACE引物GSP1、GSP2。使用TaKaRa的SMART RACE cDNA試劑盒并按照說明書操作分別進(jìn)行3′、5′-RACE，并將RACE產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，切掉電泳后的瓊脂糖凝膠并使用試劑盒回收DNA，按照1.2.2的方法構(gòu)建克隆載體。測序后將得到的5′端序列、3′端序列與中間片段拼接，獲得肥城桃果實(shí)2-CysPrx基因cDNA全長。在NCBI網(wǎng)站檢索不同物種2-Cys Prx氨基酸序列，通過DNAMAN軟件對比并分析同源性，使用MEGA 4.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。分別使用ProtScale和ProtParam在線服務(wù)器分析2-Cys Prx蛋白的親水性及理化性質(zhì)。使用psiPRED對2-Cys Prx蛋白的二維結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬分析。

1.2.4 肥城桃果實(shí)2-Cys Prx蛋白的表達(dá) 根據(jù)2-CysPrx基因全長，設(shè)計(jì)含酶切位點(diǎn)的引物2-CysPrx-1和2-CysPrx-2，將獲得的2-CysPrx的基因全長與pMD18-T Vector連接構(gòu)建克隆載體，分別將克隆載體與pET-30a質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶雙酶切，用寶生物T4DNA 連接酶將目的片段連接得到重組質(zhì)粒pET-30a-2-CysPrx，并導(dǎo)入表達(dá)菌株BL21中，經(jīng)PCR擴(kuò)增驗(yàn)證后進(jìn)行蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。取150 μL菌液加入到LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫?fù)u菌至λ=600 nm處吸光度值在0.6～0.8，向菌液中加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度為1 mmol/L，37 ℃誘導(dǎo)10 h，取3 mL菌液用于15%的SDS-PAGE檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 桃果實(shí)2-Cys Prx基因全長的獲得

對比不同植物2-CysPrx基因序列，確定保守區(qū)并設(shè)計(jì)引物，以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1-A，中間片段長度450 bp左右，與預(yù)期長度相符。將該片段切膠回收并克隆送至基因公司測序，根據(jù)目的片段設(shè)計(jì)RACE引物，RACE結(jié)果如圖1-B、C所示，5′-RACE與3′-RACE均得到與預(yù)期相符合的目的條帶，將相應(yīng)基因拼接得到2-CysPrx基因全長，共1 424 bp。

A.2-Cys Prx基因中間片段的獲得：1.DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，2.PCR產(chǎn)物；B.5′ RACE-PCR：1.DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，2～3.5′ RACE-PCR產(chǎn)物；C.3′ RACE-PCR：1.DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，2.3′ RACE-PCR產(chǎn)物。A. Middle sequences of 2-Cys Prx gene：1. DL2000 Marker，2. Product of PCR；B.5′ RACE-PCR：1.DL2000 Marker，2-3.5′ RACE-PCR products；C.3′ RACE-PCR：1.DL2000 Marker，2. 3′ RACE-PCR products.

圖2 桃果實(shí)2-Cys Prx基因全長(A)及氨基酸序列(B)Fig.2 Full length sequence of cDNA (A) and amino acid sequence (B) of 2-Cys Prx

2.2 2-Cys Prx基因的生物信息學(xué)分析

對2-CysPrx基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，該序列(圖2-A)含有起始密碼子ATG(173 bp)和終止密碼子TAG(985 bp)，具有完整的開放閱讀框。閱讀框共有813個(gè)堿基，編碼270個(gè)氨基酸(圖2-B)。通過ProtParamtool在線預(yù)測2-Cys Prx蛋白分子式為C1342H2110N348O403S4，分子量29.696 ku，由4 207個(gè)原子組成，理論等電點(diǎn)為6.23，不穩(wěn)定系數(shù)為34.69。經(jīng)ProtScale在線分析得到該蛋白疏水性平均值為-0.126，說明2-Cys Prx為親水性蛋白。采用TMHMM對跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2-Cys Prx氨基酸序列中不存在跨膜結(jié)構(gòu)域，為膜外蛋白(圖3)，采用psiPRED對桃果實(shí)2-Cys Prx二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(圖4)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)β折疊、α螺旋結(jié)構(gòu)和無規(guī)則卷曲交替出現(xiàn)，該蛋白有9個(gè)β折疊結(jié)構(gòu)及4個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)，與植物其他Prx的二級結(jié)構(gòu)無明顯區(qū)別，說明Prx的二級結(jié)構(gòu)在進(jìn)化上高度保守。

2.3 2-Cys Prx蛋白氨基酸序列同源比對和系統(tǒng)進(jìn)化分析

圖3 2-Cys Prx跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.3 The transmembrane helices prediction of 2-Cys Prx

圖4 2-Cys Prx蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測預(yù)測Fig.4 The secondary structure prediction of 2-Cys Prx protein

Pp.肥城桃；Pa.櫻桃；Md.蘋果；Pb.白梨；Fv.野草莓；Jr.核桃；Tc.可可；Co.長果種黃麻；Zj.棗；Mc.苦瓜。Pp. Prunus persica;Pa. Prunus avium；Md. Malus domestica；Pb. Pyrus×bretschneideri；Fv. Fragaria vesca；Jr. Juglans regia；Tc. Theobroma cacao；Co. Corchorus olitorius；Zj. Ziziphus jujuba；Mc. Momordica charantia.

將獲取的桃果實(shí)2-Cys Prx氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast，與其他植物的2-Cys Prx氨基酸序列對比(圖5)，結(jié)果表明，桃(Prunuspersica)果實(shí)2-Cys Prx與其他植物2-Cys Prx氨基酸序列相近，其中與櫻桃(Prunusavium)、蘋果(Malusdomestica)、白梨(Pyrus×bretschneideri)、野草莓(Fragariavesca)、核桃(Juglansregia)、可可(Theobromacacao)、長果種黃麻(Corchorusolitorius)、棗(Ziziphusjujuba)、苦瓜(Momordicacharantia)同源性分別為98.15%，87.08%，86.35%，84.81%，76.19%，75.56%，74.54%，79.14%，74.45%，表明植物的2-Cys Prx蛋白具有較高的保守性。系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果表明(圖6)，肥城桃果實(shí)2-Cys Prx與櫻桃2-Cys Prx親緣關(guān)系最近。

分支上的數(shù)值表示1 000次重復(fù)計(jì)算得到的Bootstrap值。The values on the branches represent the Bootstrap values obtained by the 1 000 iteration.

2.4 2-Cys Prx蛋白表達(dá)

將重組質(zhì)粒pET-30a-2-CysPrx導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)中，加IPTG至終濃度為1 mmol/L，誘導(dǎo)2-Cys Prx重組蛋白表達(dá)，得到重組蛋白。電泳結(jié)果如圖7所示，2-Cys Prx重組蛋白表達(dá)成功，蛋白分子量大小為29.7 ku。

1.低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)；2.含pET-30a-2-CysPrx質(zhì)粒經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的蛋白粗提物；3.含pET-30a質(zhì)粒未誘導(dǎo)的蛋白粗提物；4.含重組pET-30a-2-CysPrx質(zhì)粒未誘導(dǎo)的蛋白粗提物。

1. Standard protein molecular mass Markers；2. Protein extracts containing pET-30a-2-CysPrxplasmid with IPTG induction; 3. Protein extracts containing pET-30a plasmid without IPTG induction; 4. Protein extracts containing pET-30a-2-CysPrxplasmid without IPTG induction.

圖72-CysPrx重組蛋白15%聚丙烯酰胺凝膠電泳
Fig.7Recombinant2-CysPrxproteinin15%SDS-PAGE

3 結(jié)論與討論

本研究采用同源克隆的方法獲得了2-CysPrx基因的中間片段，利用PCR技術(shù)和RACE-PCR技術(shù)獲得了桃果實(shí)2-CysPrx基因序列全長，運(yùn)用Blast技術(shù)對基因庫進(jìn)行檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肥城桃果實(shí)與已公布的碧桃2-CysPrxBAS1基因序列一致，肥城桃果實(shí)2-Cys Prx開放閱讀框長813 bp，共編碼270個(gè)氨基酸。對2-Cys Prx的生物信息學(xué)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，桃果實(shí)2-Cys Prx與櫻桃2-Cys Prx同源性最高。通過TMHMM分析，結(jié)果表明，桃果實(shí)2-Cys Prx不含有信號肽序列和跨膜結(jié)構(gòu)域，屬于膜外蛋白。此外，本試驗(yàn)體外表達(dá)出了蛋白，蛋白分子量大小為29.7 ku。

1988年，人們首次在酵母細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)過氧化物還原酶，后來這一新的、進(jìn)化高度保守的抗氧化蛋白家族被證明廣泛存在于原核生物和真核生物中，并在生物體內(nèi)發(fā)揮著重要的作用[17]。2-Cys Prx廣泛存在于細(xì)胞和組織中，其功能主要以抗氧化為主，2-Cys Prx主要分布于細(xì)胞質(zhì)、線粒體以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，2-Cys Prx分布的廣泛性也體現(xiàn)了其生理功能的重要性，分布于不同部位的2-Cys Prx的功能也存在一定的差異和互補(bǔ)。在植物中，2-Cys Prx A和B具有在氧化時(shí)形成二聚體的能力[18]。在不同溫度、滲透和脅迫條件下，擬南芥質(zhì)體2-Cys Prx可以經(jīng)歷不同的過氧化狀態(tài)和寡聚化狀態(tài)的變化[19]。2-Cys Prxs是通過與硫氧還蛋白和硫氧還蛋白還原酶偶聯(lián)從NADPH接收電子的過氧化物酶[12，20]。在對酵母2-Cys Prx的研究中發(fā)現(xiàn)，Prx通過形成多聚體變成分子伴侶來阻止蛋白的聚集，以此來增加酵母在溫度脅迫條件下的耐受性[21]。最近的研究表明，2-Cys Prxs通過與特定的氧化還原敏感分子相互作用，在各種信號網(wǎng)絡(luò)中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用[6]，本研究為下一步桃果實(shí)2-Cys Prx蛋白的功能研究提供了理論依據(jù)。

Prx蛋白不僅具有抗氧化功能，還在真核生物中參與了H2O2介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，這一轉(zhuǎn)導(dǎo)功能是基于Prx蛋白對H2O2的高度的親和力。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)N末端保守的Cys殘基能與H2O2發(fā)生氧化反應(yīng)，生成Cys-SOH，Cys-SOH相鄰單位上的Cys-SH結(jié)合生成二硫化物，生成的二硫化物能被Trx還原，H2O2則被Prxs還原為H2O，轉(zhuǎn)化為乙醇并被清除細(xì)胞，從而起到為細(xì)胞解毒的作用[22-23]。這表明，在植物體中，Prxs與Trx相互作用參與了氧化還原反應(yīng)及多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，本研究為探討桃果實(shí)2-Cys Prx對維持氧化還原平衡狀態(tài)提供了理論依據(jù)，為進(jìn)一步分析2-CysPrx基因結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位奠定了基礎(chǔ)。

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